Marie Curie de salida de Becas (FP/2007-2013 Unión Europea acuerdos de subvención # 221834 y 254780), JD McDonnell Foundation, NSF Grant SBE 0542013, los Institutos Nacionales de Salud Grant NS034994, Instituto Nacional de Salud Mental Grant MH5467 y el Instituto Médico Howard Hughes (Granja Janelia de Investigación del Campus de subvención).

1. La construcción de la Microdrive Todas las unidades que están hechos de los mismos elementos básicos: una parte móvil, que lleva el electrodo y una parte fija, que está anclada en el cráneo. Un microdrive ideal permite suficiente recorrido suave pero largo del electrodo en múltiples pasos pequeños, es lo suficientemente resistente como para impedir el movimiento accidental del electrodo, fácil de manipular por el experimentador sin interferir con el comportamiento del animal, de tamaño pequeño y ligero de peso. Como resultado de estos requisitos en conflicto, conjunto de unidades de diferente diferentes aplicaciones. Sólo 4 partes son necesarias para construir nuestra unidad básica: un tornillo de latón de cabeza plana, una tuerca de juego, un puente de plástico preparado a partir de un encabezado de fila único punto de conexión y dos cortados a planchas de bronce. <ol><li> Romper una pieza de 3 pines de la cabecera </li><li> Retire con cuidado el pin central. </li><li> Ampliar el agujero de perforación a través de él con un tamaño de broca # 55. </li><li> Cortar una ªleer usando la llave de 00-90. </li><li> Corte dos piezas de la placa de bronce. </li><li> Presente los bordes de las placas con una dremmel. </li><li> Haga un agujero en el medio de ambas piezas con un tamaño de broca # 65. </li><li> Montar las piezas de accionamiento de manera que las placas de latón se toquen las clavijas. Para ello, inserte el tornillo de bronce a través de, sucesivamente, la placa de bronce, el orificio roscado de cabecera, la segunda placa de bronce, y la tuerca. Apretar el tornillo suavemente de modo que el conjunto se vuelve estable. </li><li> Soldar el pin termina a las planchas de bronce. </li><li> Presente el extremo saliente del tornillo. </li><li> Soldadura de la tuerca en el tornillo. Tenga cuidado de no suelde la tuerca a la placa de bronce. </li><li> Pon a prueba el movimiento de la unidad: girar el tornillo de las agujas del reloj para elevar el puente de plástico. </li></ol> 2. Preparación de la sonda de silicio Antes de fijar la sonda a la unidad, agregar aislamiento extra a la zona de unión de la sonda para evitar cerebrospinal líquido cefalorraquídeo (LCR) o la humedad de la producción de cortocircuitos: <ol><li> Pesar y mezclar los componentes de elastómero Sylgard en una proporción de 10:1. </li><li> El uso de un aplicador de algodón afilada, aplicar el Sylgard al extremo superior de la sonda. </li><li> Que se seca en un horno precalentado a 60 ° C durante 2 horas. </li></ol> Para asegurarse de que los sitios de registro están desprovistos de cualquier residuo, las puntas de las sondas se deben limpiar: <ol start="4"><li> Prepare una dilución del 4% de detergente Contrad. </li><li> Que la sonda en remojo en el detergente a 63 ° C durante al menos 2 horas. </li><li> Enjuagar el detergente fuera por inmersión de la sonda repetidamente en agua destilada. </li></ol> Antes de fijar la sonda a la unidad, la impedancia de cada sitio de registro se debe comprobar: <ol start="7"><li> Sumerja la sonda en 0,9%, y conectarlo a una impedancia metros. Si los sitios de grabación demasiados tienen una impedancia incorrecta, repita los pasos 2.4-2.6 o considerar el uso de una sonda diferente.Aquí se utiliza un módulo de acondicionamiento de Impedancia de Federico Haer, Co. (FHC), combinada con un selector de canales de fabricación casera. Alternativamente, un niPOD por NeuroNexus, Inc. o NanoZ por Neuralynx, Inc. permite la monitorización de la impedancia de todos los canales de la sonda de forma simultánea. </li></ol> 3. Colocación de la sonda al microdrive <ol><li> Utilizando una cuchilla de afeitar, cortar ranuras múltiples en el puente para crear una superficie rugosa. </li><li> Aproximar la sonda hasta el puente de la unidad. Este procedimiento se realiza mejor bajo un microscopio quirúrgico, manteniendo la unidad con una pinza y el ajuste de la sonda por un micromanipulador de modo que los vástagos son perfectamente paralelo con el tornillo de accionamiento. Esto asegura que durante el avance, el movimiento de la sonda vástagos en el tejido cerebral sin &#39;cortar&#39; a través de ella. La profundidad exacta de las puntas de las sondas con relación a la base de la unidad se debe determinar en esta etapa, teniendo en cuenta la profundidad de la estructura de destino de la superficie delcráneo. </li><li> La sonda se fija entonces al puente con cemento agarre. </li><li> Opcional: para la visualización de la pista de la sonda en el cerebro, solución Dil (1-2% diluida en etanol) se puede aplicar a la parte posterior de la sonda en esta etapa. </li></ol> 4. Preparación del cráneo Antes de la cirugía, los electrodos de referencia y de tierra, y las partes de la jaula de Faraday en la cabeza se preparan: <ol><li> Cortar dos piezas 2 &quot;-largos de hilo de cobre y estaño un extremo de cada cable de cobre aislado durante aproximadamente 1 mm. </li><li> Usando una aguja, raspar la cabeza de un 00-90, 1/8 &quot;tornillo de acero inoxidable y la soldadura de una pieza de alambre de cobre a la misma. Soldadura de acero inoxidable tales tierra tornillo-electrodos requiere un flujo adecuado (por ejemplo, N-3 Todos propósito flujo de La-Co) y altas temperaturas punta del soldador. cuidadosamente evitar cualquier soldadura fluya en la ranura del tornillo. Esto será utilizado como el electrodo de tierra. Repetir con otro tornillo y el alambre de cobre para prepararel electrodo de referencia. </li><li> Corte los pedazos trapezoidal de malla de cobre. Estas piezas serán ensamblados para proteger el cabezal de la platina. </li></ol> Los instrumentos quirúrgicos y la preparación son los mismos tal como se utiliza en muchas de las cirugías de pequeños animales. Toda la cirugía se realiza bajo anestesia con isoflurano profundo, utilizando las condiciones de asepsia, de acuerdo con las directrices aprobadas por el NIH. Tenga en cuenta que la cirugía (simulacro) se muestra en este video es para fines de demostración. Para los fines pertinentes visibilidad y el rodaje, varias medidas preparatorias, las precauciones y procedimientos quirúrgicos postoperatorios no se muestran / visible o discutido. Antes de la cirugía, todos los componentes y materiales deben ser esterilizados, siguiendo los procedimientos adecuados (véase la Guía de supervivencia para la cirugía de roedores; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf~~HEAD=NNS). Durante la cirugía, un campo estéril en el cráneo está preparado y aislado por paños estériles. Al final de la cirugía, unos antibióticos de amplio espectro es unapplied a nivel local y un analgésico de acción prolongada que se administra por vía intramuscular (por ejemplo, buprenorfina, [Buprenex] 0,05 mg / kg). Además, analgésico (por ejemplo, ibuprofeno) se proporciona en el agua potable a aproximadamente 60 mg/kg/24 horas durante 5 días. Para los procedimientos adecuados de anestésicos y quirúrgicos, consultar la información pertinente 12. <ol start="4"><li> Instale el animal en el aparato estereotáxico, rasura y limpia el cuero cabelludo 13. </li><li> Cortar la piel a lo largo de la línea media y dejar de lado el cuero cabelludo. Retire el periostio, limpiar y secar el cráneo. </li><li> Mida la ubicación y distancia entre bregma y lambda, y determinar las coordenadas x e y de la zona de implantación de la sonda de acuerdo con un atlas estereotáxico 14. Marcar el sitio raspando una cruz en el cráneo con un bisturí. </li><li> Perforar el cráneo usando un poco la cabeza de perforación redonda (tamaño ¼) y los tornillos de la unidad de apoyo (de acero inoxidable, 000-120, 1/16 &quot;) a mitad de camino en el hueso, en las placas óseas diferentes en la parte superior unª en el lado del cráneo. Los tornillos se ofrecen anclajes para fijar la fianza del casco en el cráneo. </li><li> Perforar agujeros por encima del cerebelo e inserte la tierra y electrodos de referencia preparados en el paso 4.2. Para el registro de potenciales de campo locales (LFP), la elección del sitio de referencia es fundamental. Este sitio se eligió porque LFP cerebelosa es la más pequeña de todas las regiones corticales y artefactos musculares son mínimas en este lugar la línea media. </li><li> Aplicar la dentina activador (Metabond kit) utilizando un pequeño cepillo sobre toda la superficie del cráneo. Enjuague con solución salina al 0,9%. </li><li> Aplique el cemento dental (Metabond kit, siga las instrucciones del fabricante para la mezcla) en el cráneo, cubriendo bien los tornillos de anclaje y el suelo y los electrodos de referencia, pero dejando el sitio de implantación de la sonda claro. </li><li> Fije las aletas de cobre cuatro mallas (preparado en el paso 4.3) en el cráneo. Para ello, consolidar la estrecha base de cada una de ellas a las partes anteriores, izquierda, derecha y posterior del cráneo. Thcobre e nunca debe estar en contacto directo con el hueso pero siempre separados por una capa de cemento. </li></ol> 5. Preparación de la superficie del cerebro <ol><li> Usando un poco la cabeza de perforación redonda, perforar alrededor del sitio de implantación en múltiples etapas, mientras que con frecuencia la irrigación del hueso con solución salina. </li><li> Retire con cuidado el colgajo óseo y el riego de la superficie del cerebro. </li><li> Para insertar una sonda de múltiples vástago, una tira de gran duración se elimina. Dos herramientas son necesarias para eliminar la dura: un bisturí y un gancho preparado a partir de una aguja de insectos (como alternativa, un microelectrodo de tungsteno estándar). Doble la punta de la aguja empujando contra una superficie dura (por ejemplo, diapositivas de vidrio para microscopio), y adjuntarlo a un mango (en este caso, un pedazo de madera Q-tip, alternativamente, el titular de microdissecting aguja). </li><li> Levante la duramadre con el gancho, y la cortó con un bisturí. Se tiene especial cuidado para evitar dañar la pia, los vasos y la superficie de la corteza cerebral. Pequeño sangrado puede ser resueltopor la irrigación con solución salina. Si ocurra un sangrado mayor o el neocórtex está comprometida en modo alguno, se debe considerar la terminación de la cirugía y la preparación de otro animal. </li></ol> 6. La implantación de la sonda En esta etapa, la densidad y la orientación de los vasos superficiales corticales son evaluados cuidadosamente. Coordenadas estereotáxicas se debe ajustar, ya que la sonda tiene que penetrar en el cerebro en un área libre de buques de mayor tamaño. Para la implantación, el conjunto de la unidad se hace con una pinza unida a la titular de la estereotáxica. Visibilidad ininterrumpida de la superficie del cerebro y las puntas de la sonda son críticos para la penetración exitosa. <ol><li> Baje lentamente la sonda hasta aproximadamente 1 mm por encima del objetivo previsto, mientras que el riego constante de la craneotomía con solución salina. Para la grabación de la neocorteza, las puntas de las sondas se bajan en la corteza de aproximadamente 0,5 mm y la levantó de nuevo cerca de la superficie. </li&gt; <li> Sellar la craneotomía mediante la aplicación de una mezcla fundida caliente de aceite de parafina y cera a través de una aguja (10-20g de cera en 10 ml de aceite de parafina, se calentó a 65 ° C). Antes de la aplicación, enfriar la mezcla a 30 ° C y probar la densidad. Debe ser lo suficientemente suave para permitir el movimiento de la sonda fácil). Para facilitar la cobertura completa, la mezcla puede ser fundido in situ por acercarse a la cera endurecida con la punta de un cauterizador micro. </li><li> Coloque la parte inferior de la unidad en el cráneo con cemento agarre, teniendo cuidado de dejar la tuerca gire libremente. Es de suma importancia para evitar cualquier accidente &quot;golpe&quot; de la unidad en esta etapa, de lo contrario la sonda puede dañar la corteza. Después de la unidad se fija en el cráneo, el movimiento suave de la sonda debe ser verificado. </li><li> Cemente la parte del conector de la sonda en el cráneo. </li></ol> 7. La construcción de la cabeza en jaula de Faraday <ol><li> Tire hacia arriba y montar las tapas de malla de cobre en un cilindro de protección alrededor de la sonda y el drive. El cilindro también sirve como un blindaje eléctrico contra el ruido ambiental y los artefactos de onda lenta producidos por las patillas cargadas en el animal comportarse. </li><li> Ajustar la altura del cilindro cortando el exceso de material por lo que la malla de cobre está a nivel con la parte superior del conector de la sonda. </li><li> Soldar los cables de la referencia y tornillos de tierra a los pines correspondientes del conector. Además de soldadura aletas adyacentes malla de cobre juntos para asegurar su continuidad eléctrica, y soldar el cable de tierra a la malla de cobre. </li><li> Aplicar una capa de cemento agarre sobre la malla de cobre para reforzarla y para evitar cualquier contacto directo entre el metal y la piel del animal. Si lo desea, aplique una capa de resina epoxi para reforzar aún más el casco. </li><li> Probar el movimiento del tornillo de accionamiento. </li><li> Cubrir la parte superior del casco con un corte pieza de un guante de caucho. </li></ol> 8. Grabación en el animal que se mueve libremente <ol><li> Después de aprocomió cuidados post-operatorios, conecte el animal con el sistema de grabación mediante un cabezal de alta impedancia y un cable ligero y ultraflexible multi-hilo. Contrarrestar el peso del casco. </li><li> Pon a prueba la calidad de la grabación de cada día en el homecage. La posición de los sitios de grabación se juzga por ambos patrones de unidad de disparo y la forma de los potenciales de campo local. Bajar la sonda gradualmente haciendo girar el tornillo en pequeños incrementos (típicamente 1/8 a 1/4 vuelta por día, es decir, 35-70 micrómetros) hasta que la estructura objetivo se alcanza. </li></ol> 9. Los resultados representativos Señales electrofisiológicas (potenciales de campo local y la actividad de la unidad) varían dependiendo de la estructura de grabado y el comportamiento actual de los animales. La figura 1 muestra ejemplos de 32 canales de CA1 del hipocampo de las grabaciones, mientras que la rata está explorando un campo abierto. Nótese la prominente 8 Hz (theta banda) de oscilación del potencial del campo local durante la exploración con apoyoerimposed adición de espigas y sitios (por ejemplo de los picos indicados por puntas de flecha). Para analizar la actividad de la unidad neuronal, los picos se detectan y se clasifican en unidades individuales mediante el análisis conjunto de sus formas de onda 15-16. <img src="/files/ftp_upload/3568/3568fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. CA1 del hipocampo en las grabaciones de la rata comportarse con una 4 x 8 vástagos de los sitios de la sonda de silicio. Las grabaciones son de banda ancha y la muestra a 20 000 Hz, lo que permite estudiar tanto las oscilaciones de campo locales potenciales (por ejemplo, &quot;zeta&quot; banda de 8 ritmo Hz) y un rápido aumento de la actividad neuronal. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3568/3568table1_lg.jpg"><img src="/files/ftp_upload/3568/3568table1.jpg" alt="Tabla 1" /></a> Tabla 1. Las alternativas a los reactivos y el equipo utilizados.

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No hay conflictos de interés declarado.

Esta película muestra el proceso de implantación de las sondas de silicio para la crónica a gran escala las grabaciones en la rata se comporta. Los pasos críticos para garantizar la calidad de grabación de la actividad neuronal se derivan de la fragilidad de tanto biológicas (tejido cerebral) y material técnico de silicio (la sonda). Especial cuidado se debe tomar durante la manipulación de la sonda para evitar cualquier contacto de rejones con cualquier remota &quot;duro&quot; de la superficie (por ejemplo, los...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Silicio sonda Buzsaki32, 4 x 8 vástagos sitios. Embalaje: cable flexible de poliamida </td><td> Material </td><td> NeuroNexus </td><td> Sonda: buzsaki32 Embalaje: HC32 </td><td> La grabación de la sonda </td></tr><tr><td> Tornillo de latón Ronda, 00-90 x 1/2 tornillos de bronce de la Ronda </td><td> Material </td><td> JIMorris </td><td> R0090B500 </td><td> Drive parte </td></tr><tr><td> Latón Tuerca hexagonal, 00-90 </td><td> Material </td><td> JIMorris </td><td> N0090B </td><td> Drive parte </td></tr><tr><td> Latón C260 Franja, ASTM-B36 Espesor: 0.025 &quot;, Longitud: 12&quot;, Ancho: 1/2 &quot; </td><td> Material </td><td> Piezas pequeñas </td><td> B000FMYU72 </td><td> Drive parte </td></tr><tr><td> Conector de Cabecera, paso de 2 mm, male, de una hilera, straigt, 36 posiciones </td><td> Material </td><td> Digikey </td><td> 2163S-36-ND </td><td> Drive parte </td></tr><tr><td> 2-parte Sylgard elastómero de silicona </td><td> Material </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td><td> Para aislar el extra-sonda </td></tr><tr><td> Decon Contrad 70 Detergente Líquido </td><td> Reactivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 04-355 Decon Laboratories N °: 1002 </td><td> Para limpiar los sitios de registro </td></tr><tr><td> Módulo Acondicionador de impedancia </td><td> Equipo </td><td> FHC Inc. </td><td> 55-70-0 </td><td> Impedancia de metro </td></tr><tr><td> niPOD - 32 canales </td><td> Equipo </td><td> NeuroNexus </td><td> niPOD -32 </td><td> Impedancia de metro </td></tr><tr><td> El cemento de agarre de grado industrial </td><td> Material </td><td> Dentsply Caulk </td><td> 675 571 (en polvo) 675 572 (disolvente) </td><td> Grip ceción </td></tr><tr><td> 1,1 &#39;-dioctadecil-3, 3,3&#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perclorato (&#39;Dil&#39;; DiIC18 (3)) </td><td> Reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> Para teñir la pista de la sonda en el cerebro </td></tr><tr><td> Tornillo de acero inoxidable de la máquina, Jefe unión, de unidad con ranuras, # 00-90, 1/8 &quot; </td><td> Material </td><td> Piezas pequeñas </td><td> MX-0090-02B </td><td> Tierra y los tornillos de referencia </td></tr><tr><td> Alambre magneto, 20G, nylon-poliuretano de revestimiento, MW80 </td><td> Material </td><td> Piezas pequeñas </td><td> B000IJYRP2 </td><td> Tierra y el cable de referencia </td></tr><tr><td> Tornillo de acero inoxidable de la máquina, jefe de enlace ranurado Drive, # 000-120, 1/16 &quot; </td><td> Material </td><td> Piezas pequeñas </td><td> MX-000120-01B </td><td> Tornillos de anclaje </td></tr><tr><td> N-3 Todos los líquidos del flujo objetivo </td><td> Reactivo </td><td> La-Co (Markal) </td><td> 23512 </td><td> Permite la soldadura de acero inoxidable </td></tr><tr><td> MicroGrid precisión Ampliado de cobre </td><td> Material </td><td> Dexmet </td><td> 3 CU6 FA-050 </td><td> El cobre de malla para Faraday en la cabeza la jaula </td></tr><tr><td> C &amp; B-Metabond ¡Rápido! Sistema de cemento - dentina Activador </td><td> Material </td><td> Parkell </td><td> S380 </td><td></td></tr><tr><td> C &amp; B-Metabond ¡Rápido! Sistema de Cemento - cemento dental </td><td> Material </td><td> Parkell </td><td> S380 </td><td></td></tr><tr><td> Punta afilada aguja de tungsteno y el titular de la </td><td> Herramienta </td><td> Roboz instrumentos quirúrgicos </td><td> RS-6064 y RS-6061- </td><td> Para hacer que el gancho para levantar la duramadre </td></tr><tr><td> Fresa de carburo de HP 1/4 </td><td> Herramienta </td><td> Henry Schein </td><td> 9990013 </td><td></td></tr><tr><td> Parafina (Gránulos) </td><td> Material </td><td> Fisher Scientific </td><td> P31-500 </td><td></td></tr><tr><td> Aceite mineral, la luz (NF / FCC) </td><td> Material </td><td> Fisher Scientific </td><td> O121-1 </td><td></td></tr><tr><td> GC ELECTRONICS 10-114-2 Parte adhesivo epoxi </td><td> Material </td><td> Newark </td><td> 00Z416 </td><td></td></tr><tr><td> Tipo 1 LITZ 21 AWG 40/36 Red única de poliuretano-nylon (MW80-C) a 0,041 &quot;+ / -0.002&quot; de diámetro exterior </td><td> Material </td><td> Nueva Inglaterra alambre Technologies Corporation </td><td> N28-36E-400-2 </td><td> Para hacer que el cable entre el cabezal de la platina y el amplificador </td></tr><tr><td> 32 canales de Very Large Scale Integration cabezal de la platina, el aumento de 20x </td><td> Equipo </td><td> Plexon </td><td> HST/32V-G20 </td><td> Cabezal de la platina </td></tr></tbody></table>

large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents

Un reto importante de la neurociencia es la vinculación de la conducta de la actividad colectiva de asambleas neuronales. Comprensión de las relaciones de insumo-producto de las neuronas y los circuitos requiere de métodos con la selectividad espacial y resolución temporal adecuada para el análisis mecanicista de los conjuntos neuronales en la conducta animal, es decir, la grabación de muestras representativa grandes de neuronas individuales aislados. Monitoreo conjunto de la actividad neuronal ha progresado notablemente en la última década en los animales pequeños y grandes cerebros, incluyendo seres humanos 1-11. De múltiples sitios de grabación con dispositivos basados ​​en silicio son particularmente eficaces debido a su escalabilidad, de pequeño volumen y el diseño geométrico. Aquí se describen los métodos para el registro de múltiples neuronas individuales y los potenciales de campo local en comportando los roedores, utilizando comercialmente disponibles de micro-mecanizado sondas de silicio con componentes accesorios hechos a medida. Hay dos opciones básicas fo la interconexión de las sondas de silicio a previos: placas de circuitos impresos y cables flexibles. Empresas proveedoras de la sonda ( <a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a> ; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a> ; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a> ) suelen proporcionar el servicio de enlace y entregar las sondas unidas a las placas de circuitos impresos o cables flexibles. Aquí, se describe la implantación de un vástago 4-, 32-sitio sonda conectada al cable flexible de poliimida, y montado sobre un microdrive movible. Cada paso de la preparación de la sonda, la construcción microdrive y la cirugía se ilustra de modo que el usuario final puede fácilmente replicar el proceso.

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Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Se describen métodos para la gran escala de grabación de múltiples unidades individuales y potencial del campo local en comportando los roedores con sondas de silicio. Unidad de fabricación, el apego de la sonda a la unidad y los procesos de implantación de la sonda se ilustran con suficiente detalle para facilitar la réplica.

A gran escala de grabación de las neuronas por medio de sondas de silicio móviles en comportarse roedores

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

large-scale-recording-neurons-movable-silicon-probes-behaving

Research

JoVE Journal

Neuroscience

34.5K vistas.  University of New Jersey. Se describen métodos para la gran escala de grabación de múltiples unidades individuales y potencial del campo local en comportando los roedores con sondas de silicio. Unidad de fabricación, el apego de la sonda a la unidad y los procesos de implantación de la sonda se ilustran con suficiente detalle para facilitar la réplica.

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Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Grabación a gran escala conjuntos neuronales con sondas de silicona en la rata anestesiada

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Investigación

Neurociencias

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

Registro y análisis de los ritmos circadianos en funcionamiento las ruedas Actividad en roedores

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the centrolateral/parafascicular; Cl/Pf nucleus). The activation of either the PPN or Cl/Pf nuclei in vivo has been described to induce the arousal of the animal and an increment in gamma band activity in the cortical electroencephalogram (EEG). The cellular mechanisms for the generation of gamma band oscillations in Reticular Activating System (RAS) neurons are the same as those found to generate gamma band oscillations in other brains nuclei. During current-clamp recordings of PPN neurons (from parasagittal slices from 9 - 25 day-old rats), the use of depolarizing square steps rapidly activated voltage-dependent potassium channels that prevented PPN neurons from being depolarized beyond -25 mV.
Injecting 1 - 2 sec long depolarizing current ramps gradually depolarized PPN membrane potential resting values towards 0 mV. However, injecting depolarizing square pulses generated gamma-band oscillations of membrane potential that showed to be smaller in amplitude compared to the oscillations generated by ramps. All experiments were performed in the presence of voltage-gated sodium channels and fast synaptic receptors blockers. It has been shown that the activation of high-threshold voltage-dependent calcium channels underlie gamma-band oscillatory activity in PPN neurons. Specific methodological and pharmacological interventions are described here, providing the necessary tools to induce and sustain PPN subthreshold gamma band oscillation in vitro.

The pedunculopontine nucleus (PPN) is located in the brainstem and its neurons are maximally activated during waking and rapid eye movement (REM) sleep brain states. This work describes the experimental approach to record in vitro gamma band subthreshold membrane oscillation in PPN neurons.

Grabación de la banda gamma oscilaciones en pedunculopontino Núcleo neuronas

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a comprehensive survey of the morphological characteristics observed among a selective neuronal population. Combination of these techniques constitutes a novel approach for the collection and analysis of neuroanatomical data. Together, these techniques enable large-scale, and therefore more comprehensive, sampling of selective neuronal populations and establish unbiased quantitative methods for describing morphologically unique neuronal classes within a population.
The protocol outlines the use of modified rabies virus to selectively label neurons. G-deleted rabies virus acts like a retrograde tracer following stereotaxic injection into a target brain structure of interest and serves as a vehicle for the delivery and expression of EGFP in neurons. Large numbers of neurons are infected using this technique and express GFP throughout their dendrites, producing &#34;Golgi-like&#34; complete fills of individual neurons. Accordingly, the virus-mediated retrograde tracing method improves upon traditional dye-based retrograde tracing techniques by producing complete intracellular fills.
Individual well-isolated neurons spanning all regions of the brain area under study are selected for reconstruction in order to obtain a representative sample of neurons. The protocol outlines procedures to reconstruct cell bodies and complete dendritic arborization patterns of labeled neurons spanning multiple tissue sections. Morphological data, including positions of each neuron within the brain structure, are extracted for further analysis. Standard programming functions were utilized to perform independent cluster analyses and cluster evaluations based on morphological metrics. To verify the utility of these analyses, statistical evaluation of a cluster analysis performed on 160 neurons reconstructed in the thalamic reticular nucleus of the thalamus (TRN) of the macaque monkey was made. Both the original cluster analysis and the statistical evaluations performed here indicate that TRN neurons are separated into three subpopulations, each with unique morphological characteristics.

This protocol describes large-scale reconstructions of selective neuronal populations, labeled following retrograde infection with a modified rabies virus expressing fluorescent markers, and independent, unbiased cluster analyses that enable comprehensive characterization of morphological metrics among distinct neuronal subclasses.

Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Implantation of Chronic Silicon Probes and Recording of Hippocampal Place Cells in an Enriched Treadmill Apparatus

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced electrodes for large-scale electrophysiological recording of neuronal activity, but the procedures for their chronic implantation are still underdeveloped. The activity of hippocampal place cells is known to correlate with an animal&#39;s position in the environment, but the underlying mechanisms are still unclear. To investigate place cells, here we describe a set of techniques which range from the fabrication of devices for chronic silicon probe implants to the monitoring of place field activity in a cue-enriched treadmill apparatus. A micro-drive and a hat are built by fitting and fastening together 3D-printed plastic parts. A silicon probe is mounted on the micro-drive, cleaned, and coated with dye. A first surgery is performed to fix the hat on the skull of a mouse. Small landmarks are fabricated and attached to the belt of a treadmill. The mouse is trained to run head-fixed on the treadmill. A second surgery is performed to implant the silicon probe in the hippocampus, following which broadband electrophysiological signals are recorded. Finally, the silicon probe is recovered and cleaned for reuse. The analysis of place cell activity in the treadmill reveals a diversity of place field mechanisms, outlining the benefit of the approach.

We describe the diverse steps to implant chronic silicon probes and to record place cells in mice that are running head-fixed on a cue-enriched treadmill apparatus.

Implantación de sondas de silicio crónica y grabación de las células Hippocampal del lugar en un aparato de cinta enriquecido

An important requisite for understanding brain function is the identification of behavior and cell activity correlates. Silicon probes are advanced ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems neuroscience. One key component of this technique consists of the precise placement of multiple electrodes into desired brain regions and the maintenance of their stability. Here, we describe a protocol for the construction of a 3D-printable hyperdrive, which includes eighteen independently adjustable tetrodes, and is specifically designed for in vivo extracellular neural recording in freely behaving rats. The tetrodes attached to the microdrives can either be individually advanced into multiple brain regions along the track, or can be used to place an array of electrodes into a smaller area. The multiple tetrodes allow for simultaneous examination of action potentials from dozens of individual neurons, as well as local field potentials from populations of neurons in the brain during active behavior. In addition, the design provides for simpler 3D drafting software that can easily be modified for differing experimental needs.

We present the construction of a 3D-printable hyperdrive with eighteen independently adjustable tetrodes. The hyperdrive is designed to record brain activity in freely behaving rats over a period of several weeks.

Construcción de un hiperimpulsor mejorado del tetrodo múltiples de grabación Neural a gran escala en comportarse ratas

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...