Los biochips de ADN son una atractiva plataforma de investigación para la biología autointético, desarrollada originalmente por el grupo BASF, que permite el funcionamiento de circuitos genéticos in vitro durante largos períodos de tiempo. Con este protocolo, esperamos poner esta tecnología a disposición de una gama más amplia de investigadores. Nuestro método, llamado litografía de bephore, representa una estrategia para la inmovilización del ADN basada en la reacción de desplazamiento de la cadena de ADN.
La fuerza de esta técnica reside en sus capacidades litográficas de varios pasos, su simple reproducibilidad y la disponibilidad comercial de todos los componentes. Al igual que otras soluciones de biochip, el before se puede combinar con diferentes tecnologías. Por ejemplo, los cepillos genéticos funcionales se pueden ensamblar dentro de microcompartidores para la expresión de proteínas.
Para empezar, prepare una mezcla de RCA mezclando cinco partes de agua con una parte de una solución de 30% de amoníaco en un vaso de precipitados de vidrio. Calienta la mezcla a 70 grados Celsius en un plato caliente mientras remueves. Una vez que alcance los 70 grados centígrados, agregue una parte 30%peróxido de hidrógeno.
A continuación, coloque una oblea de silicio de 100 milímetros de diámetro en la solución, para eliminar el material orgánico y las partículas de ella. Después de 30 minutos, saque el sustrato, enjuáguelo bien con agua de una botella de lavado y séquelo con una pistola de nitrógeno. Proceder inmediatamente con la PEGylation del sustrato.
Para lograr esto, primero diluir la biotina-PEG-Silane en tolueno seco a 5 miligramos por mililitro, y vórtice la solución hasta que esté bien mezclada. Con el sustrato colocado en un plato Petri de vidrio, pipetee lentamente la solución sobre el sustrato, cubriendo toda la superficie, pero evite permitir que la solución fluya sobre el borde. Una vez cubierta la superficie, cierre el plato Petri y, a continuación, agregue una cubierta adicional.
Después de 30 minutos, retire la cubierta y agregue aproximadamente 40 mililitros de alcohol isopropílico al plato de Petri. Luego saque el sustrato, enjuáguelo de nuevo a fondo con alcohol isopropílico y séquelo con una pistola de nitrógeno. Cuando esté seco, guarde el sustrato en la oscuridad hasta que sea necesario.
Preparar un sustrato utilizando un cortador de vidrio o un bisturí para formar trozos de un centímetro por un centímetro. A continuación, agregue una marca de alineación simple haciendo un rasguño corto desde el centro hacia un borde del sustrato. Sopla cualquier partícula pequeña del chip usando una pistola de nitrógeno.
A continuación, mezcle dos gotas de un pegamento de silicona de dos componentes y aplique el pegamento a la superficie del chip, dejando el área alrededor de la punta del rasguño en blanco. Allí el pegamento proporciona una barrera hidrófoba, manteniendo soluciones acuosas en el chip. Esto facilita los pasos de lavado posteriores, y reduce la cantidad de ADN necesario para las incubaciones.
En un paso posterior, el pegamento se puede pelar fácilmente. En los siguientes pasos, el ADN fotocleaveable se maneja solo en un entorno de luz amarilla. Cubra el chip con unos 10 microlitros de una mezcla de bephore a temperatura ambiente, y coloque el chip en una caja parcialmente llena de agua para reducir la evaporación.
Después de una hora, lave el chip varias veces con PBS para eliminar cualquier mezcla de beforo sin ataduras. A continuación, agregue 10 microlitros de la mezcla de pasivación al chip. Después de dos horas, lave el chip varias veces con PBS para eliminar los agentes de pasivación no enlazados.
Corte una máscara de foto impresa al tamaño adecuado para que se ajuste a un soporte de máscara adecuado. Insértelo en la posición del tope de campo y utilice las marcas de alineación para alinear la máscara en el soporte. Con el sustrato colocado en la etapa de microscopía, inserte un filtro rojo en la trayectoria de iluminación y concéntrese en la superficie del sustrato.
A continuación, navegue a la región del sustrato que se expondrá. A continuación, inserte el soporte de la máscara, bloquee la iluminación y cambie al filtro UV. A una intensidad de luz baja, abra el obturador y utilice la cámara para enfocar rápidamente la máscara en el sustrato.
Con el sustrato ahora alineado y la máscara enfocada, bloquee el camino de luz a la cámara e ilumine el sustrato a una alta intensidad de luz para el tiempo de exposición deseado. Después de la exposición, retire la muestra del microscopio y retire cuidadosamente el mayor tampón posible del sustrato sin secarla. A continuación, agregue de 10 a 20 microlitros de ADN con la secuencia para la fijación a la superficie.
Coloque el sustrato en una caja húmeda para evitar que se seque e incubar el ADN en el sustrato durante dos horas a temperatura ambiente. Para observar la expresión génica compartimentada en un microscopio invertido, primero prepare por separado las dos partes del soporte de la muestra. Comience pegando un chip de bephore con un cepillo genético inmovilizado en el soporte de la viruta, utilizando cinta adhesiva de doble cara.
A continuación, agregue un poco de grasa al vacío alrededor del orificio central de la parte inferior del soporte e inserte el soporte de viruta. Ahora ensamble la parte superior del soporte. Cortar un chip PDMS delgado con compartimentos lo más pequeños posible, dejando un canal abierto a un lado para luego permitir el intercambio de residuos y moléculas precursoras por difusión Después, tratar el plasma-tratar un resbalón de cubierta de vidrio en la parte posterior del chip PDMS con plasma de oxígeno.
Inmediatamente después del tratamiento, coloque el chip PDMS en el centro del portaobjetos de vidrio, con los compartimentos apuntando hacia arriba. Luego, hornee el vaso con el PDMS durante una hora a 70 grados Centígrados. Poco antes de montar todo el portavelas, trate por plasma el portaobjetos de vidrio con el chip PDMS como antes.
A continuación, agregue un poco de grasa al vacío alrededor del orificio grande del soporte superior y coloque la diapositiva de vidrio con el PDMS en él. Presione suavemente el vaso sobre la grasa. Retire cuidadosamente el tampón del chip y lávelo una vez con 10 microlitros del sistema de autoexpresión.
A continuación, agregue 60 microlitros de sistema de autoexpresión en el chip y retire el pegamento de silicona de dos componentes de los bordes. Ahora, agregue 20 microlitros del sistema de expresión al PDMS. Después de colocar la gota en el PDMS, compruebe rápidamente en el microscopio estereoscópico que los compartimentos están bien mojados y sin burbujas de aire.
Si hay burbujas de aire, trate de lavarlas. Para ensamblar las dos piezas del soporte, y para alinear cámaras y cepillos de ADN, trabajar bajo un microscopio estereoscópico. Inmovilice el soporte inferior con un brazo de sujeción para que los dos tornillos y las alas sean fácilmente accesibles con ambas manos.
Inserte el soporte superior en el soporte inferior y tírelo hasta que las gotas del sistema de expresión sin celda se fusionen. A continuación, compruebe que los compartimentos y la marca de alineación se encuentran en una región similar en el plano XY. Desde abajo, arruine las tuercas de ala hasta que toquen el lado inferior del soporte.
Mientras alinea los compartimentos y el chip en el plano XY, apriete suavemente las tuercas de ala. Este paso requiere cierta experiencia y depende de la construcción del portacuchillas. El PDMS debe ser presionado sobre el chip sólo con una fuerza suave.
A continuación, rocíe una esponja en el recinto antievaporción con agua e inserte el soporte en la caja. A continuación, llene una jeringa de cinco mililitros con pegamento de silicona de dos componentes y úselo para sellar la caja. Por último, transfiera la caja a un microscopio con temperatura controlada e imagine el cepillo de ADN y la reacción mediante microscopía de fluorescencia.
Un proceso litográfico de dos pasos, realizado aquí en un portaobjetos de vidrio bephore, produce patrones superpuestos de hebras de ADN con etiqueta fluorescente. En esta demostración de expresión génica en chip, el ADN se inmoviliza en la cámara de la izquierda. Cuando se expone a la mezcla de expresión, la proteína fluorescente amarilla YPet se sintetiza a partir del ADN inmovilizado.
Para evaluar la actividad del sistema de expresión génica, se observa la recuperación de la fluorescencia después de un paso de blanqueo. A las dos horas, la intensidad de la fluorescencia se recuperó rápidamente. Sin embargo, después de cuatro y seis horas, no se recuperó, lo que indica que sin un nuevo suministro de la mezcla de expresión, la reacción terminó alrededor de la cuarta hora.
Aunque la expresión génica es limitada en un sistema cerrado, puede mantenerse durante períodos de tiempo más largos suministrando a los compartimentos de expresión moléculas precursoras adicionales a través de micro-fluidos. El método bephore se utiliza para inmovilizar oligonucleótidos o ADN de longitud genética, que se puede aplicar para construir sistemas de cepillos de ADN que interactúan para la expresión auto-gengénica. La técnica también se puede utilizar para otras aplicaciones en la biofísica, como estudios de fluorescencia de molécula única.
Después de ver este video, usted debe ser capaz de fabricar biochips bephore a partir de obleas o diapositivas de vidrio, e integrarlos en sus proyectos de investigación.
