Este protocolo es significativo porque detalla cómo generar rápidamente grandes cantidades de plantilla de ADN para su uso en reacciones libres de células a partir de un pequeño fragmento de gen recibido de una instalación de síntesis. La amplificación del círculo rodante puede generar grandes cantidades de ADN más rápido que la clonación tradicional. Por lo tanto, admite ciclos de aprendizaje de prueba de construcción de diseño de mayor rendimiento de bibliotecas de ADN sintético.
Estas técnicas pueden tener una gran variabilidad inherente para los nuevos usuarios debido a los muchos pasos y pequeños volúmenes requeridos. Se debe prestar especial atención a la técnica, y la práctica hace la perfección. Para empezar, añade todos los componentes de un kit de PCR en un solo tubo de PCR.
Luego agregue un microlitro del fragmento de gen resuspendido. Homogeneice suavemente la mezcla mediante vórtice en un ajuste medio durante cinco a 10 segundos. Después de programar el termociclador de acuerdo con el protocolo del fabricante del kit, ejecute la PCR.
Al finalizar la PCR, use un kit de limpieza de PCR para purificar el ADN de la mezcla de reacción. En un tubo de 1,5 mililitros, agregue el tampón de unión al ADN y la muestra de PCR en una proporción de cinco a uno. Transfiera esta mezcla a la columna de centrifugado y centrífuga a 16, 000 veces G durante un minuto.
Descarta el flujo a través. Agregue 200 microlitros del tampón de lavado de ADN a la columna e incube a temperatura ambiente durante un minuto. Centrifuga la columna de nuevo y descarta el flujo.
Lave la columna una vez más con el tampón de lavado de ADN, como se ha demostrado. Después de desechar el flujo a través del segundo lavado, retire cualquier amortiguador restante centrifugando la columna durante uno o dos minutos adicionales. Para eludir el ADN, transfiera la columna a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.
Luego agregue 46 microlitros de agua doble destilada a la columna. Después de una incubación de un minuto, recoja el ADN en el tubo por centrifugación. Y cuantificar el ADN purificado utilizando un espectrofotómetro.
Para digerir y circularizar el ADN, combine cinco microlitros del tampón de reacción necesario, 20 unidades de la enzima de restricción HindIII y 45 microlitros del ADN purificado en un tubo de PCR. Usando una pipeta, homogeneice suavemente esta mezcla. Luego incubarlo en un termociclador durante 15 minutos a 37 grados centígrados.
Una vez completada la incubación, el calor inactiva la enzima HindIII incubando durante 20 minutos a 80 grados centígrados. Luego agregue cinco microlitros de tampón T4 Ligase y 800 unidades de T4 Ligase al ADN recién digerido. Después de mezclar suavemente con una pipeta, incubar la mezcla durante una hora a 25 grados centígrados para realizar la reacción de circularización.
Una vez que se complete la reacción, purifique el ADN utilizando un kit de limpieza de PCR como se demostró anteriormente. Luego cuantifique el ADN. Para realizar la amplificación del círculo rodante, combine todos los componentes de reacción y un microlitro de la plantilla de expresión circularizada purificada en un solo tubo.
Homogeneizar la mezcla con una pipeta y alícuota de 10 microlitros de la mezcla en cuatro tubos separados. Incubar los tubos a 30 grados Celsius durante cuatro a 18 horas, luego calentar inactivar la enzima incubando a 65 grados Celsius durante 10 minutos. Después de la inactivación por calor, fomente la condensación en la parte inferior del tubo incubando a 12 grados centígrados durante cinco minutos.
A continuación, diluya la solución resultante agregando 15 microlitros de agua doble destilada a cada tubo. Combine el contenido de cada tubo antes de purificar y cuantificar el ADN como se demostró anteriormente. Para realizar la reacción libre de células, agregue los diversos componentes requeridos en un tubo y diluya hasta el volumen final deseado con agua de doble destilación.
Mezcle bien la solución canalizando la mitad de la solución hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces. Transfiera la mezcla de reacción en alícuotas de 15 microlitros a los pocillos deseados en la placa de microtitulación. Luego selle la placa con una película de sellado incolora para mantener la humedad y evitar la evaporación.
Coloque la placa sellada en el lector de placas y permita que la reacción proceda a completarse. Si se expresa el gen BPN de subtilisina utilizando el sistema libre de células, alícuota 94 microlitros de agua de doble destilación y un microlitro de 10 PNA micromolares en una placa de 96 pocillos incolora de fondo plano. Luego agregue cinco microlitros de la reacción completa sin células y lea la placa usando un lector de placas configurado para medir la absorbancia a 410 nanómetros cada 20 segundos durante 10 minutos mientras mantiene una temperatura de 25 grados centígrados.
La expresión de la GFP supercarpeta en el extracto de estrella BL21 DE3 utilizando solo 3 microlitros de ADN RCA no purificado en una reacción de 15 microlitros es comparable a la del plásmido PJL1. Duplicar y triplicar las cantidades de plantilla parece no ofrecer ningún beneficio obvio, lo que sugiere niveles ya saturados de la plantilla a 3 microlitros por reacción. Por el contrario, parece haber un beneficio al aumentar la cantidad de plantilla RCA cuando se usa el extracto de célula de deformación aleatoria.
Las proteínas que requieren temperaturas más bajas o tiempos de plegado más largos afectan el tiempo requerido para completar todo el flujo de trabajo. Por ejemplo, el ensayo de subtilisina después de cuatro horas de expresión conduce a un resultado fallido, ya que cuatro horas no son suficientes para la maduración de la subtilisina. Sin embargo, permitir que la reacción continúe hasta las 16 horas conduce a niveles detectables de subtilisina.
Todos los componentes deben estar bien mezclados para que este protocolo funcione con la máxima eficiencia. Siguiendo estos métodos, se puede generar sintéticamente una gran biblioteca de proteínas candidatas y luego expresarlas con un rendimiento suficiente para la caracterización. Este método allanó el camino para que nuestro grupo desarrollara N C dos sensores que pueden trabajar en extractos celulares, lo que nos permite caracterizar rápidamente la proteína prototipo.
Esto nos permitirá iterar de manera más rápida e inteligente en el diseño de proteínas de nuevos biocatalizadores y terapias.
