Biz fare poliklonal anti-RVFV antiserum ve akış sitometri ile yardım için UTMB Sitometrisi Core Tesisi M. Griffin sağlamak için RB Tesh teşekkür ederim. Bu çalışma UTMB.OL de James W. McLaughlin Bursu Fonu desteklenmiştir tarafından desteklenmiştir UTMB.BK de Aşı Geliştirme için Sealy Merkezi&#39;nden Batı Bölgesel Mükemmellik Merkezi, NIH hibe R01 AI08764301 ve finansman ile 5 U54 AI057156 tarafından desteklenmiştir Bir Maurice R. Hilleman Erken-Evre Kariyer Araştırmacı Ödülü.

Floresan mikroskobu ile transkripsiyon analizi 1. MP-12 ve AB ile Etiket Doğan RNA ile hücreler enfekte <ol><li> 12-iyi doku kültürü plakası içine Sıra 12-mm yuvarlak lamelleri, iyi başına bir lamel. </li></ol> Not: hücreleri kuyularda yerleştirmeden önce sorun lamelleri bağlı kalarak, poli-L-lisin (MW ≥ 70.000) ile kat var. Bu amaçla, 5 dakika boyunca poli-L-lisin H2O içinde steril, 0.1 mg / ml çözelti daldırmak lamelleri. En az 2 saat süreyle steril H 2 O ve hava-kuru ile lamelleri durulayın. <ol start="2"><li> Lamelleri üzerine tohum 293 hücreleri için, oyuk başına 1 ml büyüme ortamı (DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ihtiva eden) 5 x 10 4 hücre ekleyin. 37 nemlendirilmiş bir inkübatör inkübe ° C ve% 5 CO 2 O / N </li><li> 3 &#39;lik bir enfeksiyon çokluğu (İB) de MP-12 hücreleri enfekte. Dahil, en az iki<html> bulaşmamış kuyu: iki kuyu biri enfekte olmayan kontrol olarak hizmet verecek, diğer transkripsiyonel bastırma için bir kontrol olarak adım 1.5 de aktinomisin D (ActD) ile tedavi edilecektir. Büyüme ortamı çıkarın ve virüs stokunun seyreltmek böylece toplam hacim, her bir oyuğa ilave bir 200 ml &#39;dir. 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 1 saat boyunca inkübe ° C ve% 5 CO2. </li></ol> Not: yerine hücrelerin enfekte arasında, hücreler de plasmid DNA ile transfekte ya da in vitro olarak, belirli bir viral proteini kodlayan bir RNA sentez edilebilir. Bu amaçla, üreticinin talimatlarına göre uygun bir kimyasal transfeksiyon reaktif ile hücreleri transfect ve 16 saat sonrası transfeksiyon 1.5 adıma geçin. Bu RNA etiketleme ve sabitleme önce transfeksiyon koşulları ve inkübasyon süresi optimize etmek için tavsiye edilir. <ol start="4"><li> Inokulum kaldırmak ve iyi başına 1 ml taze besi ekleyin. 15 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol>ove_content &quot;&gt; Not:. başka bir virüs ile kullanmak için bu protokolü adapte, bu RNA etiketleme ve sabitleme için en uygun zaman noktası belirlemek için bir süre ders deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir bu kez enfeksiyon kez sendeleyerek böylece o dersin ve tüm kurun örnekler, etiketli sabit ve aynı zamanda boyanmış olabilir. <ol start="5"><li> 15 saat sonrası enfeksiyon (hpi), 1 mM AB içeren orta büyüme orta yerine. Sahte enfekte kuyu biri olan, aynı zamanda 5 ug / ml ActD ekleyin. ActD DNA-bağımlı RNA sentezini inhibe eder gibi bu, transkripsiyonel bastırma için kontrol olarak görev yapacak. Inkübatör hücreleri dönün. </li><li> 16 hpi olarak, orta kaldırmak ve 1 ml PBS (KCI 0.20 g / l, KH 2 PO 4 0.20 g / L NaCl, 8.00 g / L Na 2 HPO 4 1,15 g / l, pH 7.4) ile bir kere yıkayın lamelleri de başına. Oyuk başına% 4 paraformaldehid, 1 ml (PFA) eklenerek ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edilerek hücreleri saptamak. </li></ol>Not:% 4 PFA sabitleme solüsyonu hazırlamak için, ° C ısıtılmış bir manyetik karıştırıcı üzerinde 60 kadar ısıtılır 150 ml H 2 O 10 g paraformaldehid çözülür. 1M NaOH 500 ul ekleyin ve çözüm berrak hale gelinceye kadar karıştırmaya devam edin. Partikülleri kaldırmak ve 62.5 ml fosfat tampon eklemek için bir kağıt filtre ile filtre PFA çözeltisi (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM 2-Na HPO 4, pH 7.4). 250 ml toplam hacme H2O ekleyin. Tek kullanımlık alikotları -20 ° C&#39;de dondurun. <ol start="7"><li> Oyuk başına 1 ml PBS ile bir kez yıkayın. Resim inkübasyon süresi bu ve daha sonraki tüm yıkama adımları için gereklidir. 2. adıma hemen geçin. </li></ol> Not: Uzun süre için bu aşamada tutulması durumunda RNA dejenere gibi, hemen tıklama reaksiyon devam etmek açısından önemlidir; hücreler, 4, 1 saat boyunca tutulur, RNA flüoresan sinyal kaybı önceden tespit edilebilir ° C . Benzer şekilde, eğer başıBir süre ders deney oluşturan, etiket emin olun düzeltmek ve aynı zamanda tüm örnekler leke. 2. Etiketli RNA Algılama Reaksiyon tıklayın <ol><li> 1 ml PBS içinde% 0.2 Triton X-100 eklenmesi ile hücre geçirgenliği. Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li></ol> Not: adımda kullanılan tüm çözümler 2.1 ile 2.3 nükleaz ücretsiz olması gerekir. <ol start="2"><li> Oyuk başına 1 ml PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Nemli odasına 12-plaka ve transfer lamelleri çıkarın. Her: 100 ul tıklayın boyama solüsyonu (100 mM askorbik asit 100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO 4, 20 mcM floresan azid [590/617 nm uyarma / emisyon maksimum]) - 50 ile her lamel örtün. Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> Not: Plastik parafin film ile 10 cm çapında nemli odası, çizgi bir hücre kültürü veya petri altına monte etmek için. Di kenarının iç çizgiyinemli kağıt havlu ile sh. Plastik parafin film üzerine lamelleri yerleştirin. Not: lamelleri bu veya protokolde başka bir adımı sırasında kurumasına izin vermemek için dikkatli olun. Bu nemli odasına yerleştirildi kuruluşuna her lamel boyama çözüm eklemek için en iyisidir. Not: Bu adımı hemen önce taze tıklama boyama çözüm hazırlayın. 1.5 M Tris, pH 8.5, 100 mM CuSO 4 ve 500 mM askorbik asit stok çözeltileri 4 ° C de muhafaza edilebilir Ancak, sarı döndü herhangi bir askorbik asit stok solüsyonu atın. Not: floresan mikroskop filtreleri eşleşen bir fluorofor seçtiğinizden emin olun. <ol start="4"><li> Yeni bir 12-plaka içine nemli odası ve yerden lamelleri çıkarın ve iyi başına 1 ml PBS ile üç kez yıkayın. </li></ol> Not: de iseviral proteinlerin koruması, istenen lamelleri monte edilebilir ve bu adımı (3.3 adıma geçin) sonra görüntülenmiş. 3. Viral Proteinlerin İfade bulmak için İmmünofloresan <ol><li> Her bir kuyucuğa engelleme tamponu, 1 ml (% 3 (w / v) sığır olarak albumin (BSA), serum PBS) ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Nemli odasına, 12 plaka transfer lamelleri çıkarın ve 50 ile kapak - tampon (1:500) engelleme seyreltilmiş primer antikor 100 ul (anti-RVFV, Dr RB Tesh bir tür hediye, UTMB). Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> Not: Farklı bir virüs ile kullanmak için bu protokolü adapte olduğunda, önce primer antikor için en uygun seyreltme belirler. Not: Alternatif olarak, bu adım, karanlıkta 4 ° C&#39;de O / N gerçekleştirilebilir. <ol start="3"><li> 12 plaka geri nemli odası ve yerden lamelleri çıkarın ve yıkayınüç 1 ml PBS ile kat başına iyi. </li><li> 50 ile nemli odası ve kapağı içine 12-iyi bir yerde, yerden lamelleri çıkarın - ikincil antikor 100 ul (anti-fare IgG floresan boya [uyarma / emisyon maksimum: 495/519 nm] konjuge) (1 tampon engelleme seyreltilmiş: 500). Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> Not: Birincil antikor tanımak ve floresan mikroskop filtreleri uygun bir ikincil antikor seçtiğinizden emin olun. Not: Arzu edildiği takdirde, 200 ng / ml &#39;DAPI çekirdekleri görselleştirmek için ikincil antikor seyreltme eklenebilir. <ol start="5"><li> Geri 12 plaka içine nemli odası ve yerden lamelleri çıkarın ve iyi başına 1 ml PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Bir mikroskop lamı üzerine Fluoromount-G bir damla (ca. 15 ul) koyarak lamelleri monte edin. H 2 O içine lamel batırın, inci dokunarak fazla H 2 O çıkarınFluoromount-G açılan aşağı bir kağıt havlu ve yerine hücre tarafı karşı e tarafı. 5 dakika boyunca hava kuru. </li></ol> Not: ters bir mikroskop görüntüleme ise, Fluoromount-G 4 katılaşmaya izin ° mikroskop lamı CO / N veya yapıştırın lamelleri şeffaf oje ile kenar sızdırmazlık tarafından. Not: bir hafta için Slaytlar hemen görüntülü veya karanlıkta 4 ° C&#39;de saklanabilir. 4. Veri Toplama <ol><li> Bir floresan mikroskop kullanılarak görüntü. </li></ol> Not: mikroskop kullanılarak görüntülendi olabilir uygun fluorophores seçtiğinizden emin olun. Başvuru için, aşağıdaki bu yayında gösterilen görüntüler elde etmek için kullanılan fluorophores ve filtre setleri. DAPI: Tahrik olma filtresi: BP 330-385 Iki renkli ayna: DM 400 Emisyon filtresi: LP 420 Tahrik olma filtresi: BP 460-490 Iki renkli ayna: DM 505 Emisyon filtresi: LP 510 590/617 bir uyarma / emisyon maksimum fluorofor: Tahrik olma filtresi: BP 545-580 Iki renkli ayna: DM 600 Emisyon filtresi: LP 610 Akış sitometrisi ile transkripsiyon analizi 5. MP-12 ve AB ile Etiket Doğan RNA ile hücreler enfekte <ol><li> Büyüme ortamı (DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ihtiva eden) içinde 6-çukurlu bir doku kültür levhası içine Tohum 293 hücreleri. % 100 confluency - 37 ° C ve% 5 CO 2 hücreleri 80 ulaşana kadar nemlendirilmiş bir inkübatör inkübe edin. </li><li> Bir moi 3 de MP-12 ile hücreleri enfekte. En az iki bulaşmamış kuyu şunlardır: iki kuyu biri enfekte olmayan kontrol olarak hizmet verecek, diğer adımda ActD ile tedavi olacak5.4. Büyüme ortamı çıkarın ve toplam hacim, her bir oyuğa ilave böylece virüs stokunun seyreltik 400 ul. 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 1 saat boyunca inkübe ° C ve% 5 CO2. </li><li> Inokulum çıkarın ve 2 ml taze besi başına iyi ekleyin. 12 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Not: başka bir virüs ile kullanmak için bu protokolü adapte, bu etiketleme ve hasat için en uygun zaman noktası belirlemek için bir süre ders deney gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Enfeksiyon kez incelirler ve tüm örnekler hasat, etiketlenmiş ve aynı zamanda boyanmış olabilir, böylece bu zaman aralığının ayarlayın. <ol start="4"><li> 12 hpi de, 0.5 mM AB içeren orta büyüme orta yerine. Sahte enfekte kuyu biri olan, aynı zamanda 5 ug / ml ActD ekleyin. ActD DNA-bağımlı RNA sentezini inhibe eder gibi bu, transkripsiyonel bastırma için kontrol olarak görev yapacak. Inkübatör hücreleri dönün. </li><li> 13 hpi de, zekâ kez hücreleri yıkayınhücreler tripsinizasyon ile saat PBS ve hasat. PBS, 1 mM EDTA (PBS-EDTA) içeren hasat edilmiş hücreler üç kez yıkayın. </li></ol> Not: Bu ve daha sonraki adımları sırasında, 500 daha hızlı hücreler santrifüj yok - 1.000 x g hücre kırılması önlemek için. 1 hücreleri santrifüj - sediment için 2 dk. Not: bir yüzey immün yerine lastik polis veya tek hücre kazıyıcı kullanarak tıklama reaksiyon, hasat sonrasında planlanmış ise. <ol start="6"><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 PFA ve inkübe 1 ml bunları yeniden süspansiyona hücreleri saptamak. % 4 PFA hazırlamak için nasıl talimatlar için 1.6 adıma bakın. </li><li> Oyuk başına 1 ml PBS-EDTA ile bir kez yıkayın. 6. adıma hemen geçin. </li></ol> Not: uzun süre için bu aşamada muhafaza edilmesi durumunda RNA bozulur gibi, hemen tıklama reaksiyon devam etmek önemlidir. Benzer şekilde, bir zaman c yerine iseourse deney, aynı zamanda tüm örnekler, etiket düzeltmek ve leke emin olun. 6. Etiketli RNA Algılama Reaksiyon tıklayın <ol><li> PBS içinde% 0.2 Triton X-100, 0.5 ml &#39;si içinde yeniden asılı hücreleri geçirgenliği. Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li></ol> Not: adımda kullanılan tüm çözümler 6.1 to 6.3 nükleaz ücretsiz olması gerekir. Not: hücreleri bu adımı sırasında tortu düzgün yapmazsanız, 5 dakika için santrifüj süresi artar. Sedimantasyon davranış kez hücreleri FACS tampon (adım 6.4) olarak askıya alınır açısından yararlı olacaktır. <ol start="2"><li> 1 ml PBS ile bir kez yıkayın. </li></ol> Not: Bu Cu 2 + iyonları tıklama reaksiyon için gerekli şelat gibi bu adımda EDTA kullanmayın. <ol start="3"><li> 200 ul tıklayın boyama çözüm içinde süspanse edin hücreleri (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO 4, floresan boya [hariç etiketli 200nM azidaktif rehabilitasyonu amaçlayan / emisyon maksimum, 650/665 nm], 100 mM askorbik asit). Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> Not: Bu adımı hemen önce taze tıklama boyama çözüm hazırlayın. 1.5 M Tris, pH 8.5, 100 mM CuSO 4 ve 500 mM askorbik asit stok çözeltileri 4 ° C de muhafaza edilebilir Ancak, sarı döndü herhangi bir askorbik asit stok solüsyonu atın. Not: Bu adımı sırasında birlikte hücreleri yığın ise, birkaç kez aşağı yukarı pipetleme ve ile tekrar süspansiyon. Not: akış sitometresinde ile tespit edilebilir bir fluorofor seçtiğinizden emin olun. Not: Ayrıca tıklama boyama işlemi tabi değildir enfekte hücrelerin bir örneği hazırlamak, bu akış sitometresinin kalibrasyonu için gerekli olacaktır. Ya enfekte hücrelerin yarısı kullanabilir veya adım 5.2 de iyi enfekte ek içerir. Bu control hücreleri adım 7.1 olarak boyanmış olacaktır. <ol start="4"><li> FACS tampon maddesi (PBS, 1 mM EDTA ve% 0.5 (w / v) BSA içeren) ile iki kez yıkanır. </li></ol> Not: viral proteinlerin herhangi bir immün isteniyorsa, hücreler analiz edilebilir hemen (8 adıma). 7. Viral Proteinlerin İfade bulmak için İmmünofloresan <ol><li> Primer antikor, 200 ul süspansiyon hücreleri (anti-RVFV) FACS tamponu (1:10,000) içinde seyreltilmiş ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li></ol> Not: Alternatif olarak, bu adım, karanlıkta 4 ° C&#39;de O / N gerçekleştirilebilir. Not: Ayrıca tıklama boyama işlemi tabi ama boyanmış olmayacaktır enfekte olmamış hücrelerin bir örneği hazırlamak, bu akış sitometresinin kalibrasyonu için gerekli olacaktır. Ya sahte enfekte hücrelerin yarısı kullanabilir veya ek bir bulaşmamış iyi de dahil5.2 adım. Not: Farklı bir virüs ile kullanmak için bu protokolü adapte olduğunda, önce primer antikor için en uygun seyreltme belirler. <ol start="2"><li> FACS tamponunda iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> İkinci antikor, 200 ul süspansiyon hücreleri (anti-fare IgG, floresan boya [uyarım / emisyon maksimum: 495/519 nm] konjüge) FACS tamponu (1:1,000) içinde seyreltilmiş ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> FACS tamponunda bir kez hücreleri yıkayın. </li></ol> Not: Bu noktada, hücreler, karanlıkta 4 ° C&#39;de O / N saklanabilir. 8. Veri Toplama <ol><li> 5 ml polistiren tüpler içine 500 ul FACS tampon, transfer hücrelerin yeniden süspanse ve akış sitometresi kullanılarak analiz. Alet kalibre MP-12 enfekte hücreleri (sadece bir tıklama tepki, anti-RVFV boyama) ve sahte enfekte hücreleri (sadece tepki tıklayın) kullanın. </li></ol> Değile: Cihazınızın ile tespit edilebilir uygun fluorophores seçtiğinizden emin olun. Referans için, aşağıdaki Bu yayında gösterilen veriler elde etmek için kullanılan lazer çizgi ve filtre kümesi vardır. 495/519 bir uyarma / emisyon spektrumu ile fluorofor: Lazer: 488 nm Filtre: 530/30 650/665 bir uyarma / emisyon spektrumu ile fluorofor: Lazer: 640 nm Filtre: 670/20

<ol>
	<li>Fakan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+support+for+RNA+synthesis+in+the+cell+nucleus.">Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus.</a> Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).</li><li>Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+RNA+synthesis+using+bromouridine+labelling+and+bromodeoxyuridine+antibodies.">Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies.</a> Cytometry. 14, 455-458 (1993).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidotriazoles+on+solid+phase:+[1,2,3]-triazoles+by+regiospecific+copper(i)-catalyzed+1,3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides.">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li><li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSs+protein+of+rift+valley+fever+virus+promotes+posttranslational+downregulation+of+the+TFIIH+subunit+p62.">NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li><li>Kalveram, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rift+Valley+fever+virus+NSs+inhibits+host+transcription+independently+of+the+degradation+of+dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR.">Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR.</a> Virology. , (2012).</li><li>Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+Rift+Valley+fever+virus+NSs+encoding+a+partial+truncation.">Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation.</a> PLoS One. 7, e45730 (2012).</li><li>Lihoradova, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Rift+Valley+Fever+Virus+MP-12+Strain+Encoding+NSs+of+Punta+Toro+Virus+or+Sandfly+Fever+Sicilian+Virus.">Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus.</a> PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).</li><li>Kalveram, B., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toscana+Virus+NSs+Protein+Promotes+Degradation+of+Double-Stranded+RNA-Dependent+Protein+Kinase.">Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase.</a> J. Virol. , (2013).</li><li>Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).</li><li>Le May, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TFIIH+transcription+factor,+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus.">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li><li>Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagen-directed+attenuation+of+Rift+Valley+fever+virus+as+a+method+for+vaccine+development.">Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development.</a> J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).</li><li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+infectious+Rift+Valley+fever+virus+entirely+from+cDNA,+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene,+and+expression+of+a+foreign+gene.">Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li><li>Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viral+RNA+by+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH).">Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. , e4002 (2012).</li><li>Reich, E., Goldberg, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinomycin+and+nucleic+acid+function.">Actinomycin and nucleic acid function.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).</li><li>Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+of+fluorochromes+to+monoclonal+antibodies.">Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Sağlanan protokolü doğmakta olan RNA içine üridin analog AB&#39;nin birleşme ile konak hücre transkripsiyon viral enfeksiyon etkisini ölçmek için bir yöntem açıklanır. Hızlı, hassas olduğunu ve radyoaktif izotopların kullanımı dayanmaz: Bu yöntem önceki yöntemlere göre birçok avantajı vardır. Ayrıca yöntem, floresan mikroskobu veya esas itibariyle aynı reaktifler kullanılarak akış sitometrisi ile sayısal veriler ile niteliksel verileri vermek üzere adapte edilebilir. Viral antijenler i...

<html> Geleneksel olarak, transkripsiyonel aktivitesini radyoaktif (3H-üridin) 1 ya dahil edilmesi ile ölçülür ya da doğmakta olan RNA içine (BrU) 2 nükleosidlerin halojenli edilmiştir. Bu üridin analoglan, hücreler tarafından alınır nükleosit kurtarma yolu ile üridin trifosfat (UTP) haline dönüştürüldü ve daha sonra yeni sentezlenen RNA&#39;nın dahil edilmiştir. 3H-üridin zaman alıcı olabilir otoradyografi, veya parıldama ile tespit edilebilir edilir özel ekipman gerektiren, sayma. Ayrıca, radyoaktif izotopların kullanımı yüksek çevreleme biyogüvenlik laboratuarları dahil olmak üzere, laboratuvar ortamlarında bir dizi pratik olmayabilir. BrU RNA ikincil yapı antikor bağlayıcı bir sterik engel olabilir olarak çekirdek ya da RNA&#39;nın kısmen denatüre, ve antikorun erişimi sağlamak için sert geçirgenliği gerektirebilir anti-BrU antikorları ile immüno-boyama yoluyla tespit edilebilir. _content &quot;&gt; Burada açıklanan protokol en son gerilme RVFV MP-12 ile enfekte edilmiş hücrelerde transkripsiyonel aktivitesini ölçmek için kimya 3 tıklayın geliştirilmiştir. Click kimyası, son derece seçici ve etkili bir bakır (I) katalizli bir alkin arasındaki siklo-ilave reaksiyonu dayanır kullanır 4,5-bir azid yarımı. Bu protokol, enfekte olmuş hücrelerde Yeni oluşan RNA ilk üridin analog AB dahil edilmesi yoluyla etiketlenir. ikinci bir adımda, kurulmuş AB, floresan azit ile reaksiyona sokulması ile tespit edilir. Bu yöntemin en önemli avantajları , (1) bunun radyoaktif izotopların kullanımını gerektirmeyen ve (2) bu kadar sert geçirgenliği veya RNA denatürasyon gerektirmez. yetersiz tarafından engellenir değildir az 50 Da, floresan azid ile erişim arasında bir moleküler ağırlığa sahip Bir sınıf ile RNA&#39;nın tespiti birleştirirken geçirgenliği veya RNA sekonder yapısı. Dahası, araştırmacıların birincil antikor seçiminde sınırlı değildirviral proteinler için ical immün. Iki farklı yöntem, bu protokolde tarif edilmektedir: floresan mikroskobu (1-4), ve akış sitometrisi (adım 5-8) aracılığıyla transkripsiyon miktarının belirlenmesi için, bir transkripsiyon ile görüntülenmesi için, bir. Bu yöntemlerin her ikisi bir hücre-by-hücre olarak transkripsiyonel aktivite ve viral enfeksiyon arasında bir ilişki sağlar viral proteinler, bir hücre içi immün ile doğmakta olan RNA etiketleme birleştirir. Yazarlar, başarılı bir protokol RVFV suşu MP-12 6, Toscana virüsü (TOSV) 10 ile enfekte olan farklı MP-12 mutantları 7,8, 9, ve hücreler ile enfekte olmuş hücrelerin ile enfekte olmuş hücrelerin içinde transkripsiyonel aktiviteyi belirlemek için burada açıklanan kullandık. Burada tarif edilen protokol kolayca farklı virüs ile kullanılmak üzere adapte edilmiş ve belirli viral veya hücresel proteinlerin immünofloresan boyama içermek üzere modifiye edilebilir potansiyeline sahip olabilir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-ethynyl-uridine</td>
			<td>Berry &amp; Associates</td>
			<td>PY 7563</td>
			<td>dissolve in DMSO for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-mm round coverslips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actinomycin D (ActD)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9415</td>
			<td>dissolve in DMSO for 10 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2323</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8027</td>
			<td>dissolve in H2O for 100 mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-9542</td>
			<td>dissolve in H2O for 5 mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10270</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10277</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5960</td>
			<td>dissolve in H2O for 500 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper filter</td>
			<td>VWRbrand</td>
			<td>28333-087</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine (MW &ge; 70000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1274</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-1503</td>
			<td>dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. Olympus IX71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using click chemistry to measure the effect of viral infection on host-cell rna synthesis

Birçok RNA virüsleri hücresel savunma aşmak için bir araç olarak konakçı hücre transkripsiyonu inhibe etme yeteneği gelişmiştir. Bu virüslerin Çalışma için, enfekte olmuş hücrelerde transkripsiyonel aktivitesini ölçmek için bir hızlı ve güvenilir bir şekilde olması için bu nedenle önemlidir. Geleneksel olarak, transkripsiyon H-üridin gibi immün ile tespit takiben 5-bromouridine (BRU) gibi halojenlenmiş üridin analoglannın Otoradyografi veya sintilasyon sayımı veya birleşme ile tespit takiben 3 gibi radyoaktif nükleosidlerin ya da eklenmesi ile ölçülmüştür. BrU tespiti külfetli olabilir ve düşük hassasiyet muzdarip olurken radyoaktif izotopların kullanımı, ancak, özel ekipman gerektirir ve laboratuvar bir dizi mümkün değildir. Bir azid ve alkin bir bakır-katalize triazol oluşumu içerir yeni geliştirilen tıklayın kimya, şimdi hızlı ve highl sağlarBu iki yöntem y duyarlı bir alternatif. Click kimyası Yeni oluşan RNA önce bir floresan azid ile etiketin saptanması, ardından üridin analog 5-ethynyluridine (AB) eklenmesi ile etiketlenmiş olduğu, iki aşamalı bir işlemdir. Bu azidler görselleştirme için seçenekleri geniş bir yelpazede için izin, birkaç farklı fluorophores olarak mevcuttur. Bu protokol, MP-12 suşu tıklama kimya kullanılarak Rift Valley vebası virüsü (RVFV) ile enfekte edilmiş hücrelerde transkripsiyonel bastırma ölçmek için bir yöntem açıklanır. Aynı zamanda, bu hücrelerde viral proteinlerin ekspresyonu klasik immün hücre içi tarafından belirlenir. 8 detay akım sitometri ile transkripsiyonel bastırma ölçmek için bir yöntem ile 5 arasındaki adımları ise, 4 ayrıntılı floresan mikroskobu ile transkripsiyonel bastırma görselleştirmek için bir yöntem adım 1. Bu protokol, diğer virüsler ile kullanıma kolaylıkla adapte edilebilir.

RVFV bölgesinin NSS proteini (Bunyaviridae ailesi, cins Phlebovirus) 11 iki ayrı mekanizma ile konak hücre genel transkripsiyon inhibe eder: (i) kenetleme ile P62 arasında proteozomal degradasyonu teşvik, bazal transkripsiyon faktörü TFIIH 11 ve (ii) bir p44 alt birimi TFIIH 6 alt birimi. MP-12 suşu bir biyogüvenlik düzeyi 2 laboratuarda ele alınabilir ve diğer vahşi geçerlidir ABD&#39;de seçim aracı kural, dışında olduğundan RVFV MP-12 aşı suşu <...

Watch this Scientific Journal Video about Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis at JoVE.com

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Bu yöntem, Rift Valley vebası virüsü (RVFV) suşu, MP-12 ile enfeksiyon sonrası konakçı hücre transkripsiyon değişiklikleri ölçmek tıkırtı kimya kullanımı açıklanmaktadır. Sonuçlar floresan mikroskobu ile nitel görüntülendi veya akım sitometri ile kantitatif elde edilebilir. Bu yöntem, diğer virüs ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ana-Hücre RNA sentezi üzerinde Viral Enfeksiyon Etkisi Tedbir tıklayın Kimya Kullanımı

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

using-click-chemistry-to-measure-effect-viral-infection-on-host-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Görüntüleme.  University of Texas Medical Branch. Bu yöntem, Rift Valley vebası virüsü (RVFV) suşu, MP-12 ile enfeksiyon sonrası konakçı hücre transkripsiyon değişiklikleri ölçmek tıkırtı kimya kullanımı açıklanmaktadır. Sonuçlar floresan mikroskobu ile nitel görüntülendi veya akım sitometri ile kantitatif elde edilebilir. Bu yöntem, diğer virüs ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Video: Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recently there were several publications on the bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of the spectrum (400 nm-500 nm) is responsible for killing various pathogens1-5. The phototoxic effect of blue light was suggested to be a result of light-induced reactive oxygen species (ROS) formation by endogenous bacterial photosensitizers which mostly absorb light in the blue region4,6,7. There are also reports of biocidal effect of red and near infra red8 as well as green light9.
In the present study, we developed a method that allowed us to characterize the effect of high power green (wavelength of 532 nm) continuous (CW) and pulsed Q-switched (Q-S) light on Pseudomonas aeruginosa. Using this method we also studied the effect of green light combined with antibiotic treatment (gentamycin) on the bacteria viability. P. aeruginosa is a common noscomial opportunistic pathogen causing various diseases. The strain is fairly resistant to various antibiotics and contains many predicted AcrB/Mex-type RND multidrug efflux systems10.
The method utilized free-living stationary phase Gram-negative bacteria (P. aeruginosa strain PAO1), grown in Luria Broth (LB) medium exposed to Q-switched and/or CW lasers with and without the addition of the antibiotic gentamycin. Cell viability was determined at different time points. The obtained results showed that laser treatment alone did not reduce cell viability compared to untreated control and that gentamycin treatment alone only resulted in a 0.5 log reduction in the viable count for P. aeruginosa. The combined laser and gentamycin treatment, however, resulted in a synergistic effect and the viability of P. aeruginosa was reduced by 8 log's.
The proposed method can further be implemented via the development of catheter like device capable of injecting an antibiotic solution into the infected organ while simultaneously illuminating the area with light.

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

We show that a developed biomedical device involving continuous or pulsed visible laser based treatment that is combined with antibiotic treatment (gentamycin), results in a statistically significant synergistic effect leading to a reduction in the viability of P. aeruginosa PAO1, by 8 log's compared to antibiotic treatment alone.

Üzerinde görebilir Işık ve Gentamisin en Sinerjik Etkisi<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Mikroorganizmalar

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...