Este trabajo fue apoyado por fondos de la Medicina y la Investigación en Salud de subvención de la Ciudad de París, la Nacional de Francia conceder ANR-09-JCJC-0118-1, y el ERC Starting Grants del proyecto RNAvirusPopDivNVax no. 242719.

<ol>
	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li><li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase:+fidelity,+replication+speed,+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket.">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. 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L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance.">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li><li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect,+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds.">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li><li>Sierra, S., D&#225;vila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV).">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li><li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin:+implications+for+error+catastrophe.">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li></ol>

Elección de la línea celular. La eficacia de los análogos de base como ARN mutágenos se correlaciona con la captación relativa de diferentes tipos de células 11. Si la línea celular que normalmente se utiliza para el paso de virus ha demostrado ser resistente a la absorción de mutágeno o demasiado sensible (alta toxicidad celular), puede ser necesario el uso de otra línea celular que cumpla con estos requisitos y sigue siendo permisiva para la replicación viral. Una vez que la variante de la resistencia mutágeno es aislado, el resto de la caracterización se puede realizar en la línea original, de celda preferida. En nuestra experiencia, las células HeLa tome fácilmente el mutágeno; células BHK requerir hasta 10 veces las concentraciones más altas y las células Vero son refractarios a la captación de mutágeno. Elección de mutágeno. Al tratar de aislar variantes fidelidad por el tratamiento mutagénico, la probabilidad de éxito aumenta si hay más de un tipo de mutágeno se utiliza. Mutágenos analógicas de estructura diferente, que son erróneamente incorporado en el genoma durante la replicación predominantemente inducirá resultar en un subconjunto específico de mutaciones en los ciclos de replicación posterior: el tratamiento con ribavirina favorece GtoA y mutaciones CtoU de transición de 12, 5-azacitidina tiene una tendencia similar, con la Además de CtoG y transversiones GtoC 13, 5-fluorouracilo preferentemente induce transiciones Atog y UtoC 14. Por otra parte, la mayor concentración de Mg 2 + o Mn 2 + se puede complementar con el medio para aumentar la frecuencia de mutación de los virus ARN total sin el sesgo se ha descrito anteriormente 12. En función de las secuencias de codones del virus, y los cambios codón necesaria para generar una variante de la fidelidad, algunas de estas condiciones favorecen la aparición de esta variante respecto a otros. Para la mayor fidelidad G64S poliovirus y el virus Coxsackie A372V, el tratamiento con ribavirina más fácilmente seleccionados para las variantes debido a la transición Atog requerido en el sitio codón corresponde a las mutaciones sobre todo generada por este ribavirina. MOI vs tamaño de la población. En la virología, los protocolos para la infección por el cultivo de tejidos preste especial atención a la multiplicidad de infección (MOI), para evitar la acumulación de partículas defectivas interferentes (MOI baja) o para promover la recombinación entre el virus (de alto MOI), para ejemplo. Para seleccionar los eventos aparición en serie de pases, también es importante tener en cuenta el tamaño de la población de virus. Desde el mutante resistente inicialmente existe en baja frecuencia, lo mejor es la transferencia de tan gran tamaño de la población como sea posible de un pasaje a la siguiente (10 5 -10 6 virus, por ejemplo) para evitar la pérdida de estas variantes emergentes en cada paso. Ampliar el tamaño del pozo o frasco (número de células infectadas) puede ayudar a minimizar el aumento de MOI, si esto es motivo de preocupación. Por otro lado, para los experimentos en que se la sensibilidad de un virus mutágeno a prueba, la infección MOI baja se realiza con el fin de aumentar el número de ciclos de replicación que ocurren en el experimento y para evitar rescate de los genomas de mutagénesis por los genomas mayor aptitud a través de complementación en cooperación con las células infectadas. Esto es importante porque las mutaciones generadas en los genomas de la progenie durante la primera ronda de replicación no se detectan inmediatamente. La mayoría de estos RNAs mutagenizadas todavía se empaquetan en viriones. Es en la siguiente ronda de la infección que las mutaciones letales presentes en estos genomas se traducirá en un ciclo de replicación abortados, y la reducción en el título de virus. Puede que sea necesario para permitir que varias rondas de acumulación de mutaciones antes de que un efecto significativo de la mutagénesis letal se observa. Por último, si más de la serie de pasaje en la presencia de mutágenos, los títulos de virus siguen bajando hasta la extinción, el investigador debe tratar de pases del virus en forma gradual las cantidades crecientes de mutágeno (a partir de una concentración muy baja). El aislamiento y la generación de la copia del ARN mutágeno resistente a partir del ARN mutágeno resistente a la población. Mutágenos ARN presentar múltiples mutaciones al azar para cada genoma, pero la selección de resistencia sólo se enriquecen (y fijar la secuencia consenso) la mutación de resistencia. Para identificar esta mutación, la secuencia de la población resistente mutágeno (consenso de la población) y los virus no individual. Por lo tanto, las mutaciones individuales, aleatoria creada por el mutágeno no se detectan en la secuencia, sólo las mutaciones que dan lugar a cambios en el consenso tras la selección, se encuentran. En nuestra experiencia, sólo identificar a uno o dos cambios secuencia de consenso. Una vez que la población resistente mutágeno se obtiene y la mutación de resistencia es identificado, es necesario generar una acción más pura de esta variante. Anteriormente, se describe un procedimiento de purificación en placa. Por otra parte, si el virus de interés no produce placas fácilmente identificables, la variante deseada puede ser PurifIED por dilución límite. Este enfoque es esencialmente un TCID 50 en formato de 96 pocillos, donde se diluye el stock de virus de manera que menos del 50% de los pozos están infectadas. El uso de este dilución, el mismo enfoque que el anterior se toma, en el aislamiento de hasta 10 variantes individuales y confirmar sus secuencias. Como se ha mencionado, en el mejor de los casos, un clon infeccioso de cDNA de la cepa del virus está disponible. El aislamiento de la variante tanto, no sería necesario. En nuestra experiencia, las variantes de la fidelidad son el resultado de un solo sustituciones de aminoácidos y por lo tanto se pueden generar utilizando kits simple, mutagénesis comercializado como QuikChange (Agilent). Una opción secundaria es el uso de un clon de ADNc de una cepa estrechamente relacionados. Sin embargo, si una cepa relacionada se utiliza, le recomendamos que emplee tanto este enfoque y el aislamiento del virus (por ejemplo, purificación en placa), ya que hemos encontrado que la misma mutación altera la fidelidad de dos virus estrechamente relacionados, no necesariamente tendrá el mismo efecto. La fidelidad y la replicación. Selección de ARN variantes resistentes mutágeno han dado como resultado el aislamiento de los mayores y menores las variantes de la fidelidad con características de crecimiento que son similares a sus homólogos de tipo salvaje 4,12,15. En la actualidad, la relación entre las tasas de actividad de la polimerasa y la fidelidad no se entiende completamente. Los estudios in vitro bioquímicos utilizando ARN polimerasa purificada han demostrado que el aumento de las variantes de la fidelidad tiene un ritmo más lento de procesamiento, mientras que la menor fidelidad variantes tienden a tener un procesamiento más rápido 1-3,12. En cultivo de tejidos, estas diferencias no son evidentes, lo que sugiere que la disponibilidad de recursos, en lugar de la cinética intrínseca de la actividad de la polimerasa, es el paso limitante. Si la variante de la fidelidad se replica con una cinética que no son significativamente diferentes de tipo salvaje, y luego una comparación de sus frecuencias de mutación puede ser hecho directamente. Si un cambio muy significativo en la cinética de replicación en vigor, los datos deben ser normalizados para dar cuenta de las diferencias cinética, por ejemplo mediante la comparación de los virus que han sufrido el mismo número de ciclos de replicación. En nuestra experiencia, aunque no hubo diferencias significativas en un solo paso cinética de crecimiento se observaron entre los de tipo natural y de alta fidelidad de las variantes, se observó que el aumento de las variantes de la fidelidad constante título más alto (a menos de 1 log) en comparación con el tipo salvaje, pero que hacen un poco menos de ARN (dentro de el mismo orden de magnitud), lo que sugiere que el genoma que producen contienen menos mutaciones y, por tanto, más infeccioso. Preparación de la muestra y la secuencia. Para todos los pasos de estos protocolos, es imperativo que los de alta fidelidad, corrección de pruebas, las enzimas se utilizan para la PCR y RT-PCR para limitar la introducción de mutaciones adicionales, ya que no se puede distinguir de las mutaciones biológicamente relevantes. Es fundamental que las poblaciones de virus para ser comparados han sido preparados en las mismas condiciones (el número de pases, medio de cultivo de tejidos, la temperatura, el método de extracción de RNA, RT-PCR protocolos, etc) También es importante asegurarse de que suficiente material de partida fue obtenido de la extracción de RNA de tal manera que una fuerte banda es generado por RT-PCR. Una dilución 1 / 100 de la muestra de ARN también debe dar una detectable por RT-PCR banda, lo que indica que la muestra contiene un número suficiente de moléculas de ARN para evitar el sesgo de representación (amplificación del genoma del mismo en varias ocasiones). Dado que la frecuencia de mutación es una distribución, es de esperar que los mismos valores se obtendrán independientemente del tamaño de la población, siempre que el sesgo mencionado no está ocurriendo. Como muestra la Figura 6 muestra, a 10 5 veces la dilución de un stock de virus ofrece una frecuencia de mutación que no es significativamente diferente de la población reproductora. Hasta que las condiciones óptimas para TopoTA clonación se encuentran, confirmar la presencia de inserciones después de la evaluación azul / blanco, por PCR colonia antes de la secuenciación. Como control de ruido de mutación (mutaciones introducidas por la RT-PCR y secuenciación), clonar un producto de PCR de un plásmido teniendo la misma secuencia viral y / o la clonación de la secuencia y los productos de RT-PCR in vitro de ARN transcrito correspondiente al genoma del virus (se conscientes de que diferentes enzimas de transcripción in vitro tienen diferentes tasas de error y no puede dar información útil sobre el error de fondo real en el procedimiento). Algunas secuencias de virus pueden ser tóxicos para las bacterias, por lo que es importante verificar esto antes de decidir sobre la región del genoma viral para ser secuenciados para la frecuencia de mutación. En el análisis de secuencias obtenidas por TopoTA, tenga en cuenta que cada clon debe contener un solo insertar / secuencia. Si un pico doble, lo cual sugiere una población mixta, es posible que dos colonias de bacterias vecinos fueron seleccionados. También es posible, aunque muy poco probable dada la baja las frecuencias de mutación en la replicación bacteriana, que la mutación se presentó durante la amplificación del plásmido en el cultivo de bacterias. En la placa purified poblaciones, un doble pico puede representar placas superpuestas, o un virus que está adquiriendo una nueva mutación o la reversión de una mutación durante el desarrollo de la placa. Sea consistente y decidir sobre la conveniencia de contar o no contar con estas mutaciones. Por último, tenga en cuenta que las frecuencias de mutación utilizados aquí son valores relativos. Sólo son válidas en la comparación de las poblaciones de virus cultivados en las mismas condiciones, y la secuencia en la misma región! No deben tomarse como valores absolutos de la tasa de mutación, o la frecuencia de mutación del genoma en su conjunto. Sin embargo, cuando las condiciones son controladas, es posible hacer comparaciones reproducible y cuantitativa de las diferencias en la distribución y la frecuencia de mutación.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> ribavirina </td><td> Sigma </td><td> R9644-10MG </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorouracilo </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacitidina </td><td> Sigma </td><td> A2385-100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100 ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> El azul tripán </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA kit de clonación </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> QuikChange kit de mutagénesis </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Si un clon infeccioso de cDNA está disponible </td></tr><tr><td> 96 y kit minipreparación </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporation </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> O el software de alineación de otros </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

Uso de los virus de ARN polimerasas de ARN dependiente de ARN para replicar su genoma. La tasa de error intrínsecamente alta de estas enzimas es un gran contribuyente a la generación de diversidad de la población extremo que facilita la adaptación y la evolución del virus. Cada vez más evidencia muestra que las tasas de error intrínseco, y las frecuencias de mutación resultante, de los virus de ARN puede ser modulada por sutiles cambios en los aminoácidos de la polimerasa viral. Aunque existen ensayos bioquímicos para algunos ARN polimerasa viral que permiten medición cuantitativa de la incorporación de la fidelidad, aquí se describe un método simple de medir las frecuencias de mutación de los virus de ARN que ha demostrado ser tan exactos como los enfoques bioquímicos en la identificación de mutaciones alteran la fidelidad. El enfoque utiliza técnicas convencionales virológica y la secuencia que se pueden realizar en los laboratorios de la mayoría de la biología. Basándonos en nuestra experiencia con una serie de virus diferentes, se han identificado los principales pasos que se deben optimizar para aumentar la probabilidad de aislar variantes fidelidad y la generación de datos de significación estadística. El aislamiento y caracterización de las mutaciones alteran la fidelidad puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la estructura y la función de la polimerasa 1-3. Además, estas variantes de la fidelidad pueden ser herramientas útiles en la caracterización de los mecanismos de adaptación del virus y la evolución de 4-7.

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

El presente artículo describe los pasos necesarios para aislar y caracterizar las variantes de ARN polimerasa fidelidad de los virus de ARN, y cómo utilizar los datos de frecuencia de mutación para confirmar los cambios en la fidelidad de cultivo de tejidos.

El aislamiento de las variantes de los virus de ARN de fidelidad y caracterización de la frecuencia de mutación de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

29.4K vistas.  Institut Pasteur. El presente artículo describe los pasos necesarios para aislar y caracterizar las variantes de ARN polimerasa fidelidad de los virus de ARN, y cómo utilizar los datos de frecuencia de mutación para confirmar los cambios en la fidelidad de cultivo de tejidos.

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RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Investigación

Inmunología e Infección

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Generación de variantes de Escape de neutralizar anticuerpos Monoclonal del Virus de la Influenza

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identificación de la codificación y las clases de ARN no codificante expresado en cerdos sangre entera

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Proyección de imagen confocal de ARN bicatenario y receptores de reconocimiento de patrón en la infección por Virus de ARN de sentido negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...