The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.

1. Química Acoplamiento de proteínas de perlas de polímero <ol><li> Acoplamiento direccional tiol-amina Nota: Este protocolo es adecuado para el acoplamiento de la cisteína que contiene proteínas para funcionalizada con amina perlas de polímero, utilizando sulfosuccinimidilo 4- (p -maleimidophenyl) butirato (sulfo-SMPB) como agente de reticulación (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> Figura 1. La reticulación estrategia utilizada para el acoplamiento tiol-amina direccional de las proteínas a perlas de polímero. Perlas de poliestireno modificadas con amina se activan con sulfo-SMPB. La maleimida reacciona con cisteínas gratuitas para direccionalmente proteínas par de perlas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol><li> Preparación de reactivos: <ol><li> Preparar PBS (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) y autoclave. </li&gt; <li> Preparar una acción 100x (0,5 M o 287 mg / ml en PBS) de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina) inmediatamente antes de su uso. </li><li> Preparar un 5x de stock (10 mM o 4,58 mg / ml en dH 2 O) de sulfo-SMPB inmediatamente antes del uso. </li><li> Preparar un 10x (500 mM o 88 mg / ml en PBS, pH 7,0) de cisteína inmediatamente antes del uso. </li></ol></li><li> La activación del grano: <ol><li> Mezclar la suspensión de perlas por inversión suave y transferir la cantidad requerida de suspensión de perlas (por ejemplo, 12 ml) en un tubo de 1,5 ml estéril que contiene 1 ml de PBS estéril, pH 7,0. </li><li> Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para lavar los granos y pellets por centrifugación en una microcentrífuga (2 min a 16.000 xg). </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descarte. Resuspender el sedimento de perlas en 1 ml de PBS estéril fresco y repetir la etapa de lavado. Resuspender el sedimento de perlas en 0,8 ml de PBS. </li><li> Añadir 200 ml de recién preparada 10 mM sulfo-SMPB, para dar una concent definitivaración de 2 mM. </li><li> Se incuba la suspensión de microesferas durante 1 hora a 25 ° C en una rueda giratoria. </li></ol></li><li> Reducción de Proteínas: <ol><li> Durante el período de incubación de la etapa de activación, preparar la proteína para la siguiente etapa de acoplamiento para que pueda ser inmediatamente añadió a las perlas activadas. Nota: Aunque este paso de reducción no siempre es necesaria para la GST (glutatión S-transferasa) proteínas de fusión, se recomienda para asegurar una alta eficiencia de acoplamiento. <ol><li> Comprobar la concentración de proteína, y ajustarlo a la concentración final requerida para la reacción de acoplamiento. Nota: proteína de 6 mM en PBS, y un volumen de 1 ml se utilizan generalmente. </li><li> Añadir TCEP acciones para dar una concentración final de 5 mM. Incubar la solución durante 30 min a RT. Nota: La mezcla de reacción se puede utilizar directamente para la siguiente reacción de acoplamiento. </li><li> Conserve una pequeña cantidad (unos pocos ml) de la solución de proteína para determinar la pro<html> concentración de proteína y el cálculo de la eficiencia de acoplamiento (véase la sección 2). </li></ol></li></ol></li><li> Proteína etapa de acoplamiento: <ol><li> Sedimentar las perlas activadas mediante centrifugación (2 min, 16.000 xg en una microcentrífuga), y lavar el pellet una vez en 1 ml de PBS estéril fresco. </li><li> Resuspender el precipitado en la solución de proteína preparada (por ejemplo, 1 ml), para dar la concentración deseada de proteína. Nota: La concentración de proteínas durante la etapa de acoplamiento dependerá de la eficacia de acoplamiento medio (ver sección 2 para la determinación de la eficacia de acoplamiento) y la densidad de acoplamiento deseado (como se calcula en 1.1.4.3). La eficiencia es de aproximadamente 85% y de la deseada concentración final 5 mM en la suspensión 10x del grano, por lo que la concentración de proteína durante la etapa de acoplamiento debe ser de aproximadamente 6 mM. </li><li> Calcular la densidad de acoplamiento usando la siguiente fórmula: jpg &quot;/&gt; donde densidad de acoplamiento ρ c [número de moléculas de proteína / nm 2], concentración de proteína concentrada de proteínas [mg / ml], proteína M w peso molecular de proteínas [Da], concentración concentrado grano del grano [número de cuentas / L], diámetro del grano d [nm 2] El número de Avogadro </li><li> Utilice la densidad de acoplamiento para calcular la separación media ligando: <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li> Se incuba la suspensión de proteína-grano durante 2 horas a 25 ° C en una rueda giratoria. Nota: Algunosproteínas pueden no ser estable a temperatura ambiente. En estos casos, la reacción puede llevarse a cabo a 4 ° CO / N. </li><li> Desactivar restantes grupos activados en las perlas mediante la adición de cisteína de stock a una concentración final de 50 mM y se incuba la suspensión durante 30 min a 25 ° C en una rueda giratoria. Sedimentar las perlas por centrifugación (2 min, 16.000 xg en una microcentrífuga). </li><li> Mantenga el sobrenadante para determinar la concentración de proteínas y el cálculo de la eficiencia de acoplamiento (véase la sección 2). </li><li> Lavar el sedimento de perlas dos veces con 1 ml de PBS y se resuspenden en 1 ml de PBS fresco para dar el producto final. Nota: El protocolo anterior será típicamente dar 1 ml de proteína acoplada, a una concentración final de proteína de 5 mM, que se puede utilizar como un stock de 10x para experimentos posteriores (véase la sección 3). </li><li> Para proceder a la sección 3 del protocolo, trabajar con 100 ml / ml de grano de valores, o a una concentración final de 500 nM de proteína. Nota: Un buen punto de partida para este procedure será de 2 × 10 12 perlas / ml, lo que resulta en una densidad de acoplamiento promedio de 3 × 10 -4 proteínas / NM 2 o un espaciamiento promedio de 57 nm sobre una perla de 2 mm de diámetro. </li></ol></li></ol></li><li> Acoplamiento direccional tiol-carboxi Nota: Este protocolo es adecuado para el acoplamiento de cisteína que contiene proteínas a perlas de poliestireno funcionalizado con carboxilo. El resto carboxilo se activa por primera vez el uso de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) / N-hidroxisuccinimida (NHS), amina modificada y luego reticulado usando sulfo-SMPB (Figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> Figura 2. La reticulación estrategia utilizada para el acoplamiento tiol-direccional carboxilo de las proteínas a perlas de polímero. Perlas de poliestireno carboxilado son activados primero con EDC y modificados con NHS para formar un éster de NHS-semi-estable. Con posterioridad amina de acoplamiento de etilendiresultados de amina en un grupo amina libre, que reacciona con sulfo-SMPB. Maleimida activa perlas entonces pueden reaccionar con cisteínas gratuitas para direccionalmente proteínas par de perlas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol><li> Preparación de reactivos: <ol><li> Preparar PBS (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) y autoclave. </li><li> Preparar una acción 100x (0,5 M o 287 mg / ml en PBS,) de TCEP inmediatamente antes del uso. </li><li> Preparar una 10x de stock (20 mM, o 4 mg / ml en PBS) de EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) inmediatamente antes de su uso. </li><li> Preparar una 10x de stock (50 mM, o 6 mg / ml en PBS) de NHS (N-hidroxisuccinimida) inmediatamente antes de su uso. </li><li> Preparar un 5x de stock (10 mM o 4,58 mg / ml en dH 2 O) de sulfo-SMPB inmediatamente antes del uso. </li><li> Preparar un 10x (500 mM o 88 mg / ml en PBS, pH 7,0) de la cisteína inmediatamente buso ntes. </li></ol></li><li> La activación del grano: <ol><li> Mezclar la suspensión de microesferas por inversión suave y transferir la cantidad requerida de suspensión de perlas (por ejemplo, 12 ml) en un tubo de 1,5 ml estéril que contiene 1 ml de PBS estéril, pH 7,0. </li><li> Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para lavar los granos y pellets por centrifugación en una microcentrífuga (2 min a 16.000 xg). </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descarte. </li><li> Resuspender el sedimento de perlas en 1 ml de PBS estéril fresco y repetir la etapa de lavado. </li><li> Resuspender el sedimento de perlas en 0,8 ml de PBS. </li><li> Añadir 100 ml de 10x EDC social (2 mM concentración final) y de inmediato 100 ml de solución madre 10x NHS (5 mM concentración final) para la suspensión de perlas. </li><li> Se incuba la suspensión de microesferas durante 30 min a 25 ° C en una rueda giratoria. </li><li> Lavar perlas una vez en 1 ml de PBS y se resuspenden en 0,8 ml de PBS estéril fresco. </li><li> Añadir 200 ml de etilendiamina, y incUbaté la suspensión de microesferas durante 1 hora a 25 ° C en una rueda giratoria. </li><li> Lávese las cuentas una vez con PBS 1 ml y resuspender las perlas en 0,8 ml de PBS fresco. </li><li> Proceda de la sección 1.1.2.4 (activación de cuentas con sulfo-SMPB) como se describe en la sección 1.1.2 y seguir el resto del protocolo descrito en la sección 1.1 (acoplamiento direccional Tiol amina). Realizar preparación de proteína y los pasos de acoplamiento de proteínas de una manera idéntica a las descritas en la sección 1.1. Nota: La eficacia de acoplamiento típica usando este protocolo es ligeramente inferior en comparación con la sección 1.1, por lo tanto, ajustar la concentración inicial de proteína en consecuencia para conseguir la misma densidad de acoplamiento (75% aprox.). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Determinación de la eficiencia de acoplamiento Nota: Para determinar la concentración de proteína, utilizar Bradford Reactivo 10 y ensayos colorimétricos como sigue: <ol><li> Invierta suavemente Bradford reactivo al correo<html> Nsure homogeneidad del reactivo. </li><li> El uso de una solución madre de BSA 10 mg / ml, se preparan patrones de proteínas que cubren las concentraciones a partir de 0,1 a 1,5 mg / ml de BSA en tampón. </li><li> Añadir 250 ml de reactivo de Bradford a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Preparar suficientes pozos para todas las muestras, estándares de proteína y controles negativos (tampón solamente). </li><li> Añadir 5 ml de muestra de proteína (estándares de proteína o tampón, para el control negativo) con el reactivo en la placa de 96 pocillos. </li><li> Incubar la placa en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Medir la absorbancia a 595 nm usando un lector de placas. </li><li> Generar una curva estándar de la concentración de BSA en comparación A595 nm y utilizar esto para determinar concentraciones de proteína en las muestras iniciales y el sobrenadante. </li><li> Calcular la concentración de proteína acoplada como sigue: <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li> Calcular la eficiencia de acoplamiento como: 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol> 3. El uso de acoplado Bead Adhesinas en ensayos de competición <ol><li> Preparación: <ol><li> Semilla de 1 ml por pocillo de células Hela a una concentración de 150.000 células / ml en una placa de 24 pocillos el día antes de que el ensayo de competición, para permitir que las células alcanzan aproximadamente 80% de confluencia antes de iniciar el experimento. </li><li> Configure cada condición experimental por triplicado. Incluya pozos para controles negativos (sin bacterias añadidas durante ensayos de competición), controles positivos (perlas de control junto a la fusión etiqueta única añadida durante ensayos de competición) y controles de lisis (para experimentos de citotoxicidad). </li><li> Inocular un LB (MLB) cultivo de 5 ml marina con una colonia fresca de V. parahaemolyticus y crecer O / N a 30 ° C, agitando. </li><li> Preparar suficiente MAM grano acoplados, como se describe en el apartado 1. (Coupling). Permitir 100 ml de 10x grano Stock por pocillo. </li></ol></li><li> Ensayo de competición: <ol><li> En el día de la competención experimento, medir el diámetro exterior 600 del cultivo bacteriano. </li><li> Preparar los medios de comunicación la infección mediante la dilución de cultivos bacterianos en DMEM sin color y sin aditivos, pre-calentado a 37 ° C, que contiene un 10% de suspensión / v del grano v (ya sea adhesina acoplados a perlas o cuentas de control), para dar una MOI de 10. Prepare 1 ml / pocillo y 10-20% exceso de volumen por muestra. Nota: Para las condiciones antes mencionadas (placas de 24 pocillos, V. parahaemolyticus, MOI 10), el volumen necesario de la cultura de O / N que se añade por pozo (ml / ml) se calcula como 3 / OD 600 de la cultura. Por ejemplo, 1 ml de medio de infección se suelen contener 100 ml suspensión de perlas, unos pocos ml de cultivo bacteriano y se efectuarán hasta 1 ml con color, DMEM sin suplementar. </li><li> Eliminar el medio viejo de los pocillos y lavar las células Hela cultivadas mediante la adición de 1 ml de PBS estéril pre-calentado a 37 ° C a cada pocillo. </li><li> Retire PBS y añadir 1 ml de medio de infección por pocillo. También establecer controles, añadiendo soluciones containing bolas de control y bacterias (control positivo) o perlas de adhesina y no hay bacterias (controles negativos), o DMEM que contenía Triton X-100 (control de lisis, sólo es necesaria para mediciones de citotoxicidad) 0,1%. </li><li> Incubar la placa en un incubador de cultivo de tejidos a 37 ° C durante la cantidad de tiempo deseada (por ejemplo, 4 hr para las mediciones de citotoxicidad o 1 hr para las mediciones de adhesión). Nota: Tanto la adhesión bacteriana y la citotoxicidad en células huésped se pueden utilizar como-outs para leer la eficacia de la inhibición. Si los puntos de tiempo de las mediciones de citotoxicidad y de adhesión coinciden, ambos ensayos se pueden realizar utilizando muestras del mismo pozo, ya que la citotoxicidad se determina usando los ensayos de sobrenadante de cultivo y de fijación utilizan muestras derivadas de la capa de células restante. </li></ol></li><li> Mediciones de citotoxicidad: <ol><li> En los puntos de tiempo indicados (por ejemplo, después de la infección de 4 horas), retire tres veces 200 ml de cada 24 pocillos y trasladouna placa de 96 pocillos. </li><li> Haga girar las placas de 96 pocillos a 1.500 xg, 5 min y transferencia de 100 ml de cada pocillo en una placa de 96 pocillos fresco. Añadir 100 ml de los medios de comunicación utilizados durante la infección experimentos a pozos frescos de la placa de 96 pocillos por triplicado (éstos serán utilizados como espacios en blanco). </li><li> Llevar a cabo el ensayo deshidrogenasa (LDH) liberación de lactato utilizando un kit de detección de citotoxicidad LDH y siguiendo las instrucciones del fabricante. <ol><li> En pocas palabras, el cálculo de la cantidad de reactivo necesario en incrementos de 25 (por ejemplo, si 62 muestras se van a medir, conforman mezcla de reactivos suficientes para 75 etc.). </li><li> Por ejemplo, para 100 muestras, mezclar 11,25 ml de reactivo A con 250 l de reactivo B. Invertir, no hacer vórtice para evitar la formación de espuma. </li><li> Ponga la mezcla en un depósito para ser capaz de pipetear con una pipeta multicanal. Añadir 100 l de mezcla de reactivos a cada muestra. </li><li> Incubar la placa a temperatura ambiente y leer la absorbancia a 490 nm en un lector de placas a 10, 20, 30 min. </li&gt; <li> Analizar el conjunto de datos para el que la absorbancia de la muestra de control de lisis es alto, pero aún dentro del rango lineal del lector de placas (por lo general, 2-3 unidades de absorbancia). </li><li> Expresar los resultados como% de citotoxicidad, utilizando la siguiente fórmula para la conversión: <img alt="Ecuación 5" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li> Medición de la adhesión bacteriana: <ol><li> En los puntos de tiempo indicados (por ejemplo, después de la infección de 1 hora), quitar el medio de la capa de células. </li><li> Lave bien la capa de células con estéril, PBS precalentado (al menos 3-4 lavados de 1 ml de PBS cada uno) para eliminar cualquier célula-un adjunto. </li><li> Células anfitrionas Lyse mediante la adición de 1 ml de una 1% v / v estéril Triton X-100 en PBS solución por pocillo. Incubar la placa a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Pipetear cada muestra arriba y abajo varias veces antes de transferir el contenido de cada pocillo para separar tubos de 1,5 ml. Preparar 10 veces diluciones seriadas de las muestrasen PBS estéril (por ejemplo, utilizar 100 ml de muestra y 900 ml de PBS). </li><li> Placa 100 ml de cada muestra en agar MLB y difundir el uso de un esparcidor de células. Optimizar que diluciones a la placa en función de las cepas bacterianas y punto de tiempo. Nota: Para la configuración experimental descrito, 10 5 o 10 6 diluciones dan un número adecuado de UFC. </li><li> Incubar las placas a 37 ° CO / N y enumerar las bacterias por recuento de colonias. </li></ol></li></ol>

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	<li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction.">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens.">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li><li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+(MAM7)+protein+and+its+host+cell+ligands.">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li><li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules.">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li><li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains.">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li><li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin.">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li><li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function.">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnabout+is+fair+play:+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent.">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li><li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel.">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

En este documento, se describen dos protocolos, que se pueden utilizar para las proteínas que contienen tiol par de amina o perlas de poliestireno modificado con carboxilato, respectivamente. Debido a la facilidad del procedimiento, el acoplamiento tiol-amina es preferible, pero dependiendo de la especificación del grano deseado (diámetro, propiedades de fluorescencia), el uso de perlas de amina funcionalizada puede no ser posible y por lo tanto hemos incluido un protocolo que convertirá el carboxilato - en un resto de amina para dar el investigador la mayor flexibilidad posible en la elección de andamio. Aunque tanto tiol-amina y el trabajo de acoplamiento tiol-carboxilo para cualquier cisteína que contiene proteína, el acoplamiento direccional (es decir, la inmovilización de la proteína por su extremo N-terminal, imitando la presentación en superficie) requiere una proteína sin restos de cisteína, que se produce como una fusión GST proteína, o que contiene un único residuo de cisteína terminal de introducido por mutagénesis dirigida al sitio. Si están contenidas múltiples cisteínas reactivasdentro de la proteína, esto dará lugar a la inmovilización aleatoria que puede impedir la función de proteínas. Muchos adhesinas bacterianas no contienen cisteínas naturalmente. Para otros, estos pueden ser eliminados por mutagénesis dirigida al sitio, aunque esto requeriría ensayos extensos para asegurar la estructura y función nativa se retienen en el mutante. Para las proteínas de fusión GST, GST-tag purificado acoplado a perlas puede ser utilizado como un control negativo adecuado. El uso de cuentas no acoplados como control se debe evitar, ya que a menudo tienen una mayor tendencia a agruparse o adherirse a las células de forma no específica. Una versión simplificada del protocolo 1.2., Usando sólo EDC, se puede utilizar para proteínas par de perlas de polímero funcionalizado con carboxilo, sin embargo en este caso el acoplamiento tiene lugar a través de aminas primarias en la proteína y por lo tanto no garantiza acoplamiento direccional. TCEP como agente reductor no debe ser reemplazado con otros agentes reductores disponibles comercialmente y usados ​​comúnmente, tales como dithiothreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol (BME), como los tioles contenidas dentro de ellos competirán con acoplamiento de proteínas en la etapa de acoplamiento tiol-maleimida. PBS se puede sustituir por otros tampones, pero con las siguientes consideraciones: Buffers no puede contener aminas primarias (SO tampones Tris-que contienen no son adecuados). El uso de tampones que contienen (&lt;10 mm) muy bajas concentraciones de sal conduce a talón aglutinación y también debe ser evitado. Pureza proteína es también un factor importante a considerar durante este procedimiento, y para conseguir datos de alta calidad, deben utilizarse proteínas puras. Rutinariamente purificar proteínas en varios pasos, incluyendo al menos una etapa de purificación de afinidad y filtración en gel, pero en algunos casos cromatografía de intercambio iónico se hace como un tercer paso. Como resultado, la pureza de las proteínas utilizadas para el acoplamiento es por lo general 90% o superior, como se juzga por SDS-PAGE. Se recomienda para determinar las concentraciones de proteína tanto en la mezcla de reacción inicial, así como de THe sobrenadante después de la finalización de la reacción. Esto ayudará a determinar la concentración aparente de la proteína del grano de acoplamiento, y por lo tanto la densidad de acoplamiento. Determinación de ambos valores también permitirá el cálculo de la eficiencia de acoplamiento. Esto puede ser tomado en cuenta cuando se prepara la solución de proteína inicial en reacciones subsiguientes, para lograr la densidad y la concentración de acoplamiento final deseado. Reactivo de Bradford es particularmente adecuado para la determinación de la concentración de proteína antes y después de la reacción de acoplamiento, como ninguna de las sustancias en la reacción interfiere con la formación de complejo de colorante a las concentraciones utilizadas. Si las concentraciones de proteína inferiores se van a utilizar, este método puede tener que ser sustituido por un método de detección más sensible, sin embargo tiene que ser pagado atención al hecho de que tiene que ser compatible con las sustancias contenidas dentro de la reacción de acoplamiento. También se recomienda el uso de reactivos recién preparados y manipular reactivos en polvo con cuidado (por ejemplo, almacenaren un recipiente sellado y usar perlas de sílice, para evitar los reactivos dibujo de humedad), ya que la calidad de los reactivos puedan influir en la eficiencia de acoplamiento. Si la eficacia de acoplamiento es menor de lo esperado, los posibles remedios incluyen el aumento de las concentraciones iniciales de cuentas y proteínas. Si se utilizan concentraciones más altas, la concentración de reactivos de acoplamiento tiene que ser aumentada proporcionalmente para asegurar suficiente exceso molar. Modificación de las concentraciones de grano / proteína suele ser una mejor paso hacia la optimización en lugar de aumentar los tiempos de reacción. Dado que los protocolos para el acoplamiento del grano son largos, que comúnmente preparamos un gran lote de material. Las alícuotas de la suspensión pueden congelar complemento en nitrógeno líquido y se almacenaron a -20 ° C durante varios meses. Alícuotas descongeladas no deben volver a congelarse y deben mantenerse a 4 ° C y utilizarse dentro de 1-2 días. Sin embargo, esto puede variar con la naturaleza y la estabilidad de la proteína usada como debe ser probado en un pequeño lote inicialmente. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; adhesinas acoplados-Bead se puede utilizar para muchas aplicaciones, como veremos a continuación. Este protocolo describe un ensayo que se utiliza comúnmente para medir la inhibición de la citotoxicidad y de unión mediada por patógeno bacteriano en células huésped. El ensayo se realiza comúnmente para medir la capacidad de MAM de talón de acoplamiento para inhibir competitivamente la infección de células epiteliales HeLa con la comida de mar de patógenos transmitidos por Vibrio parahaemolyticus, utilizando ya sea una disminución de la unión bacteriana a las células huésped o se reduce la citotoxicidad como una lectura de salida . En ambos casos, los ensayos de preparación y de competencia siguen el mismo protocolo. Dependiendo de la lectura, diferentes cepas de V. parahaemolyticus se están utilizando: la cepa citotóxico POR1 se utiliza para las mediciones de citotoxicidad, mientras que la cepa no citotóxico POR2 se utiliza para medir la adhesión bacteriana, ya que la muerte celular y desprendimiento celular compromete el procedimiento para la cuantificación de bacterias adheridas. Inicialmente, compeexperimentos compe- se establecieron como un protocolo por etapas, donde las células anfitrionas fueron pre-incubadas con los granos antes de la adición de bacterias. Para V. parahaemolyticus y las especificaciones de talón utilizados (2 micras perlas acopladas a MAM7), ambos talones y las bacterias se pueden añadir al mismo tiempo sin cambios en la citotoxicidad resultante. Es decir, en esta configuración experimental, perlas de outcompete bacterias para la unión de la célula huésped. Dependiendo de la especie bacteriana y de talón geometría utilizada, puede haber buenas razones para mantener la adhesión del grano y la infección bacteriana como dos pasos separados. Por ejemplo, para infectar células con bacterias no móviles, las placas se centrifugan comúnmente después de la adición de los medios de infección. Sin embargo, la centrifugación de las placas que contienen suspensiones de perlas debe evitarse, ya que esto conduce a una distribución muy irregular de los granos en la capa de células. Si se utilizan tamaños de partículas más pequeñas, cuentas tardarán más en asentarse en la superficie celular, en cuyo caso sutiempo ficiente se debe permitir para reborde de unión antes de la infección. Cuando se utiliza la adhesión bacteriana como leer, las muestras deben ser tomadas en momentos en que las células huésped no se dañen de manera significativa por la cepa infectante, como desprendimiento de células y lisis puede comprometer la cuantificación de bacterias adheridas. En lugar de enumerar la adhesión bacteriana por dilución en placas, muestras, alternativamente, se pueden procesar para formación de imágenes (Figura 5). En este caso, las células de cultivo de tejidos deben ser sembradas en cubreobjetos de vidrio, en vez de directamente en los pozos. Además, perlas fluorescentes y las bacterias que expresan una proteína fluorescente se pueden utilizar, junto con marcadores de células huésped de la infección específica. Por ejemplo, experimentos de competición se crean imágenes comúnmente usando rojo fluorescente rodamina-phalloidin a manchar la actina del citoesqueleto de las células huésped &#39;y evaluar los cambios morfológicos que resultan de la infección, junto con los granos azules fluorescentes y fluorescentesverde (GFP expresar o SYTO18 manchado) bacterias. Una gama de adhesinas de talón de acoplamiento, incluyendo Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD y Vibrio parahaemolyticus MAM, se han utilizado como materiales biomiméticos para estudiar la adhesión, inhibición de la adhesión y la contribución de adhesión al patógeno citotoxicidad mediada 1, 7, 8. Una de las ventajas de la utilización de este enfoque es la facilidad de la visualización de los acontecimientos de fijación, ya que las perlas de polímero utilizados como andamios están disponibles en una amplia gama de colores (por ejemplo, azul, rojo fluorescente, azul, verde, naranja). Por lo tanto, el etiquetado directo de proteína, que puede interferir con la función, se puede evitar. Además, la superficie de acoplamiento imita la pantalla multivalente de adhesinas en la superficie bacteriana, lo que refleja una conformación más fisiológicamente relevantes en comparación con las proteínas solubles. En comparación con los estudios que utilizan las bacterias intactas o bacteriAL mutantes, el enfoque del grano elude los problemas asociados con el crecimiento bacteriano. Por ejemplo, a más largo plazo (por ejemplo, O / N) estudios de la adhesión bacteriana a las células huésped utilizando bacterias intactas a menudo comprometida por los fenómenos que acompañan el crecimiento bacteriano - acidificación del agotamiento del medio de crecimiento y nutrientes afectar negativamente a las células huésped, y la replicación bacteriana compromete con el tiempo calidad de imagen. Más recientemente, el uso de adhesinas de talón de acoplamiento se ha extendido para incluir su uso como herramientas para purificaciones de afinidad de los factores del huésped celular implicados en los procesos aguas abajo de la unión bacteriana de señalización. V. parahaemolyticus MAM7, a través de la unión a ácidos fosfatídicos en la membrana de la célula huésped, provoca la activación de RhoA y actina reordenamientos 1, 3. perlas de MAM acoplado se utilizan para purificar e identificar proteínas implicadas en las plataformas de señalización ensamblados como consecuencia de célula MAM-anfitrión Unión. Desde cuentas puedefácilmente separarse del sobrenadante mediante una etapa de centrifugación corta, y la proteína de interés se acopla covalentemente, este es un buen método para conseguir la separación de las proteínas contaminantes y enriquecer los complejos de proteínas relevantes, que se puede utilizar para aplicaciones posteriores tales como la proteómica o Western secante.

Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell&#8217;s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions. 
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9. 
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td>Danger; corrosive 
			can be bought as solution or freshly prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PN22317</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30089</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0&#160;&#956;m mean particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0280</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLB9</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26266</td>
			<td>Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Danger; corrosive and toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose - With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without&#160;L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1145</td>
			<td>for infection experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>for maintenance of cultured host cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin - 
			Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>MK401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoirs (25ml)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>F267660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture facilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

El V. parahaemolyticus adhesina MAM7 contiene siete tándem entrada de células de mamíferos (MCE) dominios implicados en el reconocimiento de receptores de la superficie acogida. Se utilizó perlas de poliestireno acopladas a recombinante, fragmentos purificados que abarca o bien todos los dominios de siete MCE tándem (MAM7) o sólo el dominio primero MCE (MAM1) para probar la capacidad de estos materiales para competir con V. parahaemolyticus célula huésped para la unión y la eficacia resultante de estos materiales como inhibidores de la adhesión. Se infectaron células HeLa con V. parahaemolyticus cepa POR1, y la citotoxicidad resultante de la infección in vitro se evaluó después de 4 horas (Figura 3). El tratamiento de células HeLa con 0,1% Triton X-100 (control de lisis positivo) dio lugar a la lisis celular completa, las células no infectadas muestran niveles muy bajos de citotoxicidad. In vitro la infección de células no tratadas con POR1 resultó en niveles muy altos de lisis celular, y esto fue inhibida por MAM7-coupled perlas pero no acoplado MAM1 o perlas de control de GST acoplada (Figura 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> Figura 3. Caracterización de Vibrio parahaemolyticus induce citotoxicidad en células epiteliales durante ensayos de competición. Las células fueron tratadas con V. parahaemolyticus (Vp), indicados con (+) o no hay bacterias (-) en la presencia de diferentes entidades que compiten (. comp) como se indica. Entre ellos o bien no comp. (-), Perlas de MAM7 (MAM7), perlas MAM1 (MAM1) o perlas de control de GST (GST). Como controles, las células se trataron con Triton X-100 (triton, control de lisis), o se dejan sin infectar (uninf). La liberación de LDH después de 4 horas se midió como se describe en el apartado 3, y los resultados se normalizó a los controles Triton (100%) y los blancos (0%) como se ha descrito anteriormente. Los resultados son medias ± SEM de tres experimentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> La enumeración de V. parahaemolyticus unido a cualquiera de las células no tratadas Hela, o células incubadas con MAM7-, MAM1-, o bolas de control GST, reveló que MAM7 perlas pero no MAM1- o perlas de control GST outcompete V. parahaemolyticus para la fijación de acoger receptores de la superficie celular (Figura 4). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> Figura 4. Caracterización de la unión bacteriana durante experimentos de competición. Se infectaron células HeLa con V. parahaemolyticus POR2 (Vp +), en ausencia (-) o presencia de competir entidades de la siguiente manera: perlas MAM7 (MAM7), perlas de MAM1 (MAM1) o perlas de control de GST (GST) (comp.). La adhesión bacteriana se midió después de 1 hora, como<html> se describe en la sección 3. Los resultados son medias ± SEM de tres experimentos. Medios (FLTR en UFC / ml) son 2.3010 6, 5 1.5310, 2.0510 6, 2.1210 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Adhesinas acoplados a fluoróforo marcado con perlas dan lugar a la generación de materiales que imitan la adhesión bacteriana a las células huésped y son herramientas poderosas para imágenes celulares (Figura 5). El uso de cuentas azules fluorescentes acopladas MAM7, que caracteriza el proceso de unión mediada MAM7 a las células epiteliales. La unión de MAM7 a las células huésped dio lugar a reordenamientos de actina y formación de fibras de estrés, que eran co-visualizado utilizando rodamina-faloidina para teñir de F-actina (Figura 5B). _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Preparación y uso de fluoróforo etiquetados perlas biomiméticos para los propósitos de formación de imágenes. (A) suspensión de perlas fluorescentes azules biomiméticos (tubo de la derecha, 10x) y tampón de control (tubo de la izquierda). (B) La unión de perlas acopladas a MAM7 Hela células resultados en reordenamientos de actina y la formación de fibras de estrés. Accesorio de cuentas azules fluorescentes y resultando de actina estrés fibras (rojo, teñidas con rodamina-phalloidin) fueron imágenes por microscopía. Bar, 10 micras. Imágenes en el panel B fueron adaptadas de Lim et al. 1 y se reproducen bajo la licencia Creative Commons Attribution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

biomimetic-materials-to-characterize-bacteria-host-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.2K vistas.  University of Birmingham. Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors. 

Video: Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

El uso de interferón-γ enzimo-inmunoensayo para la Caracterización de Nuevos epítopos de células T del virus del papiloma humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Investigación

Inmunología e Infección

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

El uso de<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Fenómica fagos: enfoques fisiológicos para caracterizar Novela Virales Proteínas

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Flujo Virometry para analizar antigénica Spectra de viriones y extracelular Vesículas

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Protocolo para Caracterizar los Cambios Morfológicos de<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En respuesta al tratamiento antibiótico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Materiales biomiméticos para caracterizar las interacciones bacteria-huésped

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