El autor agradece a Roberto Kolter (Harvard Medical School) por su asesoramiento y asistencia durante el desarrollo de esta pantalla cocultivo invaluable. Agradece también a Mateo Poderes por leer el manuscrito para mayor claridad, y Chia-yi Cheng para obtener ayuda con la obtención de la figura 6.

<ol>
	<li>Berdy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+microbial+metabolites.">Bioactive microbial metabolites.</a> J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multiple+cell+types+in+Bacillus+subtilis.">Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li><li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li><li>Shank, E. 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Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Nicolas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condition-dependent+transcriptome+reveals+high-level+regulatory+architecture+in+Bacillus+subtilis.">Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis.</a> Science. 335, 1103-1106 (2012).</li><li>Middleton, R., Hofmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+shuttle+vectors+for+ectopic+insertion+of+genes+into+Bacillus+subtilis.">New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis.</a> Plasmid. 51, 238-245 (2004).</li><li>Shimotsu, H., Henner, D. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integrative+elements+of+rhizobiophage+16-3+can+integrate+into+proline+tRNA+(CGG)+genes+in+different+bacterial+genera.">Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera.</a> J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).</li><li>Charpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cassette-based+shuttle+vector+system+for+gram-positive+bacteria.">Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).</li><li>Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+an+integration-proficient+vector+based+on+the+site-specific+recombination+mechanism+of+enterococcal+temperate+phage+phiFC1.">Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1.</a> J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).</li><li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7:+a+target+site-specific+transposon.">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).</li><li>Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry.">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (60), e3796 (2012).</li><li>Lopez, D., Fischbach, M. 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D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas-Saccharomyces+interactions:+influence+of+fungal+metabolism+on+bacterial+physiology+and+survival.">Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival.</a> J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).</li><li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix.">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li><li>Zengler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivating+the+uncultured.">Cultivating the uncultured.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Una de las limitaciones inherentes de este protocolo es que se basa en la cultivabilidad de organismos microbianos. Como ha sido bien documentado 24, mayoría de la vida microbiana en el planeta no puede (aún) ser cultivado bajo las condiciones de cultivo explorados hasta la fecha. Por lo tanto, un gran número de interacciones entre especies microbianas que se están produciendo en los entornos naturales no sea detectada utilizando este enfoque. Sin embargo, ya que es nuestro deseo para identificar no sólo...

Estamos interesados ​​en la comprensión de cómo los metabolitos que las bacterias secretan afectan la fisiología y el desarrollo de los microbios vecinos. Muchos metabolitos se han caracterizado por sus efectos bioactivos sobre otros microbios. Dos ejemplos bien descritos incluyen antibióticos, que inhiben el crecimiento de otros microbios, y las moléculas de detección de quórum, que alteran la expresión génica global de otros microbios. Sin embargo, las bacterias producen muchos otros pequeños productos naturales de molécula que no tienen bioactividades conocidos 1. Nuestra hipótesis es que las bacterias han evolucionado y conservado la capacidad de producir algunos de estos metabolitos, ya que les permite modular la fisiología celular de sus vecinos microbianas en las complejas comunidades microbianas dentro de la cual existen la mayoría de las bacterias. Tipos de células de Bacillus subtilis Nos hemos centrado nuestros estudios sobre las interacciones microbianas mediadas químicamente que involucran Bacilsubtilis lus. Esto no es sólo debido a su estatus como modelo la bacteria Gram-positivas y las herramientas genéticas resultantes disponibles para su manipulación, pero también por su capacidad de diferenciarse en tipos de células caracterizadas. Algunos ejemplos son las células que son: natación, que producen la matriz extracelular que se requiere para la formación de biopelículas robusta; competentes para tomar ADN del medio ambiente, y en esporulación, entre otros 2. Cada uno de estos tipos de células expresa un regulón transcripcional característica que los hace fisiológicamente y / o físicamente distinto de sus hermanos genéticamente idénticos. Bajo muchas condiciones de crecimiento, múltiples tipos de células coexisten como diversas subpoblaciones dentro de una sola colonia de B. subtilis células 3. Aunque muchas especies de bacterias pueden exhibir análoga tipo celular heterogeneidad, este fenómeno ha sido particularmente bien estudiado en B. subtilis. En particular, los genes que son UPRegulated dentro de cada uno de ellos específico B. Se han identificado los tipos de células subtilis. La identificación de estos genes regulados positivamente es esencial para el trabajo que se describe aquí, porque muchos de estos fenotipos microbianas de interés son difíciles o imposibles de observar directamente. Por ejemplo, no se puede detectar visualmente un rasgo como la natación (1.5%) placas de agar sólido, a pesar de que una subpoblación de B. subtilis células producen flagelos en esas condiciones 3. Otro ejemplo es la matriz-la producción de biopelículas. Producción de la matriz puede ser visualizado por morfología de las colonias (tal como resulta en colonias macroscópicamente arrugadas), pero sólo en cierta medio de crecimiento, y sólo después de varios días de crecimiento 4. Sin embargo, sabiendo que son upregulated genes durante la diferenciación, podemos construir reporteros transcripcionales que actúan como marcadores para la diferenciación celular en estos tipos de células. Reportero construcciones Estos fluorescente treporteros ranscriptional consisten de los promotores de genes específicos de tipo celular de conducir la producción de un gen reportero, por ejemplo una proteína fluorescente. Los ejemplos incluyen P HAG-YFP (para células natación), P tapa-YFP (para células de la matriz de producción de biofilm), y P SSPB-YFP (por esporulación de las células), donde P x indica la región del promotor para el gen x. Estas construcciones indicadoras se integran en un locus neutro en el cromosoma (Figura 1 y ver más abajo) de manera que la regulación natural de la fenotipo se deja intacta. Sin embargo, ahora, cuando una célula expresa este fenotipo, sino que también expresa una proteína fluorescente. Esto proporciona una lectura de la activación de comportamiento fenotípico particular, puede visualizar fácilmente, lo que nos permite para detectar microbios que activan la respuesta fisiológica. Aunque tales reporteros son comúnmente utilizados en microbiología, que no se han aplicado ampliamente en pantallas a identifinteracciones metabólicas Y entre los microbios antes de este método fue descrito 5. Hay una serie de consideraciones importantes en el diseño y construcción de reportero cepas celulares específicos del tipo. Hemos utilizado los reporteros fluorescentes exclusivamente de la transcripción, aunque otros tipos de construcciones son ciertamente posibles. Desaconsejamos el uso de fusiones de traducción como marcadores para el tipo de célula diferenciación en nuestra pantalla, sin embargo, por dos razones: 1) el deseo de abandonar el tipo de células específicas proteína nativa no perturbada, y 2) el reconocimiento de que un difuso, de células- amplia de fluorescencia será más fácil de detectar que puntos lagrimales localizado dentro de las células (común con fusiones de traducción). La selección de genes reportero Después de tomar la decisión de usar la transcripción como un dispositivo de lectura, el gen reportero debe ser seleccionado (por ejemplo, LacZ, fluorescencia, o luciferasa). LacZ tiene la ventaja de necesitar menos especialzado equipos para detectar, pero hay una probabilidad mucho mayor de falsos positivos entre los microbios ambientales. En nuestras manos, el nivel de fondo de LAC + organismos entre los microbios del suelo era prohibitivo (&gt;&gt; 10% de los microbios del suelo eran azules (Lac +) en placas X-gal; datos no presentados). Es posible que mediante la valoración de la concentración de X-gal en el medio, esto puede ser optimizado para permitir el uso de un reportero de X-gal, aunque no se intentó esto. Luciferasa ofrece una alta sensibilidad de detección y es el reportero más ortogonal: no hay casi ninguna posibilidad de microbios ambientales ser inherentemente luminiscente. Sin embargo, encontramos que hace difícil identificar la instrumentación en nuestra institución que permitió la detección de luminiscencia a través de la totalidad de las placas de Petri, ya que la mayoría fueron diseñados para explorar regiones localizadas sólo en placas de múltiples pocillos. También puede haber complicaciones en la visualización de colonias luminiscentes de una manera que también permitió la física simultánea esolation de organismos que inducen. Durante el uso de los fiduciarios puede haber hecho esto posible, en lugar elegido para utilizar marcadores transcripcionales fluorescentes, que se ha comprobado que funcionan en B. subtilis, a condición de sensibilidad adecuada de detección y bajas tasas de falsos positivos entre los organismos del suelo, y les permite usar de la instrumentación fácilmente disponible tanto para la visualización y procedimientos de aislamiento. Selección Fluoróforo El fluoróforo específico seleccionado dependerá de sus especies bacterianas, el medio de cultivo de agar que está usando, y el filtro de fluorescencia especial establece que tiene disponible. Con nuestro instrumentación, se encontró que tanto la B. subtilis colonias ellos mismos y el agar que se cultivaron en exhibieron menos fluorescencia de fondo cuando se utilizaron YFP (proteína fluorescente de color amarillo) filtros, por lo que el reportero superior a GFP (proteína fluorescente verde) en nuestras manos. El uso de codones de proteínas fluorescentes estánfrecuencia optimizada para eucariotas, por lo que es importante seleccionar un fluoróforo o bien conocidos por la literatura para trabajar en sus especies de bacterias, o para probar de forma explícita el uso de un promotor constitutivo. Un gran número de las siempre cambiantes variantes de la proteína fluorescente están actualmente disponibles 6, que se han revisado en varias fuentes 7,8, algunas de las cuales prevé explícitamente orientación sobre la elección de una proteína fluorescente apropiado para su experimento 9. Selección del promotor La selección de un promotor dependerá en gran medida del tipo de célula o fenotipo de interés. Para los organismos tales como B. subtilis, algunos genes indicadores específicos de tipo celular se han establecido en la literatura. Para otras cepas bacterianas, el examen de microarrays o datos de la transcripción será necesario para proporcionar información acerca de qué genes están muy upregulated bajo las condiciones en las que el tipo de célula de interés is manifestada. Un estudio reciente catalogado la transcripción de B. subtilis 104 bajo condiciones de crecimiento diferentes con suelo de baldosas microarrays 10. Este documento proporciona información completa acerca de qué genes están altamente regulados por incremento en diferentes condiciones, que tiene un valor incalculable para los fenotipos menos bien caracterizados. En lugar de la cartografía de las regiones precisas de promotor para cada gen de interés, por lo general simplemente usamos la secuencia de 200-500 pb aguas arriba del gen como el promotor. La duración exacta depende de la secuencia genómica contexto: las regiones más cortas se utilizan cuando es necesario para evitar la inclusión de las regiones de codificación de aguas arriba de la vecina marcos de lectura abierta. Loci y la integración Neutro ¿Cómo mantener el reportero construir en su cepa bacteriana se convierte en la última pregunta en el diseño de una cepa reportero transcripcional fluorescente. En las bacterias, los genes de interés se mantienen con frecuenciaen plásmidos utilizando la selección de antibióticos. Sin embargo, puede que no sea posible utilizar antibióticos durante cocultivo sin matar los microbios ambientales. Si plásmidos se mantienen establemente en sus especies de bacterias, puede ser posible que aumenten sus bacterias que contiene un reportero plásmidos cargo en presencia de antibióticos para preparar su reportero en los controles, y luego eliminar los antibióticos durante la propia co-cultivo con la esperanza de que el plásmido se ser suficientemente mantenido para permitir la fluorescencia. Sin embargo, si los plásmidos se pierden fácilmente en su bacteria, o se pierden en condiciones de estrés, esto no será una opción viable. En muchos casos, la mejor solución será integrar el constructo indicador en el cromosoma bacteriano, que permite el mantenimiento estable del reportero, incluso en ausencia de selección. Para que la integración de no interrumpir la expresión normal o regulación de su gen de interés, se recomienda integrar en un sitio ectópico en el cromosoma que can actuar como un &quot;locus neutro.&quot; En B. subtilis estos sitios de integración son los genes que - cuando muta - transmitir un fenotipo en ciertos medios mínimos (que permite a los integrantes pueden identificar sin selección de antibióticos), y sin embargo no alteran el crecimiento o las tasas de esporulación en rich media, e incluyen genes tales como amyE, lacA, thrC, pyrD, gltA, y sacA (transporte de la capacidad de utilizar almidón, β-galactósidos, treonina, uracilo, glutamato, y sacarosa, respectivamente) 11-13. Mientras que la integración en estos genes se han utilizado de forma fiable durante muchos años en B. subtilis (particularmente en amyE y lacA), un conocimiento similar, puede no estar disponible para los genes en otras especies bacterianas. El uso de los sitios de unión de fagos son grandes alternativas para los sitios de integración cromosómica neutros: muchas especies específicas de 14 a 16, así como los sitios de integración generales, tales como el sitio de unión Tn7 (Tn7 att) tienenhan identificado y utilizado para las inserciones de genes en muchas especies bacterianas 17,18. Microbios ambientales Utilizamos el suelo como fuente directa de microorganismos ambientales para nuestra pantalla de co-cultivo. El suelo contiene una gran diversidad de microbios, y muchos de estos organismos son rica fuente de productos naturales. Mediante el uso de suspensiones líquidas de suelos colocados directamente sobre las placas con nuestra cepa fluorescente reportero transcripcional (sin aislamiento previo de las bacterias del suelo), simplificamos en gran medida el enfoque experimental. El suelo o bien se puede utilizar inmediatamente después de la cosecha, o se congeló a -80 ° C para su uso futuro. El uso inmediato tiene la ventaja de que una mayor diversidad de microbios potencialmente se puede cultivar, incluidos los que no va a sobrevivir la congelación también. Tiene la desventaja de que se desconoce la concentración de los organismos del suelo cultivables partir de estas muestras, lo que aumenta el número de placas de pantalla que se debe utilizar. Deluso ayed tiene la ventaja de que las ufc / ml para cada fuente de suelo se pueden determinar de antemano, lo que permite un número optimizado de colonias que se cultiva en cada placa pantalla. Sin embargo, requiere que los organismos del suelo sean capaces de sobrevivir a la congelación. Tenga en cuenta que la diversificación de la piscina inductor siendo examinada (es decir, las fuentes de suelo) parece ser más eficaz en la identificación de nuevas interacciones entre especies que el cribado en profundidad sobre el mismo suelo: una mayor diversidad filogenética se observó en los accesos identificados en nuestra pantalla de matriz de inducción como fuentes de suelos además se examinaron en lugar de detección de las mismas fuentes de suelos más a fondo (EA Shank y R. Kolter, Escuela de Medicina de Harvard, resultados no publicados). Visión de conjunto El enfoque que describimos aquí es sencillo en cuanto a sus requisitos técnicos. Se trata de: 1) la construcción de un reportero transcripcional fluorescente en B. subtilis o unaotras especies bacterianas de interés, 2) la identificación de condiciones bajo las cuales no se activa este reportero, 3) la preparación de partes alícuotas de esta cepa reportero y organismos que se proyectarán (en nuestro caso del suelo, pero otras fuentes podrían ser utilizados en su lugar), 4) la mezcla de estos dos conjuntos de microbios en medios sólidos, 5) identificar y aislar los organismos putativo inducir, y 6) confirmando que estos organismos en efecto, activan este fenotipo en una pantalla secundaria. Una vez identificados, estos organismos y sus metabolitos nos proporcionan herramientas químicas para modular el comportamiento bacteriano, para estudiar la fisiología bacteriana y las interacciones microbianas y actuar potencialmente como nuevos andamios para compuestos terapéuticos futuros.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth, Lennox</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80017-484</td>
			<td>Alternative media sources may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 3 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26396-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading tips, round</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59060-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions

En la naturaleza, rara vez existen bacterias en forma aislada, sino que están en vez rodeados por una gran variedad de otros microorganismos que alteran el medio ambiente local mediante la secreción de metabolitos. Estos metabolitos tienen el potencial de modular la fisiología y la diferenciación de sus vecinos microbianos y son factores importantes que puedan en el establecimiento y mantenimiento de las comunidades microbianas complejas. Hemos desarrollado una pantalla de cocultivo basado en la fluorescencia para identificar tales interacciones microbianas mediadas químicamente. La pantalla se combina una transcripción cepa fluorescente reportero con microbios ambientales en medios sólidos y permitiendo que las colonias crezcan en cocultivo. El reportero transcripcional fluorescente está diseñado de manera que la cepa bacteriana elegida emite fluorescencia cuando se está expresando un fenotipo particular de interés (es decir, la formación de biopelículas, la esporulación, la producción de factor de virulencia, etc.) El cribado se realiza en condiciones de crecimiento where este fenotipo no se expresa (y por lo tanto la cepa reportero es típicamente no fluorescente). Cuando un microbio ambiental segrega un metabolito que activa este fenotipo, que se difunde a través del agar y activa el constructo indicador fluorescente. Esto permite que el productor de metabolitos de inducción de microbio a detectar: ​​son las colonias no fluorescentes más proximales a las colonias fluorescentes. Por lo tanto, esta pantalla permite la identificación de los microbios ambientales que producen metabolitos difusibles que activan una respuesta fisiológica particular, en una cepa reportero. Esta publicación explica cómo: a) seleccionar las condiciones de selección adecuadas co-cultivo, b) preparará el reportero y microbios ambientales para la detección, c) realizar la pantalla de co-cultivo, d) aislar organismos putativo inducir, y e) confirmar su actividad en una pantalla secundaria. Hemos desarrollado este método para la detección de organismos del suelo que activan biopelícula matriz de producción en Bacillus subtilis </em&gt;, sin embargo, también discutimos las consideraciones para la aplicación de este enfoque a otras bacterias genéticamente tratables.

Se utilizó este pantalla para identificar los organismos del suelo secretoras de compuestos que alteran la fisiología de B. subtilis. Los resultados descritos aquí se centran en el tipo de célula-matriz de la producción de B. subtilis, que produce la proteína y de exopolisacáridos que se requieren para la formación de biopelículas robusta en esta bacteria. Seleccionamos el promotor del operón tapa-sipW-TASA para nuestra construcción informadora fluorescente (P tapa-YFP).</e...

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Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Las bacterias producen compuestos secretados que tienen el potencial de afectar a la fisiología de sus vecinos microbianos. Aquí se describe una pantalla de co-cultivo que permite la detección de este tipo de interespecies mediadas químicamente interacciones mediante la mezcla de los microbios del suelo con cepas reportero transcripcional fluorescentes de Bacillus subtilis en medios sólidos.

Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

using-coculture-to-detect-chemically-mediated-interspecies

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K vistas.  University of North Carolina at Chapel Hill.  Las bacterias producen compuestos secretados que tienen el potencial de afectar a la fisiología de sus vecinos microbianos. Aquí se describe una pantalla de co-cultivo que permite la detección de este tipo de interespecies mediadas químicamente interacciones mediante la mezcla de los microbios del suelo con cepas reportero transcripcional fluorescentes de Bacillus subtilis en medios sólidos. 

Video: Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidos Co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la Investigación de la señal mediada Soluble Interacciones

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Investigación

Biología

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

El análisis de Schwann-astrocito interacciones utilizando In Vitro Ensayos

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

Síntesis rápida y Detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados ​​en las buenas prácticas agrarias

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinación de las interacciones proteína-ligando Uso diferencial de barrido Fluorimetría

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas del tejido

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using scanning transmission electron microscopy (STEM). Cells of the mammalian breast cancer cell line SKBR3 were grown on silicon microchips with silicon nitride (SiN) windows. Cells were chemically fixed, and HER2 proteins were labeled with quantum dot nanoparticles (QDs), using a two-step biotin-streptavidin binding protocol. The cells were coated with multilayer graphene to maintain a hydrated state, and to protect them from electron beam damage during STEM. To examine the stability of the samples under electron beam irradiation, a dose series experiment was performed. Graphene-coated and non-coated samples were compared. Beam induced damage, in the form of bright artifacts, appeared for some non-coated samples at increased electron dose D, while no artifacts appeared on coated samples.

Presented here is a protocol for labeling membrane proteins in mammalian cells and coating the sample with graphene for liquid-phase scanning transmission electron microscopy. The stability of the samples against the damage caused by radiation can also studied with this protocol.

Carcasa de grafeno de células de mamíferos fijas químicamente para microscopía electrónica de fase líquida

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Métodos de cultivo para estudiar las interacciones apicales específicas utilizando modelos organoides intestinales

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Bioinformatics Resources for the Study of Glycan-Mediated Protein Interactions

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In particular, it aims at highlighting interactions between glycoproteins (such as cell surface receptors) and carbohydrate-binding proteins mediated by glycans. Here, major resources of the collection are introduced through two illustrative examples centered on the N-glycome of the human Prostate Specific Antigen (PSA) and the O-glycome of human serum proteins. Through different database queries and with the help of visualization tools, this article shows how to explore and compare content in a continuum to gather and correlate otherwise scattered pieces of information. Collected data are destined to feed more elaborate scenarios of glycan function. Glycoinformatics introduced here is, therefore, proposed as a means to either strengthen, shape, or refute assumptions on the specificity of a protein glycome in a given context.

This protocol illustrates how to explore, compare, and interpret human protein glycomes with online resources.

Recursos bioinformáticos para el estudio de las interacciones de proteínas mediadas por glicanos

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In ...