Este protocolo permite la visualización y el seguimiento de las interacciones bacterianas entre especies a nivel de célula única a lo largo del tiempo. Esta ventaja principal de las técnicas es su aplicabilidad al estudio de las interacciones bacterianas, incluyendo el seguimiento celular, la expresión génica y la tinción de viabilidad. Además, las condiciones se pueden modificar para estudiar diferentes organismos.
Para empezar, preparar las almohadillas de agarosa fundiendo una agarosa de fusión 2% baja en 10 mililitros de medios de crecimiento bacteriano en un matraz Erlenmeyer limpio de 50 mililitros. Microonda el matraz en intervalos cortos hasta que la agarosa esté en solución, luego deje enfriar en un baño de agua Celsius de 50 grados durante al menos 15 minutos. Alinee un corte de silicio con la abertura en un plato de 35 milímetros, luego voltee el plato y toque ligeramente el silicio cortado con una espátula para fijarlo al plato y eliminar cualquier burbuja de aire.
Una vez que la agarosa se ha enfriado, pipetear 915 microlitros de agarosa fundida en el molde y dejar que la almohadilla se seque. Caliente la cámara ambiental del microscopio a la temperatura experimental al menos dos horas antes de la instalación del experimento. Prepare las toallitas de humedad enrollando firmemente una toallita sin pelusas.
Coloque la toallita enrollada dentro de un plato estéril de Petri y agregue 500 microlitros de agua estéril directamente a las toallitas. Caliente las toallitas, almohadillas y un plato estéril de 35 milímetros a la temperatura experimental para equilibrar todos los materiales. Una vez que las almohadillas estén secas, pipetee un microlitro de co-cultivo uniformemente en la parte inferior de un plato de tapapso de vidrio estéril precalentó de 35 milímetros.
Retire el corte de silicona del molde de agarosa usando pinzas estériles, inclíquela hacia un lado y deslice una espátula ligeramente doblada debajo del borde de la almohadilla de agarosa para dejarla caer sobre una tapa de petriplate estéril. Transfiera la almohadilla al plato con las células bacterianas del lado inferior hacia abajo deslizando una espátula en ángulo de 90 grados debajo de la almohadilla y colocándola en la parte superior del resbalón de la cubierta inoculada. Utilice la espátula para hacer que la almohadilla se enjuague contra el resbalón de la cubierta y presione suavemente cualquier burbuja de aire.
Retire el exceso de humedad de la toallita húmeda y colóquela alrededor del borde del plato, asegurándose de que no toque la almohadilla. La muestra ya está lista para la toma de imágenes. Antes de las almohadillas inoculadas, configure el microscopio realizando la iluminación de color para alinear todos los marcos de imagen.
Una vez que el plato inoculado está listo, ver el plato con objetivo 100X y centrarse en los resultados bacterianos. Haga clic en la opción de fase en el software de imágenes y ajuste el porcentaje de luz LED DIA emitida seleccionando la fuente de luz y deslizando la barra en la escala de porcentaje de luz. Alternativamente, introduzca manualmente un tiempo de exposición.
Guarde la configuración del canal de fase haciendo clic con el botón derecho en el canal de fase y seleccionando la opción Asignar configuración actual del microscopio. Si utiliza fluorescencia, seleccione el canal de fluorescencia de interés y establezca el porcentaje de luz de fluorescencia emitida y, a continuación, ajuste el tiempo de exposición como se describió anteriormente. Como alternativa, cambie la profundidad de la puja para ajustar el rango dinámico seleccionando una de las otras opciones en el menú desplegable.
Guarde la configuración del canal de fluorescencia haciendo clic con el botón derecho en el canal de fluorescencia y seleccionando la opción Asignar configuración de microscopio actual. En la ficha XY, haga clic en el cuadro de la columna de nombre de punto para guardar la posición de interés XY seleccionada. A continuación, haga clic en el cuadro PFS en la parte inferior de la pestaña para activar el sistema de enfoque perfecto.
Enfoque las celdas y haga clic en la flecha de la columna PFS para guardar el foco de la posición XY. Repita este proceso para todas las demás posiciones XY. Guarde la configuración de las posiciones XY en la pestaña de fase como se ha demostrado anteriormente.
Haga clic en la pestaña de tiempo y active la casilla para seleccionar el intervalo de adquisición, la frecuencia y la duración de la imagen. A continuación, haga clic en la pestaña longitud de onda y marque la casilla para seleccionar los canales que se utilizarán en la frecuencia de imagen e intervalo de canal. Cuando se pesca con la configuración, haga clic en Ejecutar ahora para iniciar la imagen de lapso de tiempo.
Comparar con las células P.aeruginosa en monocultivo que permanecen agrupadas en balsas cuando en co-cultivo con S.aureus, P.aeruginosa ha aumentado la motilidad celular única hacia las colonias de S.aureus. Las células individuales de P.aeruginosa rodearán y eventualmente invadirán las colonias de S.aureus. Demasiada o muy poca humedad durante el experimento y almohadillas secas incorrectamente son dos problemas comunes que conducen a la deriva debido al desplazamiento de la almohadilla y arrastrar las celdas fuera del campo de visión.
El blanqueo fotográfico y la foto toxicidad pueden hacer que las células primero, perder su fluorescencia y luego dejar de dividirse y eventualmente morir en marcos posteriores. Las células que inicialmente están demasiado cerca pueden no tener tiempo suficiente para establecer un gradiente de señales secretas a las que otras especies pueden responder. La viabilidad celular bacteriana se puede visualizar añadiendo yoduro propidium a las almohadillas de agarosa.
Las células verdes indican que las células vivas expresan activamente la GFP, mientras que los glóbulos rojos indican células manchadas de yoduro de propidio muerto después de ser tratadas con sobrenadante libre de células P.aeruginosa. El movimiento de las células individuales de P.aeruginosa se rastrea desde el marco en el que una célula sale de la balsa a través del marco en el que las células alcanzan el cúmulo de S.aureus. La distancia entre la balsa P.aeruginosa y el cúmulo S.aureus, proporciona la distancia euclidiana, mientras que las longitudes totales de la pista proporcionan la distancia acumulada.
La dirección de cada celda se calcula como una relación de la distancia euclidiana a la distancia acumulada. El tipo salvaje P.aeruginosa se mueve hacia el tipo salvaje S.aureus con una dirección significativamente mayor que hacia S.Aureus que carece de factores secretos regulados que son necesarios para la motilidad direccional. Al intentar este protocolo, es importante tener en cuenta que cada investigador tendrá que optimizar las condiciones para el secado de las almohadillas de agarosa en imágenes en vivo basadas en la ubicación geográfica, el entorno de laboratorio y su experimento particular.
Esta técnica revela interacciones entre Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, previamente oscurecida durante nuestras investigaciones sobre su comportamiento en el cultivo a granel, acercándonos a la comprensión de cómo interactúan estos organismos durante las infecciones.
