Nuestro protocolo puede mapear la comunicación química de moléculas pequeñas entre células y tejidos, y hemos aplicado específicamente esto para explorar moléculas pequeñas en la metatesis de cáncer de ovario. La principal ventaja de nuestra técnica es la capacidad de medir moléculas pequeñas de una manera libre de etiquetas mientras se mantiene la integridad espacial de las células y tejidos en 2D. Esta técnica nos ha permitido interrogar la contribución de pequeñas moléculas en las metástasis del cáncer de ovario de una manera no objetivo.
Esto podría revelar nuevas dianas terapéuticas y vías que previamente han sido pasadas por alto. Esta metodología podría extenderse fácilmente a otros tipos de cáncer que se pueden cultivar en agarosa y cualquier otra enfermedad en la que un componente espacial podría ser importante para el fenotipo celular resultante. Asegurar que todas las células y componentes estén en la mano y la paciencia con el proceso de secado es esencial para este protocolo.
Un paso de desicación apresurado a menudo puede conducir a datos de espectrometría de masas de mala calidad. La demostración visual de este método es útil para comprender nuestros pasos de preparación y desicación de muestras, ya que se desvían en gran medida de los experimentos típicos de espectrometría de masas por imágenes que utilizan tejidos o microbios en el agar. Para empezar, licuar la agarosa a 70 grados Celsius en un plato caliente.
Coloque el divisor de ocho pozos encima de la diapositiva tratada con ITO. Mediante el tratamiento estándar de la trippsina, recoja las células MOE en un tubo cónico de 15 mililitros, centrífuga, y agregue una vez medios DMEM a resuspend para obtener una concentración de 50.000 células por cada 150 microlitros, que es dos veces la densidad final deseada. Para coculturas indivisas, utilice fórceps para agregar explanta ovárica al centro de los cuatro pozos.
Justo antes del enchapado, combine 200 microlitros de suspensión celular y 200 microlitros de agarosa licuada en tubos individuales de dos mililitros. Evite las burbujas de aire durante el pipeteo. Inmediatamente, agregue 300 microlitros de la mezcla de agarosa celular a cada pozo, y aplique una suave presión descendente continua sobre el divisor para asegurar que no se filtren ni mezclen entre pozos.
Asegúrese de que no haya burbujas de aire y que el ovario permanezca en el centro del pozo. Si la agarosa pipetado alteró el ovario, utilice suavemente la punta de la pipeta para centrarla antes de que la agarosa se enfríe. Luego, incuba el tobogán a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada.
Para coculturas divididas, corte los divisores de plástico fino y liso. Se utilizan los lados de una cuenca de medios estéril y desechable. Cortarlos lo suficientemente ancho para encajar perfectamente en la hipotenusa del pozo.
Coloque el divisor de ocho pozos en la parte superior de la corredera tratada con ITO e inserte divisores de plástico diagonalmente en pozos. Preparar cultivos celulares como se hizo anteriormente, y combinar 100 microlitros de suspensión celular y 100 microlitros de agarosa licuada en un tubo de dos mililitros. Inmediatamente, placa 150 microlitros de la mezcla de agarosa celular en un lado del divisor manteniendo la presión hacia abajo en el divisor.
Deje que la agarosa se enfríe y solidifique durante aproximadamente un minuto, y luego retire el divisor. Utilice fórceps para colocar el ovario explant en el centro de la mitad vacía del pozo. Añadir 150 microlitros de mezcla de células-agarosa sobre la parte superior del ovario.
Incubar el tobogán a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada. Después de cuatro días, retire el divisor de la cámara de los tapones de agarosa. Con una espátula plana, separe los lados de la agarosa de la cámara y tire suavemente de la cámara hacia arriba.
Si se mueve algún tapón de agarosa, vuelva a colocarlos suavemente para que no se toquen unos a otros. Coloque el portaobjetos en un horno Celsius de 37 grados durante aproximadamente cuatro horas y gire 90 grados cada hora para garantizar una distribución uniforme del calor a lo largo de la muestra. El portaobjetos debe estar completamente seco.
De lo contrario, puede provocar una explosión de la muestra en el entorno de alto vacío del espectrómetro de masas MALDI-TOF. Secar la diapositiva y monitorear el progreso es el paso más crítico para lograr una alta resolución espacial y espectros de masa de calidad. Si se produce descamación o arrugas excesivas, no recomendamos recopilar los datos de espectrometría de masas.
Con los parámetros establecidos en el pulverizador de matriz, aplique la solución de matriz a la diapositiva. Para utilizar Phosphorus Red como calibrador, agregue un microlitro de Phosphorus Red a un punto claro en la diapositiva. Para utilizar la mezcla de péptidos como calibrador, mezcle con la matriz en Parafilm en una relación de uno a uno para ayudar a la ionización, y detecte 0.5 a un microlitro en la diapositiva.
Espere a que el calibrador se seque antes de la adquisición de datos de espectrometría de masas por imágenes. Dibuje una X utilizando un marcador permanente en cada esquina de la diapositiva y tome una imagen óptica usando una cámara o un escáner a 1200 ppp. En este experimento, un control cuidadoso del portaobjetos en el horno es esencial para asegurar un portaobjetos ITO seco óptimo, lo que resulta en una muestra plana desecada con arrugas mínimas o nulas a través de la superficie de la agarosa.
Esta figura muestra las arrugas que deben evitarse. Las arrugas pueden afectar ligeramente a la altura y, por lo tanto, a la precisión de masa de las señales de espectrometría de masas de imágenes. Las arrugas leves no afectarán la calidad de los datos.
Un tejido localizado de forma óptima debe estar lo más cerca posible del centro. El tejido utilizado debe estar en el centro del pozo si no está dividido o en el centro del medio triángulo si se divide para que la adquisición de datos IMS no esté contaminada con efectos de borde. El tejido mal posicionado, cuando se muestra en imagen, puede dar lugar a señales de masa falsas de los efectos del borde.
La imagen de diapositiva seca se utiliza para enseñar al espectrómetro de masas MALDI-TOF qué regiones se deben imaginar. Se seleccionaron pequeñas regiones alrededor del tejido ovárico para el IMS a 50 micrómetros. Se muestra una imagen representativa de una señal m-over-z para coculturas no divididas, así como para la configuración de cámara dividida.
Lo más importante a recordar es que los datos resultantes son tan buenos como la preparación de la muestra. Preste especial atención al proceso de secado. El aspecto más emocionante es validar las pequeñas moléculas descubiertas de esta manera utilizando otros experimentos, como ensayos de invasión o ensayos de colonización, para informar sobre la concentración efectiva y traducir a la biología humana.
Esperamos que esto abra la puerta para descubrir nuevas vías de posibles dianas terapéuticas para el cáncer de ovario mediante una mejor comprensión de los procesos en la metatesis primaria del cáncer de ovario.
