Cómo los axones navegan por la compleja matriz del sistema nervioso central es una cuestión fundamental en neurobiología. Este protocolo permite el estudio del crecimiento del axón y la dinámica del cono de crecimiento en el entorno fisiológico con imágenes de alta resolución. Este protocolo describe una tubería de extremo a extremo fácil de usar para la entrega de ADN en el cerebro embrionario de ratón, preparaciones para cortes organotípicos de alta calidad y una guía paso a paso para la adquisición y el análisis de imágenes.
Aunque originalmente diseñado para estudiar la dinámica de los axones en el sistema nervioso central embrionario, este protocolo podría ajustarse para permitir el cultivo organotípico y la visualización de la plasticidad axónica después de condiciones traumáticas o patológicas. El protocolo en sí es relativamente sencillo. Sin embargo, lograr su primer etiquetado y preservación de las estructuras cerebrales son puntos críticos.
Por lo tanto, la electroporación, la disección cerebral y los pasos de corte requieren un cuidado adicional. Demostrar el procedimiento será útil, y el estudiante de doctorado es del laboratorio de Bracket. Después de anestesiar a una ratón hembra embarazada, haga una incisión para extraer ambos cuernos uterinos con un bastoncillo de algodón empapado en solución salina tibia o fórceps, agarrando cuidadosamente los espacios entre los embriones.
Luego coloque los embriones en una gasa húmeda. Después de abrir el saco uterino, retire cada embrión. Coloque los embriones en un plato de 10 centímetros que contenga HBSS suplementado con glucosa sobre hielo.
Para la electroporación ex utero, recoja un embrión y colóquelo en el soporte. Luego inserte cuidadosamente el capilar de vidrio que contiene la mezcla verde rápida de ADN a través del cráneo del embrión en el ventrículo lateral, e inyecte de dos a tres microlitros de la mezcla de plásmidos de ADN en cada ventrículo. A continuación, sostenga la cabeza del embrión entre los electrodos de pinza de platino en el ángulo apropiado para apuntar al área cerebral deseada, con el cátodo mirando hacia el área donde se pretende la transferencia de ADN.
Para la electroporación en el útero, después de sacar los cuernos uterinos y colocar los embriones en una gasa húmeda como se demostró anteriormente, use las yemas de los dedos para rotar suavemente el embrión dentro del útero hasta que se localicen las suturas lambdoidal y salimental. Luego inserte cuidadosamente el capilar de vidrio que contiene la mezcla verde rápida de ADN a través de la pared uterina y el cráneo del embrión en el ventrículo lateral, e inyecte de dos a tres microlitros de la mezcla de plásmidos de ADN en uno o ambos ventrículos según lo desee con un máximo de dos microlitros por ventrículo. Después de la inyección, sostenga la cabeza del embrión entre los electrodos de pinza de platino en el ángulo apropiado para apuntar al área cerebral deseada con el cátodo mirando hacia el área donde se pretende la transferencia de ADN.
Una vez que todos los embriones requeridos hayan sido electroporados, use un bastoncillo de algodón empapado en solución salina para colocar suavemente los cuernos uterinos dentro de la cavidad abdominal. Sutura las incisiones musculares y cutáneas con material de sutura 5-0, luego asegure la herida con clips de sutura y desinfecte la herida rociándola con betadina. Coloque el ratón de nuevo en la jaula de recuperación y mantenga el calor utilizando una luz de calentamiento infrarroja lejana durante al menos 20 minutos después del procedimiento.
Fije la cabeza del embrión bajo un microscopio de disección. Luego retire la piel del cráneo cortando a lo largo de la línea media a partir de la base de la cabeza hacia la nariz. Pelar la piel en el cráneo lateralmente haciendo un espacio lo suficientemente grande como para que el cerebro sea extirpado.
A continuación, para extraer el cerebro, inserte la punta cerrada de las tijeras de disección estériles que comienzan debajo del bulbo olfatorio y se mueven hacia el tronco encefálico. Luego corte el tronco encefálico y recorte muchos trozos sueltos de meninges alrededor del cerebro. Usando una cuchara perforada, recoja el cerebro y elimine el exceso de líquido frotando el fondo de la cuchara contra el papel de seda seco.
Luego coloque el cerebro en un plato de agarosa sobre hielo. A continuación, utilizando una cuchara más pequeña mezclar la agarosa durante 10 segundos para un enfriamiento uniforme, luego maniobrar el cerebro hasta el centro del plato colocándolo horizontalmente con el lado dorsal hacia arriba y asegurándose de que esté completamente cubierto con agarosa desde todas las direcciones. Recoja suavemente el bloque de agarosa de la estación de trabajo Vibratome y seque la parte inferior frotando contra papel de seda.
Luego coloque el bloque en el área pegada del soporte de la muestra con el lado rostral del cerebro hacia arriba, y coloque el soporte de la muestra en hielo. Deje que el pegamento se seque durante un minuto. Corte el cerebro en rodajas coronales en un ángulo de 15 grados.
Luego, usando espátulas limpias, recoja las rodajas de cerebro y colóquelas en una membrana de PTFE inmovilizada en un plato de fondo de vidrio de 35 milímetros con Parrafin. Recoge hasta cinco rebanadas cerebrales por membrana. A continuación, utilizando una pipeta de 200 microlitros, elimine el exceso de solución de glucosa HBSS de alrededor de las rodajas en la membrana dejando las rodajas semisecas, luego agregue 500 microlitros de medios de rebanadas precalentados directamente al espacio debajo de la membrana e incube las rodajas a 35 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
Para obtener imágenes del crecimiento del axón, localice una región de la corteza con densidad celular baja a media. Mientras que para obtener imágenes de la dinámica del cono de crecimiento, ubique un cono de crecimiento en la zona inmediata o zona subventricular de la corteza. A continuación, defina un tamaño de pila Z.
Para el crecimiento del axón en una pila Z grande, establezca un tamaño de paso de dos micrómetros y para los conos de crecimiento en una pila Z más pequeña, establezca un tamaño de paso de un micrómetro. Para el análisis de datos, abra el archivo de imagen en Fiji haciendo clic en archivo, luego abrir y seleccionando la imagen. Obtenga la proyección de intensidad máxima del lapso de tiempo haciendo clic en la imagen, seguida de pilas, proyección Z y proyección de intensidad máxima.
Revise el lapso de tiempo y localice un axón en crecimiento. Una vez localizado, dibuje una línea a través del axón en crecimiento, comenzando desde la punta del axón en el primer fotograma y siguiendo el axón a través de todo el lapso de tiempo. A continuación, canta el plugin kymo re-slice wide.
Establezca la escala del kymograph yendo a la imagen, luego a las propiedades. Después de establecer la distancia en micrómetros, y el ancho de píxel y el tiempo en segundos o minutos, y la altura de píxeles, vaya a analizar y haga clic en medir. Para medir el volumen del cono de crecimiento, abra el archivo de imagen en el software de análisis de imágenes haciendo clic en archivo, abrir y seleccionando el archivo de interés.
A continuación, seleccione el asistente para agregar nuevas superficies en el paso uno, en configuración del algoritmo, seleccione segmentar solo una región de interés y, en el paso dos, recorte el marco para que se ajuste a todo el cono de crecimiento en todos los fotogramas. A continuación, en el paso tres, mantenga el umbral a la intensidad absoluta y, en el paso cuatro, asegúrese de que toda la región del cono de crecimiento esté en el umbral. Luego, en el paso cinco, en el tipo de filtro, seleccione el número de vóxeles LMG a uno.
Seleccione el botón Ejecutar para realizar todos los pasos de creación y finalizar el asistente para agregar nuevas superficies. Finalmente, en la pestaña de estadísticas en la parte superior de la ventana del asistente, seleccione valores y volumen específicos en la pestaña detallada. Por lo general, las rebanadas cerebrales cultivadas con éxito derivadas de la electroporación en el útero o ex útero muestran una distribución celular normal y una matriz organizada de glía radial con procesos de contacto pilo orientados apicalmente.
Ocasionalmente se observa una electroporación ex utero marcadas alteraciones en el andamio glial radial y cortes cerebrales cultivadas que hacen recomendable esta tinción de control. Aquí se muestra una neurona proyecttical cortical piramidal representativa que expresa Lyn-mNeonGreen y el comportamiento dinámico de su cono de crecimiento. Además, las neuronas se etiquetaron utilizando una sonda de actina que expresa plásmidos para analizar la dinámica de la actina de los conos de crecimiento axonal in situ.
También se realizaron experimentos in situ con un diseño de plásmido de fluoróforo cre dre dual, donde los fluoróforos tRFP o ZsGreen podrían activarse específica e individualmente mediante recombinasas dre o cre, respectivamente en neuronas vecinas. A partir de los kymographs, se obtienen fácilmente parámetros de crecimiento dinámicos como la velocidad de crecimiento de varios axones y el volumen del cono de crecimiento a lo largo del tiempo. Esto se puede utilizar para evaluar la velocidad de la cinta de correr con actina y el equilibrio entre filopodia y lamellapodia durante la actividad de exploración del cono de crecimiento.
Es importante mantener la estructura cerebral y ajustar las concentraciones de plásmidos para lograr un etiquetado escaso. Esto es crucial para la visualización precisa de los axones y los conos de crecimiento en la corteza. Dependiendo de los plasmas seleccionados y los antecedentes genéticos, este protocolo permite a los usuarios modificar las neuronas o el entorno en el que crecen, lo que permite una amplia gama de estudios.
Al permitir el acceso de alta resolución a las neuronas in situ, esta técnica permite a los neurocientíficos interrogar la interacción dinámica entre los conos de crecimiento y las métricas del sistema nervioso central tanto a nivel morfológico como molecular.
