Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (U54CA143906 a KGP, OJTM y R01HL101972 a OJTM) y una Fundación de Investigación Médica de Oregon Investigator Award Early Clínica (KGP). OJTM es un Investigador Establecido Asociación Americana del Corazón (13EIA12630000). Agradecemos al Dr. Eric Anderson, del Instituto del Cáncer Knight para preparar muestras de células utilizadas en este trabajo.

1. Microscopio Especificaciones Para llevar a cabo las imágenes de la manera correcta el microscopio debe tener las siguientes especificaciones: <ol><li> Poseer tanto contraste de interferencia diferencial (DIC) y campo claro (BF) de contraste. </li><li> Tener movimiento según el eje Z controlado por ordenador. </li><li> Tener un tope de apertura ajustable para variar la apertura numérica de la lente de condensador. Se requiere una abertura con una regla graduada o de lectura electrónica para conocer el valor de la apertura numérica. La apertura numérica debe variar de 0,1 para NIQPM hasta 0.9 (o superior) para HTDIC. </li><li> El microscopio debe tener un filtro de color de banda estrecha para ser utilizado para la formación de imágenes de campo brillante. Se requiere este filtro para fijar el incremento de refracción, una factura de longitud de onda dependiente utilizada para convertir la fase de densidad de masa para NIQP. </li></ol> 2. Diferencial de contraste de interferencia (DIC) Adquisición Z-stack <ol><li> Abra el software de un SlideBooknd crear una nueva diapositiva para la colección de imágenes. </li><li> A continuación, abra la ventana de enfoque. En la sección Establecer filtro, seleccione DIC. En la ficha Cobertura, en la sección del condensador, ajuste la barra deslizante de apertura a la posición más a la derecha (abierto todo el camino). Esto proporciona iluminación de alta apertura numérica y mejora seccionamiento óptico de la muestra. </li><li> Centrarse en la muestra usando un objetivo de la CID. Ajuste la intensidad de la lámpara halógena hasta que la muestra es fácilmente visible. Para asegurarse de que la cámara no está siendo saturado, seleccione la ficha Cámara en la Ventana de enfoque y compruebe que el histograma de intensidades de los píxeles está dentro del rango dinámico de la cámara. </li><li> Abra la ventana de captura de imagen. En la sección Tipo de captura, marque la casilla 3D. En la sección de captura 3D, seleccione la Cordillera por el centro y volver a la ubicación actual </strong&gt; cajas y especifique el rango de la dirección Z, número de planos y dimensiones de los pasos. El rango de la dirección Z debe incorporar toda la muestra. </li><li> En la sección de juego de filtros de la ventana de captura de imagen, marque la casilla DIC y especificar el tiempo de exposición. En la sección de información de la imagen, el nombre de la imagen (opcional) y seleccione Iniciar para iniciar la formación de imágenes. </li></ol> 3. Campo brillante (BF) Adquisición Z-stack <ol><li> Una vez que el microscopio ha terminado de recoger la DIC Z-pila de la muestra, abra la ventana de enfoque y seleccione Abrir en la sección Conjunto de filtros. Ajuste el control deslizante de apertura en la posición izquierda más alejada (cerrado hasta el final) para proporcionar una iluminación baja NA. </li><li> Cambie el filtro de luz del microscopio a verde. Ajuste la intensidad de la lámpara halógena hasta que la muestra es visible. Asegúrese de que no hay saturación de la cámara, seleccione el <strong&gt; ficha Cámara en la Ventana de enfoque y la comprobación de que el histograma de intensidades de los píxeles está dentro del rango especificado. </li><li> Abra la ventana de captura de imagen. Se mostrarán los ajustes de captura en 3D a partir de la adquisición de Z-stack DIC. </li><li> En la sección de juego de filtros de la ventana de captura de imagen, marque la casilla OPEN y especificar el tiempo de exposición. En la sección de información de la imagen, el nombre de la imagen (opcional) y seleccione Iniciar para iniciar la adquisición de imágenes Z-stack. </li></ol> 4. Exportación de Z-stack Imágenes <ol><li> Abra una captura de Z-stack. Cambiar la vista al 100%. Ajuste el histograma de los valores de los píxeles que se mostrarán entre 0 y el valor máximo de píxeles de la cámara (4095 para 12 cámaras bits, 65.535 para 16 bits.). </li><li> Seleccione Ver&gt; Exportar&gt; Serie TIFF. Esto exportará el Z-stack como una serie de imágenes TIFF(Una para cada plano Z). Guarde la serie TIFF en una carpeta separada con un nombre que tiene un guión bajo al final (es decir, &quot;DIC Pila 1_&quot;). Repita esto con cada pila Z DIC o BF. </li></ol> 5. Mediciones del Volumen <ol><li> Abra el programa HTDIC MATLAB titulado &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;. </li><li> Bajo la Sección 0 del programa HTDIC, actualizar la variable de directorio de dependencias. Copia y pega el directorio que contiene el hilbert_transform_dic.m y archivos sobel_edge_detect.m desde el explorador (PC) entre las comillas simples siguiente &quot;dependencies_directory =&quot;. ExecuteSection 0 del programa JoVE_HTDIC_v1.m. </li><li> En la Sección 1, actualice la &quot;images_directory&quot;. Una vez más, copie y pegue el directorio que contiene las imágenes a través de enfoque en. Forma tif entre las comillas simples. La única carrera SECCIÓN 1 VEZ. </li><li> La alineación y la rotación de imágenes para Hilbert transforman Run Sección 2 del código. Aparecerá un cuadro de diálogo titulado &quot;Definición de Parámetros HTDIC&quot;. Cinco Numbers se requieren por parte del usuario: el número de plano focal donde la imagen DIC de la muestra está en el foco, resolución lateral (m / píxel en la imagen), la resolución axial (esto es 0,1 para la adquisición de imágenes en 0.1 micras pasos axiales), el ángulo de rotación de la imagen DIC necesarios para realizar la transformada de Hilbert, los valores típicos son 45 y -135. Por último, entrar en la región de tamaño de interés, este parámetro define la longitud de un lado de una caja que posteriormente aparecerá - valor típico es 400. Haga clic en Ok. </li><li> Una imagen del plano focal DIC especificado por el número de plano focal aparecerá con un recuadro azul. Coloque la caja sobre la característica de interés, por ejemplo, una célula. La caja no tiene que ser cuadrado. Una vez que la caja se ha colocado sobre la región deseada, haga doble clic dentro del área. </li><li> Otra figura aparecerá ahora: esta figura contiene una imagen recortada y girada de la región de interés seleccionada en el paso anterior. El contraste de la imagen debe ser talcaracterísticas que oscuras aparecen a la izquierda mientras que las características brillantes en la derecha. Arrastre el cuadro azul sobre la región de interés, formar de nuevo si es necesario. </li><li> Sección 3 genera una máscara para el cubo Z-pila. Hay dos tipos de máscaras disponibles: una máscara rectangular para crear un rectángulo alrededor de la célula y una herramienta de mano alzada para delinear la célula de interés con la mano. </li><li> Para generar una máscara rectangular, línea 167 y descomentar la línea de comentario 170 (comentar una línea a cabo mediante la colocación de un &quot;%&quot; al principio de esa línea). Ejecutar la Sección 3 del programa. Haga clic en la imagen y arrastre el ratón para empezar a definir la máscara rectangular. Haga doble clic en el cuadro que aceptarlo. </li><li> Para generar una máscara a mano, línea de comentario 167 y la línea 170 uncomment y ejecutar la Sección 3. Haga clic y dibuje la máscara que desee con el ratón. Haga doble clic en la máscara que aceptarlo. </li><li> Sección Ejecutar 4to construir el Hilbert transforma pila de imágenes DIC y la correspondiente imagen Pila DIC de la zona de interés.La máscara construida en la Sección 3 se aplicará a la transformación de Hilbert pila DIC y la pila normal DIC cuando &quot;Maskon&quot; está establecido en 1 en la línea 179. Ajuste &quot;Maskon&quot; a 0 construirá pilas de imágenes sin aplicar la máscara. </li><li> Ejecute la Sección 5 para optimizar la segmentación de la imagen de la cruz xz imágenes seccionales de la región de interés. Figura 500, producido por el programa, aparece la visualización de tres tipos diferentes de contraste. El éxito del algoritmo para encontrar los bordes de la celda depende de una combinación de la máscara utilizada y el valor de &quot;umbral&quot; en la línea 229 del programa. Comience con un valor de 0,5. Ajuste el valor de umbral y vuelva a ejecutar esta sección del programa hasta que se logre el delineamiento adecuado en una de las columnas. </li><li> Si el delineamiento fue mejor en la columna 1, utilice la sección 6 para determinar el volumen utilizando DIC segmentación de imágenes. Si la columna 2 dio óptimos resultados, ejecute la Sección 7 para determinar el volumen de células de transformada de Hilbert de imágenes DIC. Si la columna 3 gave los resultados óptimos, ejecutará la Sección 8 para determinar el volumen utilizando filtrada-Fourier transformada de Hilbert de imágenes DIC. </li><li> El volumen medido de la muestra, se informa en m cúbico (FL) se presenta en el título de la figura 600, 700, o 800 producido por el programa en función de la cual se elige de medición de volumen. </li></ol> 6. Medición de la Masa <ol><li> Abra el programa NIQPM MATLAB titulado &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;. </li><li> Bajo la Sección 0 del programa NIQPM, actualizar la ubicación de tres directorios necesarios para ejecutar el programa. Estos son los &quot;dependencies_directory&quot;, el &quot;brightfield_directory&quot;, y el &quot;dic_directory.&quot; </li><li> A continuación, ejecute la Sección 1. Esta sección de código genera un campo brillante imagen Cubo del campo lleno de todo el conjunto de imágenes. La única carrera SECCIÓN 1 VEZ. </li><li> A continuación, ejecute la Sección 2. Aparecerá un cuadro de diálogo titulado &quot;Definición de Parámetros NIQPM&quot;. Cuatro números se requieren por parte del usuario: el número de plano focal donde la imagen de campo claro de lala muestra está en el foco, la resolución lateral (m / píxel en la imagen), la resolución axial (esto es 0,1 para la adquisición de la imagen en 0,1 micras pasos axiales), y la región de tamaño de interés, este parámetro define la longitud de un lado de un caja que posteriormente aparecerá - un valor típico es 200. Haga clic en Ok. </li><li> Una imagen del plano focal brillante campo especificado por el número de plano focal aparecerá con un recuadro azul. <ol><li> Si la imagen no está enfocada, haga doble clic en el cuadro azul y vuelva a ejecutar la Sección 2, asegúrese de ajustar el número de plano focal en el cuadro de diálogo. </li><li> Si la imagen está en foco, arrastre el cuadro azul alrededor de la imagen y cambiar su tamaño mediante la selección de los nodos de la caja y arrastrar según sea necesario. Coloque la caja alrededor de la característica de interés, por ejemplo, una célula. La caja no tiene que ser cuadrado. Haga doble clic dentro del cuadro para aceptarlo. </li></ol></li><li> A continuación, ejecute la Sección 3 para construir una pila de imágenes de campo claro cultivada en la región de enterés. </li><li> Para generar el mapa de fases, DIC imagen de pseudo, y las comparaciones con la imagen verdadera DIC brillante imaginería campo y, a correr la Sección 4. </li><li> Con el seudo DIC y verdaderas imágenes DIC como similares como sea posible el mapa de densidad de masa, masa total, y el histograma de la densidad celular se puede determinar mediante la ejecución de la sección 5a o 5b. Sección 5a lleva a cabo la detección automatizada de pensionista del campo - optimizar &quot;umbral&quot; en la línea 300 - valores típicos varían entre 0,1-1. Vuelva a ejecutar esta sección según sea necesario para optimizar el valor de umbral. Sección 5b lleva a cabo la determinación de masas, etc después de que el usuario describe la célula de interés. </li></ol>

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Los autores no tienen intereses financieros en los trabajos presentados.

En general, NIQPM es una técnica de difracción limitada validado en longitudes de trayectoria óptica que van desde 0,25 hasta 44,7. La validación se realizó en n = 1.596 esferas de poliestireno que varían en diámetro desde 0,11 hasta 9,8 micras en suspensión en Fluoromount G (datos no mostrados). Las células poseen longitudes de trayectoria óptica que van desde casi 0-7. Cuando se mide la distribución de la densidad de una muestra se puede encontrar que la imagen DIC seudo ve bien...

El uso de microscopía óptica es ahora omnipresente en la investigación de organismos celulares. Debido a su absorbancia y dispersión débil propiedades endógenas bajo sobre el espectro óptico visible, las células no afectan en gran medida la amplitud de las ondas ópticas que atraviesan ellos y por lo tanto aparecen semitransparente cuando reflejado con microscopios de campo brillante estándar. Muestras celulares no, sin embargo, reducir la velocidad ondas ópticas que viajan a través de ellos de una manera que está relacionada linealmente con la cantidad de densidad de masa local en una región particular del espacio a través del cual la luz viaja. La utilización de este lapso de tiempo heterogéneo o perfil &quot;fase&quot; de las ondas ópticas transmitidas a través de las muestras microscópicas fue descrita por primera vez en 1935 por Frits Zernike 1 y experimentalmente se dio cuenta por Zernikein 1942 2. Zernike fue galardonado con el premio Nobel en 1953 por este logro. Zeiss comercializó esta modalidad en 1945 3. En 1955, Smith y Nomarskme volvería a presentar su trabajo inicial sobre el uso de 4 y 5 de la teoría de contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía, una modalidad que utiliza el gradiente espacial de fase como un mecanismo de contraste. DIC fue comercializado por Zeiss en 1965in estrecha colaboración con Nomarski 6. En 1981, dos laboratorios demostraron la primera célula viva DIC imágenes grabadas con la incorporación de cámaras de vídeo en el tren de la óptica del microscopio DIC 7, 8. La era de imágenes de células vivas nació. Desde este momento, la ejecución de tanto de contraste de fases y DIC en microscopios comerciales ha sido en gran parte sin cambios. Estos métodos se utilizan principalmente por los biólogos para producir imágenes de las células para los propósitos cualitativos: monitorización de la morfología, el seguimiento de las estructuras subcelulares, y las investigaciones de dinámica de la membrana 9. Estas técnicas son de carácter cualitativo en su configuración &quot;off-the-shelf&quot; ya que tanto la fase y DIImágenes C son funciones arbitrarias de la intensidad de la fuente de luz, la configuración óptica de iluminación, y ganancia de la cámara CCD, gamma y los ajustes de exposición. Una pequeña legión de físicos e ingenieros ópticos se ha esforzado por hacer que las modalidades de imágenes comerciales cuantitativa. Entre los primeros esfuerzos fueron dos cartas a la Naturaleza en 1952 y 1953 en los que el médico-biofísico convertido Robert Barer demostrado el uso de la microscopía de fase para determinar la masa seca celular de las células mediante la estimación de los cambios de fase a través de estos tipos de células usando un microscopio de fase disponible en el mercado 10, 11. El campo se ha desarrollado una multitud de técnicas en los años siguientes con base en torno a tres mecanismos de contraste sin etiquetas básicas: microscopía de fase 10,11, DIC microscopía 12-17, 18-22 y luminosa de campo para determinar la longitud del recorrido óptico, la fase, la masa densidad, índice de refracción, y el volumen celular. En el párrafollel, una gran colección de instrumentos ópticos personalizados también se han desarrollado desde la década de 1950, y han hecho de gran alcance mediciones ópticas que van desde aplicaciones en el crecimiento del parásito 23, a documentar el ciclo celular 24 a la investigación de la dinámica de la membrana de las células rojas de la sangre 25. En particular, los últimos diez años se ha producido una gran cantidad de microscopía cuantitativa libre de marca en forma de microscopía de fase de difracción 26, microscopia tomográfica fase 27, la microscopia holográfica digital 28, sensible a la fase de microscopía de coherencia óptica 29, la microscopía de interferencia espacial de luz 30, Hilbert fase de la microscopía de 31 años, y la microscopía de fase cuantitativa 32. A pesar de sus éxitos colectivos, estos instrumentos no han sido difundidos en el campo más amplio de investigadores biológicos, debido, sobre todo, a su compleja instrumentación y requerimientos computacionales. Aquí nos describe el uso de un microscopio óptico estándar para llevar a cabo las mediciones cuantitativas de la masa, volumen y densidad en muestras celulares a través de una combinación de campo claro y DIC imágenes. Se presentan dos enfoques principales: la microscopía de fase cuantitativa noninterferometric (NIQPM), para llevar a cabo mediciones de la masa celular total y la distribución de la densidad subcelular, y la transformada de Hilbert microscopía de contraste diferencial de interferencia (HTDIC), para determinar el volumen. Las principales ventajas de NIQPM y HTDIC yacían en su accesibilidad tecnológica. Las condiciones de formación de imágenes requeridas para su ejecución exitosa están dentro del alcance de la operación normal de la mayoría de los microscopios disponibles comercialmente. Además, los algoritmos de procesamiento posterior son estables, rápida y robusta - habiendo sido implementado en MATLAB utilizando algoritmos de transformada rápida de Fourier (FFT) basadas siempre que sea posible. NIQPM es un método para reconstruir de fase y la densidad de masa integrado axialmente de CELespecímenes lular de brillante imaginería campo. La suma de esta densidad de masa integrado axialmente sobre el área de la muestra da el contenido en masa seca total de la muestra. El protocolo NIQPM se basa en los fundamentos experimentales establecidas por Paganin y Nugent 18, 19 - en el que se demostró que el perfil de fase de una célula podría ser reconstruido a partir través de enfoque de campo brillante imágenes de la muestra - y el trabajo teórico de Frank , Altmeyer, y de Wernicke 20 - en la resolución de los modelos de onda paraxial de una manera eficiente basado en FFT. La conexión de fase a la densidad de masa seca se basa en el trabajo por Barer 10, 11 y Popescu 33. Información volumétrica se puede obtener de a través de enfoque DIC imágenes bajo altas condiciones de iluminación NA que permiten seccionamiento óptico de la muestra a lo largo del eje óptico. Transformada de Hilbert de procesamiento en la imagen pilas DIC mejora muchoalgoritmos de detección de bordes para la localización de las fronteras de muestras en tres dimensiones mediante la separación de los valores de gris de la intensidad de la muestra de las del fondo. Este trabajo se origina con Arinson et al. 34 aunque hemos introducido los dos métodos de filtrado de Fourier para mejorar el contraste y un método de detección de borde a base de Sobel para el análisis automatizado volumétrica de la muestra. También hemos validado HTDIC anteriormente en esferas de poliestireno que varían en tamaño desde el límite de difracción de hasta 20 m de diámetro 36. Mientras tanto NIQPM y HTDIC son tecnológicamente accesible debido a su desarrollo en microscopios comerciales, los métodos son fundamentalmente limitadas por la configuración de hardware de los propios microscopios. Las principales limitaciones de estas técnicas son de dos tipos: z-stack tiempo de adquisición lento en ámbitos comerciales, debido a la traducción de toda la etapa de la muestra en lugar de sólo la lente del objetivo, Limita la investigación de los fenómenos más rápido que más o menos 1 marco / minuto, y en segundo lugar, los efectos de difracción restringen la utilidad de NIQPM y HTDIC a los objetos que van en tamaño desde 0,2 hasta 10 y 20 m de diámetro, respectivamente. Por lo tanto, la muestra y su dinámica de tiempo asociados de interés deben cumplir con cierto tamaño y restricciones temporales para permitir el uso de estos métodos en los instrumentos típicos &quot;off-the-shelf&quot;. Emocionantemente, la mayoría de los especímenes celulares fijos son investigados fácilmente con estos métodos. Una visión general del NIQPM y protocolos HTDIC se dan en la Figura 1. En la figura 2 se ilustra la imagen óptima y subóptima a través de enfoque en condiciones tanto de baja y alta iluminación NA, tanto para campo claro y DIC imágenes. Las figuras 3 y 4 muestran la dependencia de parámetros del algoritmo NIQPM destacando implementaciones exitosas y no exitosas. <strong&gt; Figura 5 ilustra los pasos involucrados en el algoritmo de procesamiento de imágenes HTDIC y demuestra la óptima implementación del algoritmo para determinar el volumen celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager 2 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>Axio Imager D2</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green filter (&#955; = 540 &#177; 25 nm)</td>
			<td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td>
			<td>D540/25x</td>
			<td>Green filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 5.5 software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td>
			<td></td>
			<td>Image acquistion software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td>
			<td>PS06N</td>
			<td>Polystyrene spheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative optical microscopy: measurement of cellular biophysical features with a standard optical microscope

Se describe el uso de un microscopio óptico estándar para llevar a cabo las mediciones cuantitativas de la masa, volumen y densidad en muestras celulares a través de una combinación de campo brillante y contraste de interferencia diferencial imágenes. Se presentan dos enfoques principales: la microscopía de fase cuantitativa noninterferometric (NIQPM), para llevar a cabo mediciones de la masa celular total y distribución de la densidad subcelular, y transformada de Hilbert diferencial microscopía de contraste de interferencia (HTDIC) para determinar el volumen. NIQPM se basa en un modelo simplificado de la propagación de ondas, llamadas a la aproximación paraxial, con tres supuestos básicos: apertura numérica baja (NA) de iluminación, dispersión débil y débil absorción de la luz por la muestra. Afortunadamente, muestras celulares sin teñir satisfacen estos supuestos y bajo iluminación NA se consigue fácilmente en microscopios comerciales. HTDIC se utiliza para obtener información volumétrica de DIC imágenes a través de enfoque a alta Illumin NAcondiciones ación. Iluminación de alta NA permite mejorada de seccionamiento de la muestra a lo largo del eje óptico. Transformada de Hilbert de procesamiento en la imagen DIC apila en gran medida mejora algoritmos de detección de bordes para la localización de las fronteras de muestras en tres dimensiones mediante la separación de los valores de gris de la intensidad de la muestra de las del fondo. Las principales ventajas de NIQPM y HTDIC yacían en su accesibilidad tecnológica utilizando microscopios &quot;off-the-shelf&quot;. Hay dos limitaciones básicas de estos métodos: z-stack tiempo de adquisición lento en ámbitos comerciales actualmente abroga la investigación de los fenómenos más rápido que 1 cuadro / minuto, y en segundo lugar, los efectos de difracción restringen la utilidad de NIQPM y HTDIC a los objetos desde el 0,2 hasta el 10 (NIQPM) y 20 (HTDIC) micras de diámetro, respectivamente. Por lo tanto, las muestras y su tiempo asociado dinámica de interés deben cumplir con cierto tamaño y restricciones temporales para permitir el uso de estos métodos. Emocionante, cellula más fijoespecímenes r son investigados fácilmente con estos métodos.

Iluminación de la muestra correcta durante la adquisición de imágenes a través de enfoque es fundamental para la implementación exitosa de la NIQPM A ND algoritmos HTDIC. En la Figura 2 se ilustra de baja y alta iluminación NA bajo tanto DIC y contraste de campo claro para una esfera de poliestireno y la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano SW620. Figuras 2A, 2C, 2I, y 2K demuestran de formación de imágenes óptima para NIQPM. <st...

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Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Microscopía óptica cuantitativa: Medición de Biofísica Celular Características con un microscopio óptico estándar

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K vistas.  Oregon Health & Science University, School of Medicine. We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Investigación

Bioingeniería

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

A Cre-Lox P Enfoque de recombinación para la detección de la fusión celular En Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

La síntesis in vitro de Espaciado nativo, y colágeno fibroso Long Long segmentaria Espaciado

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen Óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor detección por fluorescencia de la gotita de microfluídica el uso de fibras ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted membrana plasmática Entrega de cargo encapsulado hidrofóbico en un cristal líquido portador de nanopartículas

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

Fabricación y caracterización de tejido óptico fantasmas que contiene macroestructura

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...