Esta metodología permite explorar el comportamiento mecánico de los eritrocitos, caracterizando sus parámetros viscoelásticos y características vítreas suaves para diversas condiciones fisiológicas y patológicas. Nuestro método basado en una sola célula verifica las referencias de video utilizando los valores de metal para el factor de forma que relaciona las fuerzas y los desplazamientos, las tensiones y los rasguños en la superficie de los eritrocitos. Comience vertiendo grasa de silicona sobre la superficie del anillo de goma de una manera que cubra todo el perímetro.
A continuación, coloque el anillo de goma en el cubreobjetos con el lado de la grasa orientado hacia el cubreobjetos. Espere cinco minutos para la fijación adecuada, y los portamuestras estarán listos para recibir el cultivo celular. A continuación, con la solución de células previamente preparada siguiendo el protocolo escrito, sembrar las células en el portamuestras.
Agregue 0.2 microlitros de una solución de esfera de poliestireno al 10% volumen por volumen a la muestra. Coloque el segundo cubreobjetos sobre el anillo de goma. Cierre la configuración y finalice la preparación de la muestra.
Finalmente, mueva toda la muestra al microscopio. Para comenzar con la experimentación, use el sistema OT, atrape la esfera con el láser OT y luego conéctela al cubreobjetos, cerca de la célula. Luego, atrape otra esfera y repita el mismo procedimiento de fijación presionando la esfera contra la superficie de la celda, cerca de la superficie superior y cerca del borde de la celda.
Añadir una función sinusoidal de amplitud y frecuencias variables. A continuación, presione el botón "start", usando la etapa piezoeléctrica para permitir el desplazamiento piezoeléctrico. Mantenga la esfera RBC en la trampa y envíe la muestra a un ciclo de movimientos utilizando la función sinusoidal previamente establecida.
Para el análisis, abra el software ImageJ e importe toda la película obtenida durante los movimientos sinusoidales. Haga clic en ajustar y luego seleccione el umbral de opción. Ajuste el umbral con ambas barras de desplazamiento y seleccione la esfera de referencia haciendo clic en archivo, seguido de rectángulo.
Luego, en la pestaña analizar, haga clic en la opción "establecer medidas" y seleccione el centro de masa". Haga clic de nuevo en la pestaña analizar y seleccione analizar partículas. Aparecerá una nueva ventana que contiene una tabla con coordenadas xy para el centro de la masa.
Repita el procedimiento para la otra esfera unida a la superficie RBC. Abra el software de análisis e importe los archivos txt obtenidos anteriormente. Genere una gráfica con los centros de masa en el eje y y el tiempo en el eje x.
Trazar los resultados en un gráfico usando el eje x para la constante de pérdida, denotado por K primo doble, y el eje y para la constante de almacenamiento, denotado por K primo. Primero, para la adquisición de video, mueva la etapa piezoeléctrica en la dirección xy, utilizando el software para buscar una celda aislada unida al cubreobjetos. Atrape y fije una esfera de poliestireno de diámetro conocido a la superficie RBC.
A continuación, usando la etapa piezoeléctrica, mueva la cuenta atrapada unida a la superficie RBC para deformar la celda y luego conecte la cuenta al labio de la cubierta. Ahora, cambie la posición del eje z para encontrar la imagen enfocada. Después de fijar la posición, use el software de la cámara para crear una película de toda la celda.
Luego, mueva la posición del eje z dos micrómetros hacia abajo o hacia arriba para obtener una imagen desenfocada para la celda elegida. Finalmente, sin cambiar la posición del eje z, busque una región sin celdas para repetir el mismo procedimiento y cree una película del fondo de la imagen. Para la adquisición de imágenes de contraste, primero busque el valor de N cero, haga clic en el icono de selección de polígono, luego haga clic en la pestaña analizar y seleccione la medida.
A continuación, use la ecuación de contraste para determinar N imagen menos N cero, y ejecute esto seleccionando matemáticas"en proceso, seguido de restar. Más tarde, divida el resultado por N cero menos B.Finalmente, encuentre el contraste para las imágenes enfocadas y desenfocadas. Ahora, use la transformada de Hartley para obtener el grosor RBC.
En ImageJ, haga clic en proceso, seguido de las opciones FFT" y FFT, y luego elija FHT. Luego realice la transformación inversa FHT seleccionando el proceso, seguido de FFT" y FFT. Utilice la imagen resultante para obtener el perfil de altura.
Después de encontrar la imagen que contiene el perfil de altura RBC, use el contraste desenfocado de dos micrómetros para crear un conjunto de dos imágenes en ImageJ. Para encontrar el factor de forma, utilice una macro personalizada de ImageJ para analizar la pila. La macro entregará una tabla con la posición del borde, el perímetro, el inverso del perímetro y una imagen de la celda analizada.
Compruebe si los bordes de esta imagen son similares a los bordes de la figura de referencia. De lo contrario, repita el procedimiento y use la suma del inverso del perímetro para encontrar el factor de forma. Comience organizando los datos experimentales en una tabla.
Cree una nueva tabla en el software de análisis haciendo clic en la pestaña de archivo. Determine 10 columnas diferentes para los parámetros. Para trazar la curva G primo y G doble primo en el software de análisis, utilice los datos de la tabla anterior y haga clic en el botón "gráfico".
Para obtener los parámetros Gamma y GM, haga clic en la pestaña de ajuste de curva y seleccione fit1" para abrir una nueva ventana. Seleccione el cuadrado, haga clic en el botón definir y escriba la ecuación. Haga clic en el botón "Aceptar" en ambas ventanas, y aparecerá el accesorio.
A continuación, cree otras dos gráficas, a saber, G primo y G doble primo en función de omega. Coloque las barras de error solo en el eje y, como se demostró anteriormente. Repita el procedimiento de ajuste de curva, seleccione la opción G".
Haga clic en definición de curva" en ajuste general y, a continuación, escriba la ecuación correspondiente. Finalmente, haga clic en aceptar y aparecerá un ajuste de curva junto con los valores de Alfa y G cero. Nuevamente, realice otro procedimiento de ajuste de curva.
Seleccione G"opción, haga clic en definición de curva" en ajuste general y, a continuación, escriba la ecuación correspondiente. Finalmente, haga clic en aceptar y aparecerá un ajuste de curva. La figura muestra la constante elástica de almacenamiento en función de la constante elástica de pérdida.
La dependencia lineal observada demuestra que la superficie RBC puede considerarse un material vítreo blando. Al aplicar los valores para el factor de forma celular general y el grosor de la superficie de RBC, se pueden determinar los valores para el exponente Alfa. Esta técnica puede proporcionar la base para nuevos métodos de diagnóstico que correlacionan los cambios en las propiedades viscoelásticas de los eritrocitos con modificaciones en el flujo sanguíneo de individuos con diferentes patologías.
