Subvención de apoyo: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Centro de Biofotónica Ciencia y Tecnología (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ negrita), La Investigación Consejo de Noruega, Leiv Eiriksson Beca de Viaje 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung agradece también el apoyo de la Comunidad al Fondo de Dotación cáncer Auburn. RJ Negrita también reconoce el apoyo de la J. McDonald dotación. Damos las gracias a la Dra. Jenny Wei-Jen Kung y el Dr. Bor-wen Wu en DesigneRx para el suministro abundante de ADI.

1. Parte 1: Cultivo de células y etiquetado inmuno-fluorescencia <ol><li> Grow CWR22 RV1 células de tumor de próstata humanos en cubreobjetos de vidrio (# 1,5 o 170 m de espesor) colocado en placas de 6 pocillos, con RPMI (Mediatech, VA) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina / glutamina. </li><li> Inducir la autofagia mediante el tratamiento de las muestras seleccionadas con la arginina deiminasa (ADI, 0,3 g / ml) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). </li><li> Fijar las células con 4% de paraformaldehído (PFA, Fisher Scientific, NH) diluido en PBS; 100 l por cubreobjetos, durante 10 min a TA. </li><li> Lavar las células 3 veces con 1 ml de HBS / BSA. </li><li> Permeabilizar las células con 0,05% de saponina (Sigma, MO) en HEPES (HBS) / BSA, 100 l por cubreobjetos, durante 15 min a TA. </li><li> Antes de inmuno-etiquetado, las muestras de bloques con 2,5% de caseína (Sigma, MO) en HBS / BSA, 100 l por cubreobjetos, para 1 hora a TA. </li><li> Se incuban las células fijas con anticuerpos primarios diluidos en 2,5% de caseína / HBS / BSA, 100 l por coverslip, O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar las células 3 veces con 1 ml de HBS / BSA. </li><li> Se incuban las células fijas con anticuerpos secundarios diluidos en 2,5% de caseína / HBS / BSA, 100 l por cubreobjetos, durante 1 hora a TA. </li><li> Lavar las células 3 veces con 1 ml de HBS / BSA. </li><li> Monte cubreobjetos preparados en portaobjetos de vidrio regulares con el oro SlowFade o prolongar Gold antifade reactivo (Invitrogen, CA) que contiene 4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol (DAPI). </li><li> Bordes Seal cubreobjetos con esmalte de uñas. Para obtener los mejores resultados de imagen, dar tiempo (idealmente O / N) para los medios anti-fade penetre a fondo las células. </li><li> Superficie cubreobjetos limpio con metanol y / o cloroformo. </li><li> Añadir aceite de inmersión (índice de refracción 1,520 cuando se generan imágenes a 37 ° C, o cuando se generan imágenes 1.516 a TA) a la lente objetivo NA 60X 1,42 (Olympus, Japón). </li><li> Posición de la corredera en la platina del microscopio y establecer el foco con las células de interés. </li></ol> 2. Parte 2: Preparación de las células para imágenes en vivo <ol><li> Crecer CWR22 RV1 células que expresan fluorescente acoplado a la proteína de la cadena Verde claro 3 (LC3-GFP) en medio de cultivo RPMI que contenía 10% de FBS y 1% de antibióticos en placas de cultivo de 35 mm con fondo de vidrio recubiertos con poli-D-lisina (MatTek, MA). Las células se deben colocaron en placas a una densidad suficiente para facilitar la rápida proliferación, pero no tanto que las células están cubiertas y agrupadas por el tiempo de formación de imágenes. </li><li> Tratar muestras de células seleccionadas con IDA (0,3 g / ml) en PBS. </li><li> Aproximadamente 1 hora antes de la imagen, diluir 1,5 l de LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) con 20 ml de RPMI. que contiene 10% de FBS y 1% de antibióticos. Utilice las soluciones que contienen ADI para las muestras seleccionadas. Calentar todos los medios a 37 ° C antes de la adición a la placa de cultivo. </li><li> Se incuban las células con RPMI que contiene LysoTracker Red DND-99 de 15 a 45 min a 37 ° C. </li><li> Aproximadamente 30 minutos antes de la proyección de imagen, encienda la caja del medio ambiente WeatherStation y permitir que se equilibre a 37 ° C y 5% CO 2 (con Humidifaire IED). </li><li> Lavar las células con PBS y reemplazar los medios de comunicación con el estándar RPMI que contiene sólo el 10% de SFB y el 1% de antibióticos. Añadir IDA a las muestras como se indica. </li><li> Montaje de 35 mm cubreobjetos de fondo placas de cultivo de adaptador personalizado (Applied Precision, Inc., WA) y la posición en la platina del microscopio. Utilice aceite de inmersión (índice de refracción 1,520) en la lente objetivo de 60X 1,42 NA, y la posición de la placa de cultivo montado en el escenario. </li></ol> 3. Parte 3: Microscopía deconvolución y análisis El protocolo de esta sección se presupone el uso del microscopio Personal deconvolución DV DeltaVision y asociados suite de aplicaciones SoftWorx (Applied Precision, Inc., WA). <ol><li> Encienda el sistema de microscopio, como estación de trabajo de adquisición y control de instrumentos. Abra la aplicación Resolve3D para inicializar la platina del microscopio y se convierten en la fuente de luz de xenón. Permita 10 minutos para la fuente de luz para calentarse y alcanzar condiciones estables. </li><li> Añadir ungota de aceite de inmersión (índice de refracción 1,520 para las muestras en vivo a 37 ° C o 1.516 para muestras fijadas a TA) en la lente objetivo NA 60X 1,42, y el centro de la muestra de diapositivas (cara de hoja de la cubierta hacia abajo) sobre la lente del objetivo. </li><li> El uso de cualquiera de iluminación de campo brillante o externa y el mando de ajuste grueso del enfoque, aumentar lentamente la lente del objetivo hasta que el talón de aceite de inmersión hace contacto con el vidrio de cubierta invertida. (A partir de este punto, la capa celular debe entrar en foco dentro de un par de vueltas de la perilla de ajuste de enfoque fino). Cuando se trabaja con muestras fijadas en los portaobjetos, se recomienda evitar las células dentro o cerca de las áreas con burbujas. Cuando se ve con muestras vivas en el plato de fondo de vidrio, evitar mover la lente objetivo fuera de los límites de la cubreobjetos de vidrio. </li><li> Autofagosomas pueden ser identificados por eGFP señal (verde). Los lisosomas son identificados por LysoTracker Red (muestra viva) o inmunofluorescencia anti-Lamp1 (muestra fija). Los núcleos celulares se identifican mediante DAPI staining (muestra fija). </li><li> Seleccione el campo de visión deseado. Idealmente, las células deben exhibir una buena señal fluorescente en todos los canales apropiados, y suficientemente adheridas y se extienden sobre la superficie del cubreobjetos para que los contenidos intracelulares son fáciles de visualizar. Pequeños ajustes en x laterales, Y y Z de enfoque pueden ser controlados por ordenador mediante la interfaz Acquire3D. Conjunto binning a 1x1 o 2x2, dependiendo de campo de visión deseado (más células pueden ser vistos en el campo cuando binning se establece en 2x2). </li><li> Para una imagen dada a través de la sección media de una célula, establecer los parámetros de exposición (por ejemplo, la potencia de transmisión% y el tiempo de exposición) de tal manera que la intensidad de píxel máximo no exceda 3.000 conteos. Generalmente,% de transmisión debe ajustarse lo más bajo posible, sin aumentar el tiempo de exposición correspondiente más de 1 seg. Repita este procedimiento para cada color de la fluorescencia en ser fotografiado y para cada campo separado de vista de obtener imágenes de la mejor calidad. </li><li> Establezca la ulímites pper e inferior de la Z-stack, ajustando el foco sólo un poco más de la parte superior e inferior de la muestra de células, respectivamente. El número total de imágenes en un determinado Z-pila por lo tanto será determinado por estos límites y por la separación entre las capas (valor por defecto: 0,2 micras). </li><li> Para minimizar los artefactos de movimiento durante la adquisición de imágenes, se recomienda ajustar el modo de adquisición de la imagen de &quot;longitud de onda entonces z-stack&quot; para muestras fijas, y &quot;z-stack a continuación la longitud de onda&quot; para las muestras en vivo. </li><li> Las imágenes de fluorescencia se deconvolved usando SoftWorx (Applied Precision, WA) y después analizados utilizando Volocity (Improvision, ahora Perkin Elmer, MA). </li></ol> 4. Parte 4: Super-resolución, estructurado-iluminación (OMX) Microscopía El protocolo de esta sección se aplica a la utilización de la OMX Microscopio Iluminación Estructurada (Applied Precision, WA). <ol><li> Encienda la alimentación principal y láseres que desee (410 nm, 488 nm y / o 532 nm). Espere 20 millasn para los rayos láser se térmicamente estabilizado. </li><li> Añadir aceite de inmersión (índice de refracción de 1,516 muestras fijadas en RT) en la lente objetivo de 60X 1,42 NA. Si se ven burbujas en la gotita de aceite, limpie el objetivo y agregue aceite nuevo. </li><li> Coloca diapositiva muestra en el escenario y en su caso, deje 10 minutos para que las células se asientan en cubreobjetos. </li><li> Inicialice el programa de adquisición. Utilice iluminación de fluorescencia para ajustar el enfoque hasta que un contorno afilado de la célula puede ser visto. (Se debe tener cuidado en todo momento para minimizar la exposición de las células a la excitación de fluorescencia, hasta que la adquisición de la imagen real). </li><li> Una tomografía espiral mosaico se puede adquirir una vista previa de las áreas más grandes de la muestra para seleccionar las células o regiones de interés. Se recomienda el uso de tiempos de exposición cortos (1-10 ms) y de baja potencia de excitación (0,1-1% de transmisión) durante la exploración de la muestra o la búsqueda de objetivos. </li><li> Identificar autofagosomas por fluorescencia de GFP-LC3. Identificar los lisosomas por Alexa Fluor 555 anti-LÁMPARA(Proteína de membrana asociada a lisosoma) y núcleos de las células usando DAPI (muestras fijos). </li><li> Elija condiciones experimentales, incluyendo la longitud de onda de excitación, área de la imagen (por ejemplo, 512x512), el grosor de pila, el tiempo de exposición, y el porcentaje de transmisión de láser. Para imágenes súper resuelto, asegúrese de que la opción de iluminación estructurada está habilitada. Para microscopía deconvolución en la OMX, seleccione la opción de iluminación convencional. </li><li> Para obtener los mejores resultados de la reconstrucción, seleccionar las condiciones experimentales de tal manera que el número máximo de intensidad es de entre 10.000 y 15.000 durante la adquisición. Si fotoblanqueo es una preocupación, se puede usar la imagen en una exposición menor (cuenta entre 5.000 y 10.000). Idealmente, los recuentos no deberían disminuir más de un factor de dos durante toda la adquisición, y disminuye en más de un factor de cuatro deben ser evitados. Si es necesario, reducir el grosor de pila para asegurar un conteo intensidad sostenida. La cámara se satura a 64.000 conteos, lo máximo enintensidad nunca debe superar esto. Para obtener buenas muestras, encontramos las condiciones experimentales para ser 10 ~ 50 ms de tiempo de exposición a la transmisión de láser 1%. Se prefieren las muestras brillantes y fotoestable que se pueden obtener imágenes en varias ocasiones. Se requiere una mancha estable para time-lapse, imágenes súper resueltos. </li><li> Para reducir el ruido, una velocidad de lectura de 95 MHz (opción de velocidad media) y el tiempo de adquisición de 2 ms o más se recomienda. El aumento de los artefactos se obtienen en la imagen formada reconstruida, cuando la muestra se mueve durante la adquisición. Debido a este efecto, se recomiendan exposiciones cortas para las células no adherentes o de movimiento rápido. </li><li> Formación de imágenes multicanal se puede realizar de forma simultánea o secuencialmente. Rendimientos modo secuencial menos diafonía y por lo tanto se recomienda. </li><li> Para reducir photobleaching, en general se recomienda a la imagen con longitudes de onda de excitación más largos primero (532 nm, 488 nm, 410 nm y, a continuación). Sin embargo, para los resultados experimentales mostrados en la Figura 3, esta orden fue inversod (es decir, 48 nm, 532 nm y 410 nm) debido a la fotoestabilidad de esta muestra en particular. </li><li> Ajuste el límite superior / inferior de la Z-stack moviendo la platina del microscopio hasta que la parte superior / inferior de las células es ligeramente fuera de foco. La distancia deseada entre cada imagen debe mantenerse constante a 0.125 m de súper resolución de imagen, como el software de reconstrucción de tomar este valor como predeterminado. </li><li> Reconstruir pilas de imágenes utilizando SoftWorx (Applied Precision, WA) y analizar el uso de 6,0 Volocity (Perkin Elmer, MA). </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis.">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li><li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line.">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li><li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism.">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li><li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes.">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li><li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2/Bcl-X(L).">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li><li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRAM,+a+p53-induced+modulator+of+autophagy,+is+critical+for+apoptosis.">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li><li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers:+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation.">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li><li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Mientras que la observación directa de las células marcadas con sondas fluorescentes contra LC3 es ampliamente aceptado como un método estándar para confirmar la respuesta autofagia 6, cuantitativa imágenes en 3D del mismo sistema (como lo hemos hecho) proporciona información y detalles sin precedentes sobre el complejo proceso de autofagia celular . En particular, se observa que cientos (si no miles) de autofagosomas en células vivas se forman dentro de 80 min de la inducción de la autofagia. Del mis...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Deiminase (ADI)</td>
			<td>DesigneRx</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-mouse 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21244</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Lamp1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>H4A3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#3195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-1.4-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.1, 22 mm coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#2865-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1324G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy

El cáncer de próstata es la forma principal de cánceres entre los hombres en los EE.UU. Mientras que la cirugía conlleva un riesgo significativo de la impotencia y la incontinencia, los enfoques quimioterapéuticos tradicionales no han tenido éxito. La terapia hormonal es efectiva en una etapa temprana, pero a menudo se produce el eventual desarrollo de tumores hormono-refractario. Hemos estado interesados ​​en el desarrollo de terapias dirigidas a la deficiencia metabólica específica de las células tumorales. Recientemente, hemos mostrado que las células de tumor de próstata específicamente carecen de una enzima (argininosuccinato sintasa, o ASS) que participan en la síntesis del aminoácido arginina 1. Esta condición hace que las células tumorales a ser dependiente de arginina exógena, y se someten a estrés metabólico cuando arginina libre se agota por la arginina deiminasa (ADI) 1,10. En efecto, hemos demostrado que las células de cáncer de próstata humano CWR22 RV1 mueren eficazmente por ADI con la apoptosis independiente de caspasas y autopha agresivagía (o macroautofagia) 1,2,3. La autofagia es un proceso evolutivamente conservada que permite a las células para metabolizar las proteínas no deseadas por la descomposición lisosomal durante la hambruna nutricional 4,5. Aunque los componentes esenciales de esta vía son bien caracterizados 6,7,8,9, muchos aspectos del mecanismo molecular aún no están claros - en particular, ¿cuál es el papel de la autofagia en la muerte-la respuesta de las células del cáncer de próstata después del tratamiento ADI ? Para abordar esta cuestión, se requiere un método experimental para medir el nivel y el alcance de la respuesta de la autofagia en las células - y puesto que no hay marcadores moleculares conocidos que pueden rastrear con precisión este proceso, se optó por desarrollar un enfoque de imágenes basada en el uso de microscopía de fluorescencia cuantitativa 3D 11,12. Usando CWR22Rv1 células específicamente marcados con sondas fluorescentes para autofagosomas y lisosomas, se muestra que las pilas de imágenes 3D adquiridos, ya sea con widefield microscopía de deconvolución (y más tarde, con super-resolución, microscopía estructurada-iluminación) puede capturar claramente las primeras etapas de inducción de la autofagia. Con aplicaciones de análisis de imágenes digitales disponibles en el mercado, podemos obtener fácilmente la información estadística sobre el número autofagosoma y lisosoma, el tamaño, la distribución, y el grado de colocalización de cualquier célula con imagen formada. Esta información nos permite rastrear con precisión el progreso de la autofagia en las células vivas y permite que nuestra investigación continua sobre el papel de la autofagia en la quimioterapia del cáncer.

La secuencia de imágenes se muestra en la Figura 1 muestra los cambios físicos que se producen en las células CWR22 durante la primera 80 minutos de la inducción de la autofagia. En este y otros estudios (no se muestra) se observó consistentemente: (1) el desplazamiento del núcleo de distancia desde el centro de la celda; (2) la reducción de los puntos de adhesión focal, y (3) translocación general de autofagosomas y lisosomas hacia el centro de la célula. Además, también se observó un pequ...

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Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

La autofagia es un proceso ubicuo que permite a las células para degradar y reciclar las proteínas y orgánulos. Aplicamos microscopía de fluorescencia avanzada para visualizar y cuantificar la pequeña, pero, cambios físicos esenciales asociados con la inducción de la autofagia, incluyendo la formación y distribución de autofagosomas y lisosomas, y su fusión en autolisosomas.

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

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17.8K vistas.  University of California, Davis. La autofagia es un proceso ubicuo que permite a las células para degradar y reciclar las proteínas y orgánulos. Aplicamos microscopía de fluorescencia avanzada para visualizar y cuantificar la pequeña, pero, cambios físicos esenciales asociados con la inducción de la autofagia, incluyendo la formación y distribución de autofagosomas y lisosomas, y su fusión en autolisosomas.

Video: Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Investigación

Biología

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

Análisis cuantitativo de la migración desordenada de las células mediante microscopía de Time-lapse vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Análisis de la autofagia en<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por la inanición Pads en combinación con microscopía de fluorescencia

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identificación de Kinesin-1 Cargos El uso de microscopía de fluorescencia

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source de análisis de contenidos de alta Utilizando microscopía de fluorescencia automatizado de imágenes por vida

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Proyección de imagen funcional de fábricas de transcripción Viral mediante microscopia de fluorescencia 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...