MH reconoce el apoyo de la &quot;Deutsche Forschungsgemeinschaft&quot; (DFG). Autor contribuciones: MH diseñado investigación; KT, JS y MT realiza investigación y analizó los datos; KT y MH escribió el documento.

1. El cultivo de Chlamydomonas <ol><li> La siguiente C. reinhardtii cepas fueron utilizadas en el presente estudio: PESO cc124, WT cw15-Arg7 (pared celular deficiente y arginina auxotroph), una cepa mutante ΔPSI 29 y un pgrl1 cepa ronda 4. </li><li> Todas las cepas se cultivaron en Tris-Acetato-fosfato (TAP)-medio 30, a 25 ° C con una intensidad de luz continua de 20-50 E · / m 2 seg y agitación a 120 rpm. La cultura de ΔPSI debe ser envuelto con un poco de papel de seda para la exposición a la luz de &lt;5 E · / m 2 s. </li><li> Los cultivos de las cepas etiquetados (ΔPSI y WT cc124, respectivamente) contenían 7,5 mM 15 N NH 4 Cl, mientras que los cultivos de las cepas no marcado (WT-cw15 Arg7 y pgrl1, respectivamente) contenían 7,5 mM 14 N NH4Cl. Las células tienen que crecer por lo menos durante cuatro geiones para lograr el etiquetado completo y se deben mantener en la fase de crecimiento exponencial. </li><li> En el día antes de comenzar el experimento y recuento de células diluidas hasta una densidad de 1 x 10 6 células / ml en un volumen de al menos 750 ml / cepa. </li></ol> Tenga en cuenta que dos tipos de gradientes de densidad discontinuo de sacarosa se describen en el siguiente protocolo. Los gradientes de densidad de sacarosa de acuerdo con el fotosistema Takahashi et al. 9 se utilizan para separar los diferentes complejos de proteínas fotosintética de los tilacoides aisladas y solubilizados durante durante la noche centrifugación y tienen que ser preparado el día antes (véase el Protocolo 2) y los gradientes de densidad de sacarosa tilacoides 8 se aplican en el procedimiento de aislamiento tilacoide (ver Protocolo n º 3). 2. Preparación de los gradientes de densidad de sacarosa Fotosistema <ol><li> Para verter los gradientes son necesarios tres soluciones madre: <ol><li> 2 M de sacarosa </li><li> 10% β-DM en H 2 O </li><li> 0,5 M de Tricina, pH 8,0 (NaOH) </li></ol></li><li> El uso de estas poblaciones, se preparan las siguientes soluciones: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> Concentración: </td><td style="width:75px;"> 1,3 M </td><td style="width:75px;"> 1,0 M </td><td style="width:75px;"> 0,85 M </td><td style="width:75px;"> 0,7 M </td><td style="width:75px;"> 0,65 M </td><td style="width:75px;"> 0,4 M </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 2 M de sacarosa </td><td style="width:75px;"> 13 ml </td><td style="width:75px;"> 10 ml </td><td style="width:75px;"> 8,5 ml </td><td style="width:75px;"> 7 ml </td><td style="width:75px;"> 6,5 ml </td><td style="width:75px;"> 4 ml </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 10%46;-DM </td><td style="width:75px;"> 100 l </td><td style="width:75px;"> 100 l </td><td style="width:75px;"> 100 l </td><td style="width:75px;"> 100 l </td><td style="width:75px;"> 100 l </td><td style="width:75px;"> 100 l </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 0,5 M de Tricina </td><td style="width:75px;"> 200 l </td><td style="width:75px;"> 200 l </td><td style="width:75px;"> 200 l </td><td style="width:75px;"> 200 l </td><td style="width:75px;"> 200 l </td><td style="width:75px;"> 200 l </td></tr><tr height="20"><td height="21" style="height:20px;width:94px;"> H 2 O </td><td style="width:75px;"> 6,7 ml </td><td style="width:75px;"> 9,7 ml </td><td style="width:75px;"> 11,2 ml </td><td style="width:75px;"> 12,7 ml </td><td style="width:75px;"> 13,2 ml </td><td style="width:75px;"> 15,7 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Utilice tubos x 89 mm de centrífuga de 14 mm y verter los gradientes muy lentamente, comenzando con la solución más alta de densidad de sacarosa a la solución de menor densidad. </li><li> Vierta sólo 1 ml de cada uno de los 1,3 y 1,0 M y 2 ml de soluciones para el resto de las soluciones. </li><li> Deja gradientes de la noche en el cuarto frío. </li></ol> 3. Anaerobio Inducción y aislamiento de Thylakoid Membranas 8 <ol><li> Antes de comenzar con el aislamiento de membranas tilacoides, inducir condiciones anaeróbicas por burbujeo con argón durante 4 h. El burbujeo se puede realizar a través de una pipeta de vidrio en el cultivo de matraces con mezcla constante de la cultura con una barra de agitación magnética. </li><li> Comenzar con el aislamiento de las membranas tilacoides mediante sedimentación de las células durante 5 min a 2.500 xg, se resuspende en tampón H1 (0,3 M de sacarosa, 25 mM de HEPES (pH 7,5), 5 mM de MgCl 2). (Tenga en cuenta que cuando se empieza con el aislamiento de los tilacoides muestras membranas shOuld mantenerse en hielo para evitar la degradación de proteínas, todas las etapas de centrifugación se llevan a cabo a 4 º C y el trabajo con los guantes es muy recomendable para evitar la contaminación de la queratina.) </li><li> Precipitar las células durante 5 min a 2.500 xg, se resuspende en tampón H1. </li><li> Romper las células con dos pases a través de un nebulizador con una presión de nitrógeno de 1500 hPa (para las cepas sin pared celular hacer un solo paso). </li><li> Centrifugar las células durante 7 min a 2500 x g. (Después de este paso, el sobrenadante debe ser de color verde claro, si no, la rotura celular no tuvo éxito.) </li><li> Resuspender las células en tampón de H2 (0,3 M de sacarosa, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) y células de pellets durante 10 min a 32.800 x g. </li><li> Resuspender las células en tampón de H3 (1,8 M de sacarosa, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) y homogeneizar de pellets con un alfarero (no hay partículas verdes deben permanecer en el extremo de este paso de trabajo). </li><li> Preparar los gradientes de densidad de sacarosa tilacoides en la bañeraES (25 mm x 89 mm) comenzando en la parte inferior con una capa de 12 ml de tampón H3 con las células, se vierte una capa de medio de 12 ml de tampón de H4 (1,3 M de sacarosa, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM ( pH 8,0)) y en la parte superior 12 ml de tampón H5 (0,5 M de sacarosa, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)). Tenga cuidado al verter los gradientes y evitar la mezcla de las tres capas. </li><li> Equilibrio con tampón H5 y los gradientes de densidad de sacarosa tilacoides de centrifugación durante 1 hora a 70.700 x g. </li><li> Retire las bandas de tilacoides de los gradientes de densidad de sacarosa y los tilacoides diluir con un volumen de tampón apropiado H6 (5 mM de HEPES (pH 7,5) 10 mM EDTA (pH 8,0)). </li><li> Centrifugar las células a 37.900 xg durante 20 min. Si la pastilla no está apretado, se requiere más memoria intermedia H6 para este paso de centrifugación. </li><li> Resuspender tilacoides en un tampón H6 pequeño volumen y proceder con la determinación de la concentración de clorofila. </li></ol> 4. Determinación de la Concentración clorofila 31 </sup&gt; <ol><li> La determinación de la cantidad de clorofila se lleva a cabo con 80% de acetona. </li><li> Mezclar 995 l 80% de acetona y 5 l de tilacoides en tampón H6 (dilución 1:200). </li><li> Vortex durante varios segundos hasta que no haya partículas permanecen verdes y luego girar hacia abajo a 14,1 × g durante 5 min. </li><li> Tome el sobrenadante y medir la extinción a 663.6 y 646.6 nm y 750 nm, respectivamente. </li><li> Calcular la cantidad de clorofila usando las siguientes fórmulas: <ol><li> C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * factor de dilución </li><li> C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663.6) * factor de dilución </li><li> C Chl [mg / ml] = C Chl a + C Chl b </li></ol></li></ol> 5. La carga de los gradientes de densidad de sacarosa Fotosistema <ol><li> Calcular las cantidades de los tilacoides, β-DM y el tampón H6 que se necesitanpara cada gradiente: <ol><li> Cada gradiente debe ser cargado con un volumen total de 700 l con 0,8 mg / ml de clorofila en el 0,9% β-DM (disolver β-DM en H 2 O), llenar el volumen restante con tampón H6. </li></ol></li><li> Para la solubilización preparar diferentes alícuotas con tilacoides, β-DM y tampón H6 para cada gradiente. </li><li> Deja muestras durante 20 min en hielo con la mezcla regularmente (inversora) cada pocos minutos (etapa de solubilización). </li><li> Se centrifuga a la velocidad máxima (14.000 xg) durante 10 min a 4 ° C. (Después de la centrifugación, el pellet debe ser pequeña y de color blanquecino, mientras que el sobrenadante es de color verde oscuro.) </li><li> Cargar sobrenadante en los gradientes. </li><li> Equilibrio con tampón H6 y girar utilizando ultracentrífuga a 134.470 xg durante la noche (14 horas) a 4 ° C. (Tenga en cuenta que la separación exitosa de complejos fotosintéticos utilizando gradientes de densidad de sacarosa fotosistema tal como se presenta en este protocolo sólo se logra cuando using recién aisladas tilacoides, desde una predicción para la solubilización y separación compleja es difícil de realizar cuando se trabaja con las membranas tilacoides que han sido congelados antes.) </li></ol> 6. El fraccionamiento de los gradientes de densidad de sacarosa Fotosistema <ol><li> Tome fotos de los gradientes. </li><li> Perforar un agujero en la parte inferior del tubo utilizando una aguja y gradientes se fraccionan en tubos de 500 mL. Alternativamente, el fraccionamiento también se puede realizar mediante el uso de una placa de 96 pocillos (microplaca). </li><li> Cuando se utiliza una microplaca, determinar la absorbancia de las diferentes fracciones de gradiente a 675 nm. (En este paso las muestras pueden ser almacenadas a -80 ° C durante unas semanas.) </li></ol> 7. SDS-PAGE e inmunodetección (Tenga en cuenta que sólo para la comparación de PESO vs ΔPSI se ha realizado un análisis de Western blot para seleccionar las fracciones para su posterior MS-análisis. Para el experimento PESO vs pgrl1 fracciones fueron escogidos por medio de la absorbancia en las diferentes fracciones.) <ol><li> Separa 30 l de cada fracción de WT y ΔPSI gradiente en un gel de poliacrilamida SDS 13% 32. </li><li> Realizar análisis de Western blot 33 utilizando los siguientes anticuerpos: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, el PSAD subunidad PSI 32 y el PSII D1 subunidad central. Utilice todos los anticuerpos con una dilución de 1:1.000 (para mejorar la técnica de detección de quimioluminiscencia), excepto para el anticuerpo D1, que se debe utilizar con una dilución de 1:10.000. </li><li> Con base en los resultados de la inmunodetección, tome las fracciones de los picos de ANR1, PGRL1 y PSAD para WT y ΔPSI (aquí fracciones 6 y 13, respectivamente), mezclar 30 l de la fracción 6 de WT y ΔPSI y hacer lo mismo con la fracción 13 de ambas preparaciones y los separan de nuevo en un gel de poliacrilamida SDS al 13%. </li><li> Para la comparación cuantitativa de PESO vs pgrl1 tomar la C-EF Supercomplejo fracciones como se determina mediante la medición de la absorbancia en las diferentes fracciones del gradiente y mezclar 30 l de ambas muestras seguido de la separación en un gel de poliacrilamida SDS al 13%. </li><li> Tinción de las bandas de proteína con solución de Coomassie (ácido fosforoso 85%, sulfato de amonio 757 mM, 1,2% azul brillante de Coomassie, 20% de metanol) durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Para quitar manchas inespecífica, lavar varias veces con ddH 2 O. </li><li> Cortar los carriles en 1 mm piezas de gel y proceder con la digestión en gel. (De forma alternativa, las muestras se pueden secar unos minutos en una centrífuga de vacío y se almacenan durante un par de semanas antes de continuar con la digestión en gel.) </li></ol> 8. En la digestión-gel (Modificado de Shevchenko et al. 35) A tener en cuenta para preparar todos los tampones y soluciones poco antes de su uso y tomar botellas de vidrio para tampones que contienen acetonitrilo (ACN). &lt;br /&gt; ¡CUIDADO! Trabajar con ACN podría ser perjudicial, más información se puede descargar de: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013). <ol><li> Lávese las piezas de gel con&gt; 10 volúmenes de ddH2O (~ 200 l) durante 30 segundos. </li><li> Incubar las piezas de gel con 300 l de 25 mM NH 4 HCO 3 de 15 min con agitación, eliminar el líquido. </li><li> Incubar las piezas de gel con 300 l de 25 mM NH 4 HCO 3 en 50% de ACN (preparar mediante la mezcla de ACN y 50 mM NH 4 HCO 3 en una proporción de 1:01) durante 15 min con agitación, eliminar el líquido. </li><li> Si las piezas de gel siguen azules, repita el NH 4 HCO 3 y NH 4 HCO 3 / ACN se lava hasta que la mayoría del Coomassie se retira. (Aunque la mayor parte de la tinción de Coomassie se debe quitar, no es necesario destain las piezas de gel completamente.) </li><li> Añadir 100 l de ACN para deshidratar las piezas de gel durante 5 min. Las piezas de gel deben reducir unnd aspecto completamente blanco. </li><li> Quite la mayor cantidad ACN como sea posible y continuar con la digestión con tripsina. Alternativamente, las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C durante unas pocas semanas. </li><li> Añadir 10-20 l por banda de 20 ng / l de tripsina en 10% de ACN / 25 mM NH 4 HCO 3 (recién diluido), mantener las muestras en hielo. </li><li> Después de 30 minutos, comprobar si toda la solución se absorbe y agregar más memoria intermedia tripsina, si es necesario. Piezas de gel deben estar completamente cubiertos con tampón de tripsina. Mantener las muestras en hielo. </li><li> Deja piezas de gel durante otros 90 minutos en hielo para saturar con tripsina. (Paso crítico: el rendimiento de péptidos trípticos aumenta considerablemente con el aumento de los tiempos de incubación en hielo, probablemente a causa de la lenta difusión de la enzima en la matriz de poliacrilamida Es necesario contar con un pequeño exceso de solución que cubre las piezas de gel para evitar que las piezas. caer en seco durante la incubación durante la noche.) </li><li> Digerir a 37 º C durante 4-6 horas. Para los experimentos que requierenrecuperación péptido máxima, digerir durante la noche. </li><li> Después de la digestión de girar búfer condensada. </li><li> Tubos déjelos en remojo durante 5 min para eluir los péptidos y centrifugar de nuevo. </li><li> Recoger el sobrenadante y transferir a un tubo nuevo. </li><li> Realizar la extracción de péptido con 80 l de 30% / 1% de ácido fórmico ACN (FA) en un baño de ultrasonidos durante 15 min. </li><li> Realizar la extracción con 80 l de 30% de ACN / 1% FA en un baño de ultrasonidos durante 15 min. </li><li> Realizar la extracción con 80 l de 70% de ACN / 1% FA en un baño de ultrasonidos durante 15 min. </li><li> Se centrifuga de nuevo y la piscina sobrenadante con el eluido anterior. (FA sirve para inactivar la tripsina y aumentar la solubilidad del péptido.) </li><li> Solución de péptido seco por completo en una centrífuga de vacío. (En este punto, las muestras pueden ser almacenadas por un par de semanas en -20 ° C antes de proceder con MS-análisis.) </li><li> Péptidos Resuspender en 6 l MS tampón (5% ACN, 0,1 v / v FA, agua) y déjelos en remojo durante 2-5 min. </li><li> Centrifugar las muestras a maximuVelocidad m durante 5 min para eliminar el material particulado. </li><li> Utilice 4 l de sobrenadante para el análisis de espectrometría de masas. </li></ol> 9. MS-Análisis de Datos con &quot;Proteomatic&quot; El análisis de los datos se realizó con el software de código abierto &quot;Proteomatic&quot; (que se puede descargar de la siguiente http://www.proteomatic.org/), una plataforma que permite la generación y terminación de MS / MS de las tuberías de evaluación de datos, mediante el uso de software libre y comercial 36. En pocas palabras, los ajustes se describen a continuación y la información más detallada se puede encontrar en 6,26. <ol><li> Identificación y cuantificación de datos MS- Identificación y cuantificación de proteínas a partir de los experimentos PESO vs ΔPSI se realizaron con OMSSA (versión 2.1.4 37) y qTrace 26, respectivamente, como se describe 6,26. Para el análisis de MS-datos del experimento PESO vs pgrl1 la siguiente tubería actualizado se utilizó:<ol><li> Además de OMSSA 37, las proteínas también se identificaron con X! Tandem (versión 1.2.2013 38). Ambos algoritmos se aplicaron mediante la búsqueda contra una base de datos generada por la combinación de la versión de la base de datos modelo de gen JGI Chlamydomonas 4.3 con la versión de la base de datos AUGUSTUS 10.2, así como contra una base de datos unido de la bases de datos NCBI BK000554.2 y NC_001638.1. </li><li> MS 2 identificación de los péptidos se realizó mediante el uso de un enfoque de objetivo-señuelo 39. Un señuelo para cada proteína fue creado por azar revolver péptidos trípticos sin perder la redundancia de péptidos nonproteotypic. </li><li> La validación estadística de los péptidos se realizó con el qvality software (versión 0.3.3 40) utilizando una probabilidad de error posterior (PEP) umbral de menos de 0,01 y los resultados se filtraron con una tolerancia de masa precursora de 5 ppm. </li><li> Los péptidos de OMSSA y X! Carreras Tandem se unieron y se cuantificaron con qTrace <sup&gt; 26 sobre aplicación de las siguientes medidas de filtro: requieren identificación MS 2, añadir nombres de las proteínas / información de grupo y requieren ambos péptidos hermanas. </li></ol></li></ol> Para investigar si la proteína ratios fueron significativamente diferentes el uno hacia el otro en las fracciones-CEF Supercomplejo mixtas de WT y pgrl1, se realizó un análisis estadístico vigente el software SPSS (versión 21). Las subunidades de la citocromo b 6 / f complejo se ensayaron frente a los demás, así como las proteínas FNR, FTSH2 y HCF136 contra las subunidades PSI. Las proporciones de péptido de cada número de exploraciones por la proteína de las cuatro réplicas se realizarán las pruebas de distribución normal mediante el test de Shapiro-Wilks. Dado que las poblaciones de péptidos no tenían distribución normal (p &lt;0,001), se realizaron estadísticas no paramétricas. En primer lugar, se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis evaluar una divergencia significativa entre los grupos. Sólo si esta prueba predijo diferencia significativas entre los grupos, se realizó un análisis adicional para predecir diferencias significativas entre los dos grupos independientes con la prueba de Mann-Whitney-U.

Los autores declaran no tener ningún interés financiero en competencia.

Diferentes estudios proteómicos cuantitativos utilizando el etiquetado de isótopos estables se han publicado en los últimos años. En estos experimentos se comparan generalmente de dos muestras diferentes, de las cuales una muestra se marca con un isótopo estable. A partir de entonces las proteínas o péptidos de las dos muestras se combinan en una proporción igual y procesados ​​adicionalmente juntos 48. Estos estudios a menudo tienen la intención de comparar los compartimentos definidos aislados ...

Procesos fotosintéticos en las membranas tilacoides de plantas y algas pueden funcionar en un modo lineal y cíclica. Durante el flujo lineal de electrones (LEF) fotosistema I (PSI), fotosistema II (PSII) y citocromo b 6 / f en última instancia, la transferencia de electrones del agua al NADP + 1, que conduce a la generación de NADPH y ATP 2. En contraste, el flujo cíclico de electrones (CEF), que es conocido por ser inducida bajo diversas condiciones ambientales como el estado 2 3 y 4, las condiciones anaeróbicas en los resultados de la re-reducción de la ISP oxidado mediante la inyección de electrones de nuevo en la cadena de transporte de electrones. Este proceso puede llevarse a cabo en el lado del estroma del citocromo b 6 / f complejo 1 o en la piscina plastoquinona 5 y genera ATP, pero no NADPH 2. El objetivo del protocolo presentado es demostrar una espectrometría de masas (MS) m basadaétodo para el análisis comparativo, cuantitativo de los complejos multiproteicos en las membranas tilacoides de Chlamydomonas reinhardtii que permite conocer mejor la composición de estos complejos en diferentes condiciones (ejemplificados mediante la comparación de cepas genéticamente diferentes). Este enfoque fue aplicado en una publicación de Terashima et al. En 2012 que muestra una Ca 2 +-dependiente de la regulación de la CEF en C. reinhardtii mediada por un complejo multiproteicos incluyendo las proteínas de CAS, ANR1 y PGRL1 6. El procedimiento se explica por comparativamente el análisis de la composición de la CEF-Supercomplejo en dos cepas genéticamente diferentes, aprovechando de este modo el etiquetado una de las dos cepas con nitrógeno pesado (15 N). Brevemente, el protocolo incluye la preparación de membranas tilacoides, seguido de la solubilización de detergente y fraccionamiento de complejos fotosintéticos en un gradiente de densidad de sacarosa. Después del fraccionamiento de la pendiente, seleccionado fracnes de dos cepas se mezclaron basan en un volumen igual, separadas por SDS-PAGE seguido de la digestión en gel y análisis por MS cuantitativa posterior. Como se mencionó anteriormente, CEF es inducida bajo diferentes condiciones ambientales y una publicación a partir de 2010 demuestra el aislamiento de un CEF-Supercomplejo funcional de estado 2 celdas bloqueadas de C. reinhardtii 7, que se lleva a cabo mediante la separación de las membranas tilacoides solubilizadas en un gradiente de densidad de sacarosa durante la ultracentrifugación. A diferencia de Iwai et al. 7, el protocolo presentado describe el aislamiento de la CEF-Supercomplejo de anaeróbico crecido C. culturas reinhardtii siguiendo un procedimiento alternativo. Este comprende cambios en el protocolo de aislamiento de tilacoide así como las diferencias relativas a la etapa de solubilización y la separación de complejos de proteínas por ultracentrifugación. En el presente protocolo, las membranas tilacoidesestán aislados mediante la aplicación del procedimiento publicado por Chua y Bennoun 8, mientras que los tampones usados ​​para la preparación tilacoide por Iwai et al. contenida Mes 25 mM, 0,33 M de sacarosa, 5 mM de MgCl 2, 1,5 mM de NaCl (pH 6,5) como se describe 9. La solubilización se realizó con 0,7-0,8% de detergente (n-tridecilo-β-D-maltósido) durante 30 min en hielo en el caso de Iwai y compañeros de trabajo, mientras que el método de solubilización descrito aquí se basa en el uso de 0,9% de detergente (N -dodecil-β-D-maltósido (β-DM)) y se lleva a cabo por sólo 20 min en hielo. Ambos grupos utilizaron 0,8 mg de clorofila por ml para la solubilización con la respectiva detergente. Para la separación de los complejos fotosintéticos de las membranas tilacoides solubilizadas Iwai et al. Aplicado concentraciones de sacarosa entre 0,1-1,3 M, mientras que los autores de este protocolo utilizado concentraciones que van desde 0,4 hasta 1,3 M. La última diferencia es la velocidad de centrifugación, que es más baja en comparación A la cupublicación rlier. La solubilización de las membranas tilacoides con detergentes no iónicos, seguido de fraccionamiento de gradiente de densidad de sacarosa ya se ha aplicado en numerosos estudios que van desde la década de 1980 hasta hoy 7, 9-14 y también la aplicación de marcaje metabólico de las proteínas es un método muy extendido en el campo de la proteómica. El enfoque descrito se aplica el etiquetado 15 N metabólica para una de las dos cepas en comparación mediante el cultivo en presencia de nitrógeno pesado como única fuente de nitrógeno en forma de 15 N NH4Cl, que se incorpora en todos los aminoácidos que conducen a una masa cambiar dependiendo de la secuencia de aminoácidos del péptido. Cuando el análisis de una mezcla de 14 N y 15 N dentro de una MS ejecuta, este cambio de masa se ​​puede utilizar para determinar el origen de la muestra para cada péptido y péptido relativa abundancia se puede calcular que representa la abundancia relativa para la correspondening proteína de 15. Numerosos estudios de proteómica cuantitativa sobre C. reinhardtii están disponibles, que compara una cantidad definida de proteínas para analizar los cambios en el proteoma entre las condiciones experimentales (por ejemplo, cambios en el proteoma de nutrientes debido a la 16-19 o la luz de estrés 20,21). En comparación con los estudios, en el enfoque que actualmente se presenta se combinaron y analizaron volúmenes iguales de muestras. Esta configuración permite estudiar el comportamiento de la migración de las proteínas dentro del gradiente y, además, para analizar la composición de diferentes complejos con respecto a las cepas investigadas. Este método se explicará mediante la concentración principalmente en tres proteínas: El primer candidato es la proteína sensor de calcio CAS-cloroplasto localizada, que ha demostrado estar implicado en la foto-aclimatación en C. reinhardtii 22. El calcio se considera que es una señal importanteción de iones de las vías que se activan debido a diferentes estreses bióticos y abióticos, finalmente, conduce a cambios en la expresión genética y la fisiología celular 23 y se propuso que los cloroplastos podrían contribuir a celular Ca 2 + señalización a través de la proteína CAS 22,24,25. La segunda proteína es ANR1 (respuesta anaeróbica 1 6), una proteína que ha demostrado ser inducida en condiciones de crecimiento anóxicas en C. reinhardtii 26. En particular, CAS, así como ANR1 se identificaron como subunidades de la CEF-Supercomplejo y por otra parte, mediante el uso de enfoques de genética inversa, se demostró que ambas proteínas contribuyen funcionalmente a CEF in vivo 6, apoyando su papel como subunidades funcionales de este complejo de proteínas. La tercera proteína es la proteína tilacoide PGR5-igual que 1 (PGRL1), que ha demostrado estar involucrados en CEF en Chlamydomonas 4,27, así como en Arabidopsis 5,28 y era también identified en la obra de Iwai et al. 7 Este enfoque será presentado por muestra los resultados de dos experimentos diferentes: de tipo salvaje (WT) versus (vs) una cepa ΔPSI 29, que presenta una deleción del gen PSAB, que codifica para un fotosistema esencial que la subunidad, que es también parte de la CEF-Supercomplejo y WT vs un pgrl1 ronda cepa 4. Para cada uno de esos experimentos la composición cuantitativa de la CEF-Supercomplejo entre un N-y una cepa 14 N-etiquetados se ha comparado 15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1135">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Chemicals</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Acetone</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Acetonitrile Optigrade f&#252;r LC-MS</td>
			<td style="width:427px;">Diagonal 
			website: https://www.diagonal.de/</td>
			<td style="width:119px;">9340</td>
			<td style="width:199px;">harmful, work with gloves 
			see protocol text for further precautions</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Ammonium chloride 15N</td>
			<td style="width:427px;">Cambridge Isotope Laboratories 
			website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm</td>
			<td style="width:119px;">39466-62-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium chloride 14N</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ammonium sulfate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td style="width:427px;">Fisher Scientific 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex</td>
			<td>10041653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">n-Dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Formic acid&#160;&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hepes</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td>A4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Methanol</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Phosphorous acid</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A0989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Di-Potassium hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Potassium di-hydrogenphosphate&#160;</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sucrose</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tricine</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A3954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Tris</td>
			<td style="width:427px;">AppliChem 
			webiste: http://www.applichem.com/home/</td>
			<td style="width:119px;">A2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer</td>
			<td style="width:427px;">Promega 
			website: http://www.promega.de/</td>
			<td style="width:119px;">V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;"></td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Equipment&#160;</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Neboulizer (BioNeb cell disruptor)</td>
			<td style="width:427px;">Glas-Col 
			website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Centrifuge tubes (14 x 89 mm)&#160; 
			for preparation of takahashi style gradients</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Centrifuge tubes 25 x 89 mm 
			for preparation of thylakoid isolation gradients&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;">344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fuchs-Rosenthal cell couting chamber</td>
			<td style="width:427px;">Diagonal 
			website: https://www.diagonal.de/</td>
			<td style="width:119px;">449/72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Homogenizer (Potter) 50 ml&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Fisherbrand 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">10618242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Pistil for homogenizer</td>
			<td style="width:427px;">Fisherbrand 
			website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">105252220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)</td>
			<td style="width:427px;">Beckman Coulter 
			website: http://www.beckmancoulter.de/</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;"></td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:392px;">Other</td>
			<td style="width:427px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:392px;">Antibodies&#160;</td>
			<td style="width:427px;">Agrisera 
			website: http://www.agrisera.com/en/index.html</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15n metabolic labeling and quantitative mass spectrometry

El protocolo introducido proporciona una herramienta para el análisis de complejos multiproteicos en la membrana tilacoide, mediante la revelación de conocimientos sobre composición compleja en diferentes condiciones. En este protocolo el enfoque se demuestra mediante la comparación de la composición de la proteína complejo responsable de flujo cíclico de electrones (CEF) en Chlamydomonas reinhardtii, aislado a partir de diferentes cepas genéticamente. El procedimiento comprende el aislamiento de membranas tilacoides, seguido por su separación en complejos multiproteicos por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, SDS-PAGE, y la inmunodetección, espectrometría de masas cuantitativa comparativa (MS) basados ​​en el marcaje metabólico diferencial (14 N / 15 N) de la cepas analizadas. Membranas tilacoides solubilizados detergentes se cargan en gradientes de densidad de sacarosa en una concentración igual clorofila. Después de ultracentrifugación, los gradientes se separan en fracciones, que se analizan en masa-spectrometry basado en el mismo volumen. Este enfoque permite la investigación de la composición dentro de las fracciones de gradiente y, además, para analizar el comportamiento de la migración de diferentes proteínas, centrándose especialmente en ANR1, CAS, y PGRL1. Además, este método se demuestra mediante la confirmación de los resultados con inmunotransferencia y además, mediante el apoyo a los hallazgos de los estudios anteriores (la identificación y la migración PSI-dependiente de las proteínas que se describieron anteriormente para ser parte de la CEF-Supercomplejo tales como PGRL1, FNR, y cyt f). Cabe destacar que este enfoque es aplicable a abordar una amplia gama de preguntas para las que este protocolo se puede adoptar y, por ejemplo utilizado para los análisis comparativos de composición compleja multiproteico aislado de las condiciones ambientales distintas.

El enfoque de la proteómica cuantitativa introducida tiene como objetivo caracterizar la composición de los complejos multiproteicos en las membranas tilacoides demostrados por el análisis comparativo de los componentes de CEF-Supercomplejo en diferentes genéticamente C. reinhardtii cepas. El método descrito con éxito ha sido aplicado por Terashima et al. 6 y comprende el aislamiento de membranas tilacoides de cultivos anaeróbicos crecido, seguido de la solubilización de detergente. ...

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A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

El enfoque descrito comparativa, cuantitativa proteómica tiene por objeto la obtención de conocimientos sobre la composición de los complejos multiproteicos bajo diferentes condiciones y se demuestra comparando genéticamente diferentes cepas. Para el análisis cuantitativo volúmenes iguales de diferentes fracciones de un gradiente de densidad de sacarosa se mezclan y se analizaron por espectrometría de masas.

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

a-new-approach-for-comparative-analysis-multiprotein-complexes-based

Research

JoVE Journal

Biology

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

12.1K vistas.  University of Münster.  El enfoque descrito comparativa, cuantitativa proteómica tiene por objeto la obtención de conocimientos sobre la composición de los complejos multiproteicos bajo diferentes condiciones y se demuestra comparando genéticamente diferentes cepas. Para el análisis cuantitativo volúmenes iguales de diferentes fracciones de un gradiente de densidad de sacarosa se mezclan y se analizaron por espectrometría de masas. 

Video: A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Investigación

Biología

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados ​​celulares

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein interactions, protein conformational changes, protein dynamics and protein-ligand interactions. H/D exchange on the backbone amide positions has been utilized to measure the deuteration rates of the micro-regions in a protein by mass spectrometry1,2,3. The resolution of this method depends on pepsin digestion of the deuterated protein of interest into peptides that normally range from 3-20 residues. Although the resolution of H/D exchange measured by mass spectrometry is lower than the single residue resolution measured by the Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) method of NMR, the mass spectrometry measurement in H/D exchange is not restricted by the size of the protein4. H/D exchange is carried out in an aqueous solution which maintains protein conformation. We provide a method that utilizes the MALDI-TOF for detection2, instead of a HPLC/ESI (electrospray ionization)-MS system5,6. The MALDI-TOF provides accurate mass intensity data for the peptides of the digested protein, in this case protein kinase Pak2 (also called &gamma;-Pak). Proteolysis of Pak 2 is carried out in an offline pepsin digestion. This alternative method, when the user does not have access to a HPLC and pepsin column connected to mass spectrometry, or when the pepsin column on HPLC does not result in an optimal digestion map, for example, the heavily disulfide-bonded secreted Phospholipase A2 (sPLA2). Utilizing this method, we successfully monitored changes in the deuteration level during activation of Pak2 by caspase 3 cleavage and autophosphorylation7,8,9.

MALDI-TOF mass spectrometry was successfully utilized to monitor the amide hydrogen/deuterium exchange in protein kinase Pak2 activation.

Amida de hidrógeno / deuterio intercambio y MALDI-TOF análisis de espectrometría de masas de Pak2 activación

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensión celular

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Una nueva técnica de análisis cuantitativos de la pérdida del pelo en ratones Uso del análisis de escala de grises

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Cuantificación de proteína específica lisina acetilación y Succinylation estequiometría usando Spectrometry total de la adquisición de datos-independiente

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados en