El objetivo central para el desarrollo de la técnica csBN-MS era obtener acceso integral a la organización y montaje de complejos proteicos que subyacen a la transducción de señales en y a través de la membrana plasmática de varios tipos de tejido y órganos. csBN-MS actualmente proporciona la mayor versatilidad de resolución para el análisis del complejo proteico nativo y su composición de subunidades, en particular con respecto a las proteínas de membrana. Aunque la técnica csBN-MS fue desarrollada para analizar mezclas complejas de conjuntos de proteínas de membrana en el cerebro de roedores, se puede adaptar fácilmente al análisis de cualquier tipo de muestra biológica.
Uno de los pasos clave de nuestro método es la incrustación de la pieza de gel y su correcta alineación con el plano de corte antes de cortar. Tenga cuidado de no rasgar o comprimir el gel y asegúrese de que no está inclinado al plano de corte ya que esto reduciría la resolución del análisis. Nuestra técnica csBN-MS tiene varios pasos prácticos que son cruciales para obtener buenos resultados.
Es más fácil mostrar cómo realizar esos pasos en detalle que simplemente describiéndolos. Para comenzar este procedimiento utilice un mezclador de gradiente de dos cámaras de agitación accionado por una bomba para lanzar un gel de gradiente de poro lineal o hiperbólico. Prepare soluciones para la cámara de mezcla frontal y la cámara del depósito como se describe en el protocolo de texto.
Encienda el agitador y agregue 30 microlitros de APS y 2.5 microlitros de TEMED a la solución en la cámara frontal. A continuación, encienda la bomba y abra la válvula frontal. Después de aproximadamente un minuto, agregue 90 microlitros de APS y cinco microlitros de TEMED a la cámara del depósito y abra la conexión de la cámara.
Deje que el gel se polimerice lentamente y a fondo durante al menos 24 horas a temperatura ambiente para generar un gradiente de tamaño de poro homogéneo. Si se mantiene húmedo, el gel polimerizado se puede almacenar en posición vertical a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana. A continuación, prepare las ranuras de carga insertando los espacios adecuados entre las placas de vidrio para separar entre 0,5 y 2,0 miligramos de proteína.
Las ranuras deben tener al menos tres centímetros de ancho. Para los búferes de carrera, prepare un tampón de cátodo de pie que consista en tricines milimolar, 50 Bis-Tris mililares y 0.01%Coomassie G-250. Prepare un búfer de ánodo estándar que consista en 50 Bis-Tris mililosos.
Solubilizar aproximadamente 2,5 miligramos de membrana y dos mililitros de tampón de solubilización que contiene un 1% de detergente no desnaturalizante sobre hielo durante 30 minutos. A continuación, ultracentrífuga a 130,000 veces G durante 11 minutos. Concentrar el solubilato en un gradiente corto de 50%20% de sacarosa por ultracentrifugación a 400.000 veces G durante una hora.
Después de esto, cosecha el gradiente de sacarosa de la parte inferior del tubo, añadir 0.05%Coomassie G-250 al solubilato, y cargar la muestra en el gel. Ejecute un BN-PAGE preparativo a 10 grados Centígrados durante la noche utilizando un protocolo de voltaje de tres pasos, como se describe en el protocolo de texto. Después de que el gel ha ejecutado escanear los geles para fines de documentación mientras se mantiene entre las placas de vidrio.
Inspeccione la calidad de la separación del gel. A continuación, desmontar las placas e extirpar los tramos de carril de interés. Fije los carriles dos veces con 30% de etanol y 15%ácido acético durante al menos 30 minutos.
Transfiera la muestra del medio de incrustación y permita que se empape y equilibre durante al menos dos horas mientras mantiene la losa de gel en cámara lenta en un agitador orbital. A continuación, corte los carriles de gel fijos en secciones exactamente paralelas al frente de migración de proteínas, o patrón de banda. Coloque cada sección sobre un soporte de película de plástico con las mismas dimensiones para facilitar su manipulación.
Transfiera los carriles a un tubo abierto con tapones que están cerrados en la parte inferior y perforados centralmente en la parte superior, ambos alineados con precisión con los extremos superior e inferior de la sección de gel. Sumerja el cilindro en el nitrógeno líquido brevemente para iniciar rápidamente la solidificación. El medio de incrustación transparente se solidifica en cuestión de segundos y se convierte en blanco en color.
Llene la cavidad con medio de incrustación, sumerja brevemente el cilindro en nitrógeno líquido y luego deje que se congele a fondo a menos 20 grados centígrados durante varias horas. Después del desmontaje, retire la película de plástico y transfiera el bloque con la sección de gel incrustado a un cilindro de metal enfriado. El cilindro es más grande en diámetro y sellado en el exterior con medio de incrustación.
Se coloca sobre un soporte plano. Llene el cilindro con el medio de incrustación y congele bien como se mencionó anteriormente. Repita este procedimiento con el otro lado del cilindro para obtener un bloque sólido con una superficie inferior coplanar.
A continuación, retire el bloque del cilindro y utilice el medio de incrustación para pegarlo en un soporte de metal preenfriado. Inserte el soporte metálico en la máquina criosalte. El soporte debe estar cuidadosamente alineado con respecto al plano de corte.
Permita que el bloque se equilibre a la temperatura óptima para el proceso de corte. Después de esta cosecha el gel se corta una tras otra con un espesor final deseado de 0,25 milímetros de tamaño de paso y transferirlos individualmente a tubos de reacción con propiedades de unión a proteínas bajas. A continuación, las rebanadas se someten a un resumen tríptico y a un análisis espectrométrico de masas.
Este protocolo amplía la aplicación del perfil de complexoma de alta resolución a membranas no mitocondriales que expresan proteínas de baja abundancia. La separación compleja muestra bandas de proteínas fuertemente manchadas con muy pocos artefactos migratorios. Las desviaciones de las señales de péptido en masa y tiempo de retención indican una tasa muy baja para la asignación de volumen máximo falso positivo.
Las variaciones de ejecución a ejecución se eliminan fácilmente mediante el reescalado de los conjuntos de datos de volumen máximo. La información resultante sobre la intensidad del péptido se utiliza para reconstruir 2545 perfiles proteicos de abundancia relativa. La relevancia del tamaño de la etapa de muestreo de gel para la resolución de complejos proteicos se evaluó uniendo conjuntos de datos de rodajas adyacentes.
Con 0,25 milímetros, la separación de tamaño de las poblaciones complejas asociadas al TPC1 está muy de acuerdo con los resultados del análisis de manchas occidentales. La unión de más de dos sectores abolió la discriminación de subpoblaciones complejas de TPC1. Por último, el análisis proporciona información sobre complejos bien caracterizados y demuestra la existencia de nuevas subunidades y ensamblajes complejos.
Para la ferritina, los perfiles de subunidades ajustados por su abundancia relativa sugieren la existencia de al menos tres isoformas complejas con estequiometrías distintas de cadena pesada/ligera. Por el contrario, los complejos nicalin-nomo1, el complejo central gamma-secretasa y la maquinaria GPI-transamidase muestran proporciones de abundancia fija de sus subunidades principales en todo el rango de tamaño e independientes de la asociación con proteínas adicionales. El parámetro clave del análisis csBN-MS es la resolución efectiva de los complejos, que se determina mediante bioquímica de muestras, calidad de gel BN, alineación adecuada durante la incrustación y corte, y la calidad de los datos de MS adquiridos.
La combinación de csBN-MS con el etiquetado de isótopos de proteínas y muestras permitirá la comparación directa de complejos en diferentes estados fisiopatológicos, biológicos o de desarrollo. csBN-MS realizado en membranas del cerebro de roedores reveló la enorme diversidad de receptores, canales iónicos y transportadores con respecto a su subunidad y su función, y será instrumental para analizar la estructura 3D en preparaciones nativas.
