Los autores agradecen a los miembros del grupo a Sharon por su revisión crítica, y por sus contribuciones al manuscrito. Estamos muy agradecidos por el apoyo de los Programas de Morasha y bikura, la Israel Science Foundation (Grant N º 1823 / 07 y 378/08), el Josef Cohn Minerva Centro de Investigación biomembrana, la Familia Chais Programa de Becas para los nuevos científicos, el Abraham y Sonia Rochlin Fundación, el Fideicomiso de la Familia Wolfson caridad; el Centro Helen y Milton A. Kimmelman de Estructura Biomolecular y de la Asamblea, la finca de Shlomo y Beirzwinsky Sabine; Meil ​​de Botton Aynsley, y Karen Siem, Reino Unido. Damos las gracias a Dan Tawfik y Yadid Itamar por darnos la muestra de la variante de lectina.

Parte 1: Preparación de oro recubierto de tubos capilares para la ionización electrospray nanoflujo El análisis de los complejos no covalentes se realiza generalmente por medio de la ionización por electrospray nanoflujo (NESI) 6, el uso de vidrio o cuarzo capilares que se han tirado a una punta fina (diámetro de aproximadamente 1 m interior), y recubiertas con material conductor (generalmente oro) . Tales capilares están disponibles listos para el uso de fuentes comerciales (nuevo objetivo o Proxeon), sin embargo, puede ser más rentable para prepararlos en casa: <ol><li> Palo de dos tiras de una almohadilla adhesiva de doble cara en la parte inferior de una placa de Petri, 2 cm. Coloque una varilla de vidrio (8 cm x 5 mm) en el centro de una de las almohadillas. La almohadilla adhesiva celebrará los capilares en el lugar, y la varilla de vidrio apoyará el preparado capilares, y mantener las puntas de la rotura (Fig. 1). </li><li> El uso de vidrio de borosilicato capilares, 1,0 mm x 0,78 mm de diámetro OD (utilizamos envases de 500 unidades de pared delgada capilares de borosilicato de Warner Instruments, cat.. G100TF-4). Inserte un capilar en el extractor de la aguja (utilizamos el modelo P-97 de la Compañía de Sutter Instrument). Sujete el capilar suavemente en su lugar, y ajustar su posición en la que se encuentra en el centro del filamento de calentamiento de la aguja del extractor. Apriete las abrazaderas con cuidado, hasta que el capilar se mantuvo firme en ambos extremos. </li><li> Tire de la capilaridad, mediante un programa predefinido. Cada capilar sacó dará lugar a dos final, en forma de capilares. El proceso de la programación del extractor es uno de ensayo y error, hasta que una forma de la punta aceptable se obtiene. Nosotros usamos el siguiente programa: <table border="1"><tbody><tr><td> Paso </td><td> Calor </td><td> Jale </td><td> Vell </td><td> Tiempo </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Retire la tira capilares del instrumento e inspeccione las puntas, descartando las que estén deformadas o rotas. Use unas pinzas romas (que utilizar pinzas de posicionamiento de precisión CK), para colocar los vasos capilares en la placa de Petri. La base del capilar debe atribuirse a la almohadilla adhesiva y la parte superior debe apoyarse en la varilla de vidrio, con la punta hacia arriba. </li><li> Una vez que la placa de Petri está lleno (alrededor de 80 en forma capilar en un 10 cm de diámetro del plato), insertar la placa en el oro lacado por pulverización catódica (utilizamos el modelo no. EMS550, de EMS). Asegúrese de que el suministro de gas se elige de acuerdo a las instrucciones del fabricante, y activar un ciclo de recubrimiento predefinida (que utilizan la presión de argón 4 psi, a una presión de vacío de 5 x 10 -2 mbar, una corriente de 45 mA y un tiempo de recubrimiento de 1 min, por 3-6 ciclos, hasta los capilares son uniformemente de oro). </li></ol> Parte 2: Preparación de la muestra <ol><li> Bajas concentraciones micromolar de la muestra se requiere (1 - 20 M). Si es necesario, concentrar la muestra el uso de dispositivos de ultrafiltración centrífuga (por ejemplo, Vivaspin de Sartorius, o NanoSep de Pall Corporation). Se recomienda que verifique la adsorción del complejo de proteínas de la membrana dispositivo, antes de su uso. </li><li> A menudo, los topes de depuración o las soluciones de almacenamiento del complejo de proteínas no son compatibles con Nesi, para que sólo las soluciones volátiles pueden ser utilizados. Por lo tanto, el buffer de cambio es necesario. Este paso crítico en el que todos los restos de sales, las moléculas de separación o cualquier otro no volátil aductos tales como glicerol, TDT, o EDTA se retiran, determina la calidad de los espectros. Por lo general, una solución acuosa de acetato de amonio se utiliza, a una concentración de entre 5 mm y M-1, y en 6.8 pH. Buffer de cambio se puede realizar utilizando un gel de microcentrífuga columna de filtración (por ejemplo, Micro Bio-Spin seis columnas de cromatografía de Bio-Rad). Este paso puede repetirse 1-3 veces con una dilución mínima (menos de un factor de 1,3 por dispositivo 5), hasta el cambio máximo se alcanza. Si la concentración y el intercambio de buffer es necesario, estas se pueden hacer en conjunto, mediante ultrafiltración centrífuga (e, g., Vivaspin de Sartorius, o NanoSep de Pall Corporation). </li></ol> Parte 3: Calibración del espectrómetro de masas para la medición de masas de alta La mayoría de los experimentos llevados a cabo en los complejos multi-proteína se realizó con un electrospray nano cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF) de instrumentos. Se sugiere que utilice un filtro de masas cuadrupolar ajustarse a las bajas frecuencias, para permitir el análisis y la transmisión de masas de iones de alta m / z valores de 7,8. EsTambién recomendó que las entradas de gas 7,8 o 9 mangas que añadir en el instrumento de la guía de iones de primera, a fin de controlar la presión en la etapa de primera aspiradora. Este último permite la optimización de la transmisión, y desolvatación de iones de gran tamaño 7-9. En la actualidad, comercial ESI-TOF y los instrumentos Q-TOF están disponibles de varios fabricantes (por ejemplo, las aguas, Sciex, Bruker, o Agilent) que pueden ser modificados con relativa facilidad y de forma rentable, para aplicaciones nativas de MS 7,8. Es posible, sin embargo, utilizar configuraciones estándar o TOF QTof en instrumentos tales como la LCT o QToF1 (Waters) para adquirir espectros de masas de los complejos de hasta 1 MDa, sin necesidad de modificaciones de hardware 5. El protocolo se describe a continuación se llevó a cabo en un instrumento SYNAPT (Waters). <ol><li> La preparación de 100 mg / ml de solución de CSI en agua purificada. CSI es utilizada para la calibración de masas de alta en las agrupaciones de sal con una sola carga, (CSI) n Cs + se extienden sobre una amplia variedad de masas, de 393 m / z a más de 10.000 (Fig. 2). </li><li> Con unas pinzas romas, tomar un recubrimiento capilar de la placa de Petri y 2μL carga de la solución de CsI en el capilar, utilizando una punta GeLoader Eppendorf. </li><li> Inserte el capilar en el soporte capilar, y ajustar el tubo capilar, de tal forma que la punta es de aproximadamente 10 mm de distancia del borde del soporte. </li><li> Deslice la solución hacia la punta del capilar, ya sea manualmente o utilizando un adaptador de girar. </li><li> Colocar los capilares bajo un microscopio óptico y el ajuste de la punta, con el fuerte tipo AA pinzas. </li><li> Conecte el soporte capilar para la interfaz ES nanoflujo. Gire la etapa xyz hacia atrás para evitar daños en los capilares, e impulsar la etapa en su posición activa. El capilar se debe colocar 1 - 10 mm desde el orificio del cono. </li><li> Aplicar la tensión capilar (1050-1400 V) y la presión nanoflujo baja (0.00-0.03 bar) hasta el spray se inicia, a continuación, tratar de reducir la presión nanoflujo a un valor mínimo. </li><li> Optimizar la intensidad de la señal mediante el ajuste de la ubicación de la etapa de xyz, la tensión capilar, la presión nanoflujo, y el flujo de gas desolvatación. </li><li> Para detectar una amplia variedad de masas de CSI pico serie, las tensiones de la aceleración debe ser optimizado (se utilizan los siguientes parámetros: capilar 1.3-1.7 kV, el cono de la muestra de 80 150 V, la extracción de cono de 1.3 V). </li><li> Para optimizar la transmisión de los iones de alta masa, que requieren condiciones suaves desolvatación, la presión de apoyo en la fase de vacío inicial, entre la fuente y el analizador, debe ser levantado. Esto se puede lograr mediante una cuidadosa reducción de la conductancia de la línea de vacío de origen a la bomba de desplazamiento, cerrando parcialmente la válvula de aislamiento (SpeediValve). Con el fin de definir el punto óptimo, el último debe hacerse mientras se observa el efecto sobre la intensidad de la señal (por lo general el uso 3,0-6,5 mbar). </li><li> Recoger alrededor de 30 exploraciones a un exploraciones / segundo, en un rango de m / z de entre 1.000 y 15.000 m / z. </li><li> Después de la adquisición, calibrar el TOF utilizando la tabla de calibración adecuada. </li></ol> Parte 4: MS de complejos de proteínas intactas <ol><li> Cargue la muestra, tal como se describe (Parte 3, Secciones 2-5), e iniciar la aspersión. </li><li> Para empezar, la optimización inicial de la espuma (la parte 3, secciones 6-9), hasta que se recibe la señal. La posición exacta de los estados de carga es dependiente de la proteína, sin embargo, se pueden predecir, utilizando la relación entre la masa de iones y el estado de carga media, por lo tanto: (Z av) 10: Z = 0,0778 av √ (m), en la que m es la masa del complejo en Daltons. Para evitar la disociación complejo, no se calientan la fuente de iones: o bien cambiar el calentador, o mantener la temperatura por debajo de 40 ° C. </li><li> Variar la posición capilar, el cono de la muestra y de las tensiones extractor para maximizar la transmisión de iones, y comprobar los cambios que provoca en el espectro. Un posible punto de partida podría ser el cono de tensión de 100 V, extractor de cono: 1 V, la tensión capilar 1,5 kV. Optimizar estos parámetros, en combinación con la presión nanoflujo. </li><li> Para mejorar la desolvatación y tira el agua residual y los componentes del tampón, aumentar la tensión de polarización y la presión del gas en la celda de colisión. Este paso debe ser realizado cuidadosamente, para evitar la disociación del complejo. Voltajes típicos prejuicios están dentro del rango de 10 a 100 V, con un flujo de gas trampa de 10-10 ml / min (Fig. 3). El ajuste manual de la configuración de RF y el perfil de cuadrupolo pueden mejorar la transmisión de iones de alta masa. </li><li> Ajuste la trampa y las energías de transferencia de colisión. A menudo, los voltajes más altos son necesarios para la emisión de iones de alta masa (por lo general dentro del rango de 10-30 V). En este punto, es importante para evitar la colisión inducida por la disociación del complejo. </li><li> Después de una señal estable es reached, se recomienda que la presión y la tensión capilar nanoflujo disminuir a valores mínimos, mientras se mantiene estable spray. </li></ol> Parte 5: espectrometría de masas en tándem: disociar los complejos de proteínas <ol><li> Una vez que una señal óptima y estable que se haya obtenido, seleccione un ión precursor. Establecer el centro de masa y la anchura de aislamiento (por lo general, utilice una resolución de LM, de 12, y una resolución de SM de entre 13 y 15). Use un amplio rango de masas para detectar la masa de alta / baja productos de la disociación de carga. Se recomienda que se establece el rango de m / z en el nivel máximo, y luego reducirlo a los valores deseados. Además, sugerimos la superposición de las MS y MS / MS espectros, para validar el aislamiento del ión precursor seleccionado. </li><li> Para llevar a cabo MS / MS, disociar el ión precursor mediante el aumento de la energía de colisión (CE) y la presión en la celda de colisión. Aumentar o trampa o transferencia CE gradualmente, en pasos de 10-20V, y elevar la presión del gas de colisión a 0-5 ml / min (valores comunes). Seguimiento de los cambios en el espectro hasta que las condiciones de activación óptimo se alcanza. Alta energía de activación puede provocar la disociación de una o más subunidades del complejo intacto, y aclarar las afinidades interacción de diferentes subunidades. Por lo general el uso de argón como gas de colisión en la trampa de las células / transferencia, aunque los beneficios de la utilización de un gas más pesado (por ejemplo, Xe o SF 6) se han reportado, sin embargo, estos gases son sustancialmente más caros 11 (Fig. 3). </li><li> Se recomienda que más de un estado de carga de ser seleccionados para análisis MS / MS. En el caso de componentes que se superponen, la adquisición de un conjunto de tándem MS espectros ayudará a resolver la serie cargo de las diferentes poblaciones. Por otra parte, los estados superiores de carga se disocian con más facilidad, en comparación con estados de carga inferior 12. </li><li> Además de la caracterización del complejo intacto, se sugiere que los pequeños subcomplejos en la solución se genera, en condiciones suaves de desnaturalización. La MS y MS / MS de subcomplejos forman la base para la definición de la arquitectura de la subunidad del complejo 13. Por la interrupción parcial de las interacciones subunidad subunidad, añadir poco a poco solventes orgánicos (por ejemplo, metanol, isopropanol o acetonitrilo) a una concentración de 50%, o cambiar el pH de la solución mediante la adición de amoniaco o ácido fórmico (hasta una concentración de 4 %). </li><li> Para determinar las masas de las subunidades que componen el complejo, es importante para adquirir un espectro bajo condiciones de desnaturalización. Esto puede llevarse a cabo con Zip-Tip C 4 (Millipore) con 25:75 agua / acetonitrilo relación, con 1% de ácido fórmico como solvente de elución. </li></ol> Parte 6: procesamiento y análisis de datos <ol><li> Los datos se analizan en línea, utilizando un análisis espectral de los programas de MS espectros. Generalmente utilizamos el programa MassLynx (Waters). </li><li> Para espectros que abarcan una amplia gama de m / z gama, se recomienda que los planes de diferentes parámetros de suavizado y centro de gravedad se aplicará para la alta y baja m / z regiones, para reflejar la diferencia en la resolución máxima de estas regiones. </li><li> Para identificar las series de carga y cálculo de estados de carga y de las masas, el &quot;manual de encontrar&quot; la función de MassLynx se puede aplicar. En los casos de espectros de masas complejas con componentes que se superponen, el cálculo manual de las masas puede ser más fácil. </li><li> Para facilitar estos procesos de asignación, software adicional se puede utilizar, por ejemplo: MaxEnt para deconvolución espectros 14 SOMMS para el montaje de pico y simulación de 15, y la Cumbre para la asignación de la composición y estequiometría de subcomplejos proteína y la generación de redes de interacción de proteínas 13,16,17 . </li></ol> Parte 7: Resultados de Representante <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Preparación recubierto de oro nano-electrospray capilares. A. Coloque dos de doble cara cinta adhesiva a una placa de Petri, 2 cm. Para apoyar el preparado capilares, coloque una varilla de vidrio (8 cm x 5 mm) en el centro de una de las almohadillas. B. Pegue el extremo romo del preparado capilares de la almohadilla adhesiva, y apoyarse en la punta de la varilla de vidrio. C. Una vez que la placa de Petri se llena con los preparados capilares, escudo de oro hasta que una fina capa de oro es depositado uniformemente sobre la superficie externa de los capilares. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Calibración de masas de alta con yoduro de iones de cesio. Los grandes grupos y monisotopic de CSI han convertido en el compuesto de elección para la calibración de los espectrómetros de masas para el análisis de masas de alta. La serie de picos equidistantes se extienden sobre una amplia gama, desde m / z 393 a más de 10.000. Son assigNED a grupos con una sola carga de sal de la composición general (CsI) n + Cs. Señales adicionales entre los picos más importantes son causadas por especies de doble y triple carga de la serie, [(CsI) n Cs2] 2 + y [(CsI) n Cs3] 3 +, respectivamente. El aumento de la presión en la fase de vacío inicial es esencial para detectar los grupos de masas de alta. El efecto de la presión en los picos de alta masa se ​​demuestra en los paneles A. y B. con las colaciones de presión de 1,2 y 5,3, respectivamente. C. La expansión del espectro de masas se muestra a la B. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Nanoflujo electrospray espectros de masas de una lectina pentamérica. A. La espectrometría de masas de un complejo de la variante de lectina (derivado de Lib1-B7 por la evolución dirigida 18) da lugar a una distribución de estado de carga entre 3.000 y 5.000 m / z, sin embargo, debido a la desolvatación inadecuada de los iones, los picos son amplias. Comparativa de panel A. y B. muestran el efecto de aumentar la tensión de polarización de 4V (A). A 15 V (B). Sobre la anchura del pico. Este aumento en las condiciones de acelerar las causas de la extracción de agua residual y los componentes de amortiguación, proporcionando un espectro muy resuelto. La masa medida (60240 ± 38 Da) corresponde a un complejo pentamérica. C. El estado de carga de 15 fue seleccionado para el análisis de MS en tándem (sombreados en gris en el panel B). D. El aumento de la energía de colisión provoca la liberación de un monómero muy cargada, centrada en 1.664 m / z, y una compleja rectificada tetramérica, en el rango de 5.000 - 8.000 m / z. Todos los espectros fueron obtenidos de una muestra que contiene 20 mM de solución de acetato de amonio 0,5 M.

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	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Benesch, J. L., Ruotolo, B. T., Simmons, D. A., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complexes+in+the+gas+phase:+technology+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics.</a> Chem Rev. 107 (8), 3544-3567 (2007).</li><li>Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+mass+spectrometry:+a+bridge+between+interactomics+and+structural+biology.">Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology.</a> Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).</li><li>Sharon, M., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mass+spectrometry+in+structure+elucidation+of+dynamic+protein+complexes.">The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).</li><li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry.">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).</li><li>Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+properties+of+the+nanoelectrospray+ion+source.">Analytical properties of the nanoelectrospray ion source.</a> Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).</li><li>Sobott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tandem+mass+spectrometer+for+improved+transmission+and+analysis+of+large+macromolecular+assemblies.">A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies.</a> Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).</li><li>van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+a+quadrupole+time-of-flight+instrument+for+macromolecular+mass+spectrometry.">Improving the performance of a quadrupole time-of-flight instrument for macromolecular mass spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (21), 7473-7483 (2006).</li><li>Chernushevich, I. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collisional+cooling+of+large+ions+in+electrospray+mass+spectrometry.">Collisional cooling of large ions in electrospray mass spectrometry.</a> Anal Chem. 76 (6), 1754-1760 (2004).</li><li>Mora, d. e. l. a., J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+ionization+of+large+multiply+charged+species+proceeds+via+Dole+s+charged+residue+model.">Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole s charged residue model.</a> Anal Chim Acta. 406, 93-104 (2000).</li><li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+macromolecular+tandem+mass+spectrometry+of+large+non-covalent+complexes+using+heavy+collision+gases.">Optimizing macromolecular tandem mass spectrometry of large non-covalent complexes using heavy collision gases.</a> Int J Mass Spectrom. 268, 198-206 (2007).</li><li>Benesch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometer+modified+for+higher-energy+dissociation+reduces+protein+assemblies+to+peptide+fragments.">Quadrupole-time-of-flight mass spectrometer modified for higher-energy dissociation reduces protein assemblies to peptide fragments.</a> Anal Chem. 81 (3), 1270-1274 (2009).</li><li>Taverner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+intact+protein+complexes+from+mass+spectrometry+and+homology+modeling.">Subunit architecture of intact protein complexes from mass spectrometry and homology modeling.</a> Acc Chem Res. 41 (5), 617-627 (2008).</li><li>Ferrige, A. G., Seddon, M. J., Skilling, J., Ordsmith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+MaxEnt+to+high+resolution+mass+spectrometry.">The application of MaxEnt to high resolution mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. 6, 765-770 (1992).</li><li>van Breukelen, B., Barendregt, A., Heck, A. J., van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+stoichiometries+and+oligomeric+states+of+glutamate+synthase+protein+complexes+with+curve+fitting+and+simulation+of+electrospray+mass+spectra.">Resolving stoichiometries and oligomeric states of glutamate synthase protein complexes with curve fitting and simulation of electrospray mass spectra.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 20 (16), 2490-2496 (2006).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+modularity+of+the+COP9+signalosome+complex+suggests+its+multifunctionality.">Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality.</a> Structure. 17 (1), 31-40 (2009).</li><li>Hernandez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+architecture+of+multimeric+complexes+isolated+directly+from+cells.">Subunit architecture of multimeric complexes isolated directly from cells.</a> EMBO Rep. 7 (6), 605-610 (2006).</li><li>Yadid, I., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+functional+beta-propeller+lectins+via+homo-oligomeric+assembly+of+shorter+fragments.">Reconstruction of functional beta-propeller lectins via homo-oligomeric assembly of shorter fragments.</a> J Mol Biol. 365 (1), 10-17 (2007).</li><li>Videler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+intact+ribosomes.">Mass spectrometry of intact ribosomes.</a> FEBS Lett. 579 (4), 943-947 (2005).</li><li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mass+spectrometry+of+viral+assemblies:+molecular+composition+and+stability+of+dimorphic+hepatitis+B+virus+capsids.">High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).</li><li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+shape+of+hepatitis+B+virus+capsids+in+vacuo.">Stability and shape of hepatitis B virus capsids in vacuo.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6247-6251 (2008).</li><li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry.">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=20S+proteasomes+have+the+potential+to+keep+substrates+in+store+for+continual+degradation.">20S proteasomes have the potential to keep substrates in store for continual degradation.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9569-9575 (2006).</li><li>van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates.">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li><li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring.">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li><li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes.">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li><li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid:+insights+from+MS+of+intact+complexes.">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li><li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3.">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li></ol>

Para adquirir la atención de alta calidad de los espectros se debe dar a los pasos de preparación de muestras, que incluyen la concentración de la muestra y el intercambio de buffer. Más muestras diluidas dará una señal de baja, mientras que las muestras de alta concentración puede ser algo viscoso, y bloquear la aguja electrospray. Por otra parte, los aditivos solución tales como sales, glicerina, detergentes, iones metálicos, y agentes reductores (DTT o β-mercaptoetanol), tienden a adherirse a la superficie exterior de las proteínas, y causar ensanchamiento de los picos. Por lo tanto, con el fin de alcanzar picos bien resueltos, estos componentes deben ser añadidos a las concentraciones más bajas posible. Otro parámetro importante es la posición de la nanoflujo capilar, en relación con el orificio del espectrómetro de masas. Encontrar el &quot;sweet spot&quot; puede ser un reto para los usuarios sin experiencia, sin embargo, que influye significativamente en la calidad de los espectros. También es importante examinar las nanoflujo capilar antes del inicio de la pulverización. El tamaño de la gota es una función del diámetro de la punta, que debe ser ~ 1μm. Pequeñas gotas de plomo a la ionización más eficiente, y por lo tanto sería ventajoso. También es importante comprobar que no hay burbujas de aire dentro de los capilares que podrían bloquear el flujo, y que el recubrimiento de oro no se extrae del capilar durante la adquisición, si es así, más acabado de la punta. Tenga en cuenta que una cantidad excesiva de la muestra se incrementará la posibilidad de optimizar las condiciones de MS, como la tensión capilar, voltajes de aceleración, presión y energía de la colisión. En general, los procedimientos que se explican en el protocolo se han utilizado para determinar la composición, la estequiometría y la arquitectura de numerosos complejos de proteínas (ver comentarios 2,3,4). El análisis de grandes conjuntos MDa como el ribosoma 19 y muy ordenado cápsides virus 20-22, en la definición de la unión del sustrato a las máquinas moleculares 23-25, o la caracterización de redes de interacción de la subunidad 26,17,16,17,27,28 servir como sólo algunos ejemplos del valor de este enfoque.

Requisitos de la muestra: <table border="1"><tr><td> Muestra </td><td> Requisito </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Volumen </td><td> 2.1 l </td><td> Por capilaridad </td></tr><tr><td> Concentración </td><td> 1-20μM </td><td> Por complejos </td></tr><tr><td> Buffer </td><td> Buffer Aquanos volátiles tales como acetato de amonio a pH = 6-8 </td><td> Por lo general 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Detergente </td><td> Mínimo </td><td> Los racimos de moléculas de detergente produce picos anchos y sin resolver </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Mínimo (hasta un 5%) </td><td> Se adhiere a las proteínas de forma no específica y, en consecuencia, se observan picos anchos </td></tr><tr><td> Disolventes orgánicos </td><td> Hasta un 50% </td><td> Pueden desnaturalizar las proteínas complejos </td></tr><tr><td> Ácidos </td><td> Hasta el 4% </td><td> Complejos de desnaturalizar las proteínas </td></tr><tr><td> Sales </td><td> Mínimo </td><td> Aductos de sal de plomo a los picos de ancho y sin resolver </td></tr><tr><td> TDT </td><td> Mínimo </td><td> M 1.2 puede estar presente </td></tr><tr><td> Agentes quelantes </td><td> Mínimo </td><td> Más de 250 M conducir a la formación de aductos amplia </td></tr></table>

analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry

Las células vivas controlar y regular sus procesos biológicos a través de la acción coordinada de un gran número de proteínas que se ensamblan en una serie de dinámicas, múltiples complejos de proteínas 1. Para obtener una comprensión mecanicista de los procesos celulares diferentes, es crucial para determinar la estructura de los complejos de proteínas, y revela cómo su organización estructural dictados de su función. Muchos aspectos de los complejos multi-proteína, sin embargo, difícil de caracterizar, debido a su heterogeneidad, la estructura asimétrica, y la dinámica. Lo tanto, se requieren nuevos enfoques para el estudio de los niveles superiores de la organización de las proteínas. Una de las herramientas de la biología estructural emergentes para el análisis de complejos macromoleculares es la espectrometría de masas (MS) 2-5. Este método proporciona información sobre la composición de proteínas complejas, estequiometría de subunidades, y la topología estructural. El poder de la MS se deriva de su alta sensibilidad y, en consecuencia, el requisito de la muestra bajo, lo que le permite examinar los complejos de proteínas expresadas en los niveles endógenos. Otra ventaja es la velocidad de análisis, que permite la monitorización de las reacciones en tiempo real. Por otra parte, la técnica puede medir simultáneamente las características de las poblaciones separadas que coexisten en una mezcla. Aquí se describe un protocolo detallado para la aplicación de MS estructurales para el análisis de conjuntos de proteínas de gran tamaño. El procedimiento comienza con la preparación de los capilares recubiertas de oro para la ionización electrospray nanoflujo (NESI). Luego continúa con la preparación de muestras, haciendo hincapié en las condiciones de amortiguamiento que debe ser compatible con NESI por un lado, y permiten mantener intactas complejos en el otro. A continuación, explicar, paso a paso, cómo optimizar las condiciones experimentales para la medición de masas de alta y adquirir MS y MS en tándem espectros. Por último, la tabla de procesamiento de datos y análisis que siguen. En lugar de tratar de caracterizar todos los aspectos de las asambleas de proteínas, este protocolo presenta los procedimientos básicos de MS, lo que permite el rendimiento de MS y MS / MS experimentos en los complejos no covalentes. En general, nuestro objetivo es proporcionar a los investigadores no conocen el campo de la MS estructurales, con el conocimiento de las herramientas experimentales principal.

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Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Espectrometría de masas ha demostrado ser una valiosa herramienta para el análisis de grandes complejos de proteínas. Este método permite a los puntos de vista en la arquitectura de la composición, estequiometría y en general de las asambleas de múltiples subunidades. Aquí se describe, paso a paso, cómo realizar un análisis de espectrometría de masas estructurales, y caracterizar estructuras macromoleculares.

El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

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Research

JoVE Journal

Biology

24.0K vistas.  Weizmann Institute of Science. Espectrometría de masas ha demostrado ser una valiosa herramienta para el análisis de grandes complejos de proteínas. Este método permite a los puntos de vista en la arquitectura de la composición, estequiometría y en general de las asambleas de múltiples subunidades. Aquí se describe, paso a paso, cómo realizar un análisis de espectrometría de masas estructurales, y caracterizar estructuras macromoleculares.

Video: Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Investigación

Biología

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

De la onda T de movilidad de iones-espectrometría de masas: Basic Procedimientos experimentales para el análisis de proteínas complejas

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like experimental conditions. Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is one such development and is particularly well-suited for the investigation of water-containing specimens. LAESI utilizes a mid-infrared laser beam (2.94 &mu;m wavelength) to excite the water molecules of the sample. When the ablation fluence threshold is exceeded, the sample material is expelled in the form of particulate matter and these projectiles travel to tens of millimeters above the sample surface. In LAESI, this ablation plume is intercepted by highly charged droplets to capture a fraction of the ejected sample material and convert its chemical constituents into gas-phase ions. A mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure ion source interface is employed to analyze and record the composition of the released ions originating from the probed area (pixel) of the sample. A systematic interrogation over an array of pixels opens a way for molecular imaging in the microprobe analysis mode. A unique aspect of LAESI mass spectrometric imaging is depth profiling that, in combination with lateral imaging, enables three-dimensional (3D) molecular imaging. With current lateral and depth resolutions of ~100 &mu;m and ~40 &mu;m, respectively, LAESI mass spectrometric imaging helps to explore the molecular structure of biological tissues. Herein, we review the major elements of a LAESI system and provide guidelines for a successful imaging experiment.

Laser ablation electrospray ionization (LAESI) is an atmospheric-pressure ion source for mass spectrometry. In the imaging mode, a mid-infrared laser probes the distributions of molecules across a tissue section or a biofilm. This technique presents a new approach for diverse bioanalytical studies carried out under native experimental conditions.

Presión atmosférica de Imagen Molecular de los tejidos biológicos y biopelículas por LAESI Espectrometría de Masas

Ambient ionization methods in mass spectrometry allow analytical investigations to be performed directly on a tissue or biofilm under native-like ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

El análisis directo de las células individuales mediante espectrometría de masas a presión atmosférica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

Creación de perfiles proteoma redox tiol Uso del etiquetado de espectrometría de masas

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas