Los autores agradecen calurosamente al Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. Weber y A. Jaouen útil para los debates; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, el personal del Bioterio del IBDML y el personal de la plataforma de imágenes PicSIL en IBDML para soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por becas de Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) a GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) para FD, por becas de la Federación de la Recherche Médicale y Cancéropole PACA a CR.

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la legislación francesa y en cumplimiento de la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea del 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE) para el cuidado y uso de animales de laboratorio. La investigación en animales ha sido autorizada por la Dirección Départementale des Servicios Veterinarios des Bouches-du-Rhône (licencia D-13-055-21) y aprobado por el comité ético de Provence Côte d&#39;Azur n ° 14 (Proyecto 87-04122012) . 1. Preparación Esferoides <ol><li> Preparación de los platos de agarosa recubiertas de Petri <ol><li> Mezclar 1 g de agarosa con 100 ml de medio de cultivo celular no suplementado con suero bovino fetal. Utilice un horno de microondas (850 vatios durante 40 segundos, a continuación, 3 x 15 seg, y mezclar la solución entre cada sesión de microondas) a hervir la solución y para disolver completamente la agarosa. Autoclave esta solución de agarosa al 1% durante 20 min a 120 ° C para asegurar Steri. dad Nota: Tenga cuidado para disolver completamente la agarosa antes de que el protocolo de autoclave. Falta de homogeneidad puede comprometer la formación de esferoides. </li><li> Una vez recuperado de la autoclave, se vierten 10 ml de la solución de agarosa al 1% en 100 x 20 mm placas de Petri. Deje la placas Petri 20 min a temperatura ambiente para permitir la solución de agarosa al 1% que se solidifique. </li><li> Añadir 10 ml de PBS por encima de la agarosa para mantener la humedad. Sellar la tapa de los platos de agarosa recubiertas de Petri envolviéndolos con parafilm para evitar la evaporación. Cajas de Petri se pueden almacenar durante un máximo de 2 meses a 4 ° C si humedecido adecuadamente por la capa de PBS. </li></ol></li><li> Cultura esferoide <ol><li> En un frasco, la cultura 75 cm 2 las células de glioma en su medio recomendado como una monocapa. </li><li> Sustituir el PBS de uno de los 1% de agarosa recubiertas de placa de Petri por 1,5 ml de &quot;medio preacondicionado&quot; recogidos desde el matraz que contiene la monocapa celular de glioma de 2Ds. </li><li> Retire el medio del matraz que contenía la monocapa 2D de células de glioma. </li><li> Enjuague suavemente la monocapa con 10 ml de PBS. </li><li> Añadir 2 ml de 0,05% de una solución de tripsina / EDTA y se incuba el matraz de 4 min a 37 ° C. Nota: El tiempo de incubación puede variar de acuerdo con la línea celular utilizada. </li><li> Añadir 8 ml de medio de cultivo para detener la acción de la tripsina, lave suavemente la suspensión celular Nota:. Tenga cuidado de no eliminar el aire en la suspensión de células a medida que aumenta la muerte celular. </li><li> Ponga 6 ml de la suspensión celular en un vial estéril. </li><li> Centrifugar el vial de 4 min a 800 rpm. </li><li> Eliminar el sobrenadante y suavemente de suspender el sedimento celular en 3 ml de medio de cultivo. </li><li> Sembrar la suspensión de células en la placa de Petri de agarosa recubiertas de preparado. </li><li> Poner la placa de Petri a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 durante 2 a 3 días hasta que se forman esferoides de diámetro deseado. </li></ol></li></ol&gt; 2. Esferoide y ventana de implantación <ol><li> Preparación del sistema de inyección <ol><li> Capilares de vidrio limpio (1 mm de diámetro) por sonicación en etanol al 70% durante 10 min. Enjuague dos veces con agua antes de colocar dentro de una incubadora hasta que se seque. </li><li> Tire de varios capilares de vidrio limpios con un extractor de pipeta con el fin de preparar un pequeño stock. </li><li> Romper la punta del capilar tirado por rascado la extremidad en un trozo de papel de seda para obtener un extremo biselado del tamaño deseado: típicamente un diámetro externo de 300-350 micras y un diámetro interno de 250-300 micras. Durante este proceso de conformación, controlar el diámetro del capilar usando un macroscopio cuya ocular está equipado con una mira graduada. </li><li> Conectar el extremo no biselado del capilar a un colector de 3 vías usando un pedazo de tubo de plástico cuyo diámetro interior se ajusta al diámetro exterior del capilar. </li><li> Usando tubin plásticog, conecte las otras dos formas del colector a un 25 l microjeringa y para una jeringa de 1 ml cargado con aceite mineral con capacidad para un histo. </li><li> Ajuste el selector de colector para establecer una vía entre la jeringa de microlitro y la jeringa de 1 ml. Eliminar el pistón de la jeringa de microlitro e inyectar aceite mineral hacia atrás en la jeringa de microlitro hasta que se escapa por empujar el pistón de la jeringa de 1 ml. Vuelva a colocar el émbolo de la jeringa de microlitro, teniendo cuidado de no dejar burbujas de aire en el tubo. </li><li> Ajuste el selector de colector para establecer una vía entre el capilar y la jeringa de 1 ml. Llene el capilar con aceite mineral hasta que se escapan de la punta, teniendo cuidado de no dejar burbujas de aire en el tubo. </li><li> Ajuste el selector de colector para establecer una conexión entre la jeringa de microlitro y el capilar. Expulsar aproximadamente 10 l de aceite mineral. </li><li> Sumerja la punta capilar en solución de PBSy utilizando el medidor de la jeringa de microlitros, aspirar 5μl de PBS en el capilar. Tenga en cuenta que el menisco entre el aceite y PBS es claramente visible. </li><li> Fijar el capilar en un ajuste bajo la macroscopio cirugía micromanipulador 3 ejes. Este sistema se puede usar para dirigir el capilar para el sitio de la inyección bajo control visual. </li></ol></li><li> Implantación del esferoide <ol><li> Ligeramente sedar el ratón por inhalación de isoflurano en una cámara de inducción (1,5% en el aire durante 1 a 1,5 min). </li><li> Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina / xilazina (120 mg / kg, 12 mg / kg). Tenga en cuenta que la anestesia a menudo reduce la temperatura del cuerpo del animal. Se recomienda proceder con la cirugía en una habitación a 26 º C y para mantener al animal caliente con una almohadilla térmica termolaminado subyacente. </li><li> Aplicar pomada para los ojos para evitar la desecación de los ojos. </li><li> Afeitar el cuero cabelludo del animal. </li><li> Lugarel animal en un marco estereotáctico usando barras de oído y una boquilla. </li><li> Limpiar la piel con povidona yodada (3% de jabón, a continuación, solución al 10%). </li><li> Hacer un 1 cm de largo incisión longitudinalmente en el centro del cuero cabelludo con un escalpelo. Con una tijera cortar y quitar la piel encima de los huesos parietales. </li><li> Con una hoja de bisturí eliminar suavemente el periostio encima del cráneo. Aplicar generosamente cianoacrilato en la parte superior del hueso de generar una superficie rugosa para la adhesión posterior de cemento. </li><li> Perforar el hueso parietal bajo un macroscopio quirúrgica para generar una craneotomía de 4 mm de diámetro. Añadir generosamente PBS enfriado con hielo que contiene penicilina (1000 U / ml) y estreptomicina (1 mg / ml) durante todo el procedimiento para evitar el calentamiento. Quite los pequeños fragmentos de hueso con una pinza y una gasa estéril húmeda. Tenga cuidado para perforar al menos 1 mm de distancia de las suturas craneales parietales para evitar hemorragias. </li><li> Thin hueso en el borde de la craneotomía en la que se selló la ventana de cristal. Objetivo es esegurar más tarde de posicionamiento plano de la ventana de vidrio con superficie de contacto máxima entre el cerebro y el vidrio. Retire lentamente el hueso utilizando una pinza y limpie la duramadre expuesta con la solución de PBS. </li><li> Tome un cubreobjetos de cristal redonda de 5 mm de diámetro, límpielo con alcohol y secarla con papel de seda. Trate de usar el cubreobjetos como una tapa para la craneotomía y confirmar que una gran superficie plana del cerebro entra en contacto con el vidrio. Si es necesario quitar el cubre a más delgado que los huesos laterales. Continúe hasta que el cerebro puede quedar apretado plano, si la aplicación de una suave presión sobre el portaobjetos una vez en su lugar. </li><li> Limpie nuevamente el cubreobjetos con alcohol, séquela con un pañuelo de papel y guárdelo aparte. </li><li> Con una aguja de calibre 26 hacer un orificio en la duramadre en el centro de la craneotomía pero evitando principales vasos sanguíneos. Asegúrese de no dañar el parénquima cerebral como el propósito de este paso es sólo para abrir la duramadre. </li><li> Limpie suavemente la wi duramadreth solución PBS para eliminar la sangre hemorrágica. Cubrir con un trozo de papel de seda mientras se prepara la inyección de esferoide. </li><li> Con el sistema de inyección de esferoide preparado en la etapa 2.1, chupar un esferoide ronda de montar el diámetro interno capilar (aproximadamente 200-250 micras) de la placa de Petri preparado en la etapa 1.2. Esferoide debe venir junto con aproximadamente 5 l de medio de cultivo. Se debe caer hacia abajo a la punta de la capilaridad en virtud de su peso. </li><li> Retire el papel de tejido húmedo se utiliza para cubrir la craneotomía y coloque el animal en el sistema de inyección. </li><li> Baje la pipeta de inyección hasta que toque el orificio hecho en la duramadre. Luego, baje de nuevo por 250 micras. Espere 30 seg. </li><li> Inyecte lentamente el esferoide con el émbolo de la jeringa de microlitro (2-3 l) mientras se bombea el exceso de líquido con un trozo de papel de seda. Espere 30 segundos y luego levante suavemente la pipeta de inyección por 50 m hacia la superficie. Espere 30 segundos y de nuevo REPEAt el procedimiento de elevación por pasos de 50 micras hasta la superficie. Tiempos de espera evita la extracción del esferoide que se adhieren a la pipeta. </li><li> Confirmar la presencia de la esferoide en el cerebro utilizando un macroscopio de fluorescencia. </li><li> Mezclar 100 a 300 micras de diámetro perlas de gel de dextrano reticulado con una solución de PBS en una placa de Petri. Espere 1 minuto y pescar algunos granos hidratados. Colóquelos en el hueso adyacente a la craneotomía. </li><li> Bajo el control macroscópico, elegir una bola con un diámetro similar al tamaño de la abertura de duramadre. Cortar el cordón de gel de dextrano reticulado en dos mitades utilizando fórceps. </li><li> Coloque cuidadosamente un dextrano gel hemi-grano entrecruzado en el agujero de la inyección con la cara convexa hacia el esferoide. Tenga cuidado de no eliminar el esferoide y presione suavemente hacia abajo hasta la frontera de la parte cóncava entrar en contacto con la duramadre que rodea. </li><li> Ponga una gota de pegamento de cianoacrilato en un portaobjetos de vidrio; moje la punta de un palillo en el visualizadorp para tomar una pequeña cantidad de pegamento. Sellar rápidamente los bordes del gel de dextrano hemi-Bead reticulado a la duramadre adyacente por estampación pegamento alrededor. Tenga cuidado al realizar movimientos rápidos y precisos para evitar el pegado del dextrano gel hemi-grano entrecruzado con el palillo de dientes. Evite el exceso de pegamento que se puede propagar e impedir, si no prevenir de imágenes una vez seco. Espere 2 minutos para que el pegamento se seque y luego limpiar la craneotomía y el hueso circundante con solución de PBS. </li></ol></li><li> Implantación ventana <ol><li> Ponga el diámetro 5 mm ronda cubreobjetos encima de la craneotomía (véase 2.2.12). Los bordes del cubreobjetos deben estar en el cráneo adelgazada en el exterior de la craneotomía. El cubreobjetos debe estar en contacto con la duramadre y el hueso adelgazado en los bordes. Es muy importante tener un contacto directo entre la duramadre y el cubreobjetos de vidrio de otro modo el tejido cicatrizal puede desarrollar e impiden la claridad óptica. </li><li> Con un pañuelo de papel, absorber el PBS en thbordes e cubreobjetos de modo que la solución no cubre totalmente la craneotomía al aplicar una pequeña presión en el centro del cubreobjetos. Esto asegurará que el hueso, el vidrio y el cerebro se pegan juntos en el lado de la región de interés. </li><li> Mantener una pequeña presión en el centro del cubreobjetos con un fórceps mientras se aplica suavemente cianoacrilato en la frontera entre el hueso y el cubreobjetos. El pegamento se extendió de forma espontánea hasta que la interfaz con solución de PBS. Solución actuará como una barrera debido a la hidrofobicidad de la cola. Sellado debe ser efectiva en menos de un minuto, pero tomar un extremo cuidado de no mover el cubreobjetos hasta que esté arreglado. Esto sería lo contrario provocar fugas de cianoacrilato en la duramadre, por tanto llevar a un fracaso de la cirugía. </li><li> En caso de que el pegamento se habría extendido en la parte superior de la copa, y eliminar el uso de una cuchilla de micro-bisturí haciendo movimientos en espiral, ya que de lo contrario puede reducir la claridad óptica. Tenga cuidado de no romper el cubreobjetos During el procedimiento debido a la presión excesiva. </li><li> Consolidar la fijación de vidrio mediante la aplicación de cemento dental en los bordes del cubreobjetos hacia el cráneo adyacente. Asegúrese de cubrir todo el cráneo expuesto hasta el cuero cabelludo. El uso de cemento extra, construir paredes laterales alrededor del cubreobjetos para crear el grupo necesario para la inmersión del objetivo. El cemento dental se cura en menos de 10 min. </li></ol></li></ol> 3. Cuidados postoperatorios y Preparación de la Imagen <ol><li> El cuidado post-operatorio <ol><li> Retire el ratón del marco estereotáctico, inyecte Dexamethazon (0,2 mg / kg) y Rimadyl (5 mg / kg) sc sobre las regiones pélvicas y su sentar en una jaula con un pañuelo de papel-nido cálido. </li><li> Monitorear el animal hasta que los efectos de la anestesia hayan desaparecido. En general de 2 a 3 horas después de la cirugía, los ratones son totalmente móviles. Asegúrese de que el animal tiene un fácil acceso a los alimentos y el agua. Proporcionar al animal con agarosa que contiene glucosa (agarosa3%, glucosa 3%). </li><li> Monitorear el peso de los animales todos los días y se inyecta Dexamethazon (0,2 mg / kg) y Rimadyl (5 mg / kg) sc por primera 10d después de la cirugía. Por razones éticas, la eutanasia a los ratones cuando la pérdida supera el 15% de su peso original. La presión intracraneal se incrementa con el tamaño del tumor que lleva a deficiencias motoras para el animal. Esta es la línea de células tumorales dependientes y se produce a diversos retrasos después de la cirugía. Especial cuidado se debe tomar para caracterizar el punto final del experimento con la línea celular utilizada. </li></ol></li><li> Preparación para la formación de imágenes <ol><li> Ligeramente sedar el ratón por inhalación de isoflurano en una cámara de inducción (1,5% en aire durante 1 a 1,5 min). </li><li> Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina / xilazina (100 mg / kg, 10 mg / kg). Tal anestesia permite típicamente 45 minutos de observación. Para llevar a cabo sesiones de formación de imágenes más largos, el ratón se coloca debajo de la inhalación continua de isoflurano enaire (0,25-0,75%). </li><li> Aplicar pomada para los ojos para evitar la desecación de los ojos. </li><li> Ponga el animal en un marco estereotáctico y bloquear el cráneo con los earbars. </li><li> Para visualizar los vasos sanguíneos, un colorante fluorescente puede ser inyectado por vía intravenosa. </li><li> Si la ventana se ve sucio, se puede limpiar suavemente quitando los escombros con una hoja delgada y la esquina de un pañuelo de papel. No utilice alcohol para limpiar la ventana, ya que no siempre es compatible con el cemento dental y puede enfriar el cerebro por debajo de la ventana. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>DeAngelis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumors.">Brain tumors.</a> N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).</li><li>Ricard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+brain+tumours+in+adults.">Primary brain tumours in adults.</a> Lancet. 379, 1984-1996 (2012).</li><li>Prados, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+randomized+study+of+radiotherapy+plus+procarbazine,+lomustine,+and+vincristine+with+or+without+BUdR+for+treatment+of+anaplastic+astrocytoma:+final+report+of+RTOG+9404.">Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).</li><li>Piao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+resistance+to+anti-VEGF+therapy+is+associated+with+myeloid+cell+infiltration,+stem+cell+accumulation,+and+a+mesenchymal+phenotype.">Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype.</a> Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).</li><li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophages+promote+glioma+progression.">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59, 472-485 (2011).</li><li>Studwell, A. J., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shift+from+cell+cultures+to+creatures:+in+vivo+imaging+of+small+animals+in+experimental+regenerative+medicine.">A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine.</a> Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy.">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243, 221-226 (2011).</li><li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+effects+of+synchrotron+irradiation+on+vasculature+and+tissue+in+healthy+mouse+brain.">Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain.</a> J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).</li><li>von Baumgarten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bevacizumab+has+differential+and+dose-dependent+effects+on+glioma+blood+vessels+and+tumor+cells.">Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells.</a> Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. , 680 (2008).</li><li>Lathia, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+evidence+for+tumor+propagation+by+glioblastoma+cancer+stem+cells.">Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+imaging:+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy.">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li><li>Winkler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+glioma+cell+invasion+in+vivo+reveals+mechanisms+of+dissemination+and+peritumoral+angiogenesis.">Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis.</a> Glia. 57, 1306-1315 (2009).</li><li>Newcomb, E., Zagzag, D., Van Meir, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.">Ch. 12.</a> CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , 227-241 (2009).</li><li>Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+rigidity+of+the+extracellular+matrix+regulates+the+structure,+motility,+and+proliferation+of+glioma+cells.">The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells.</a> Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Este enfoque permite el uso de métodos de formación de imágenes ópticas para supervisar más de días y semanas el crecimiento de un glioma de ortotópicamente implantado. El mismo animal, posteriormente, puede ser sometido a prácticamente cualquier modalidad de formación de imágenes del cerebro durante el curso de la patología; sin embargo, la preparación específica microscopía de dos fotones ofrece la oportunidad única de conseguir una resolución subcelular dentro del cerebro del animal vivo. Nuestro prot...

El glioblastoma multiforme se presenta como la forma más agresiva de tumor cerebral en adultos con una supervivencia media de 12 meses y una de 5 años la tasa de supervivencia de 5%. El manejo clínico se basa en la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia a menudo se usan en combinación. Sin embargo, los efectos de estos tratamientos siguen siendo paliativa 1-3. Hasta ahora, la mayoría de los estudios de neuro-oncología se basan en técnicas que sólo son capaces de proporcionar una visión estática y realizar en grandes cohortes de animales portadores de tumores se sacrificaron a diferentes puntos de tiempo (véase, por ejemplo, 4,5). El reciente desarrollo de métodos de seguimiento basado en intravital de imágenes permite el estudio del crecimiento glioma y las interacciones entre las células tumorales y su microambiente fisiopatológico en el mismo animal con el tiempo. Esto abre el camino a la exclusiva pieza de información que era hasta ahora inalcanzable 6. Los animales transgénicos que expresan etiquetas fluorescentes en las células de interés puede ser de usod para estudiar las interacciones específicas entre las células tumorales y por ejemplo, las neuronas en este documento. Durante la última década, intravital microscopía de dos fotones 7 se ha convertido en un estándar de oro en los estudios neuro-oncología fundamentales y ensayos preclínicos 8,9 por su capacidad para llevar a cabo la observación profunda intravital de cerebro de ratón (&gt; 500 m por debajo de la duramadre) con una resolución espacial micrométrica 10. Uso de intravital microscopía de dos fotones con modelos animales orthotopical implantados con una ventana craneal crónica 11, es posible seguir la progresión del tumor con el tiempo en el mismo 9,12 ratón. Uno de los principales inconvenientes de estos modelos animales publicados anteriormente es sin embargo que no imitan las limitaciones físicas que gobiernan el crecimiento del tumor como la duramadre no se sella después de la inyección de la suspensión celular 9,13,14. Células de glioma pueden tener fugas en elespacio extradural transformar un modelo de glioma ortotópico en uno heterotópico. El modelo animal presentado aquí consiste en la inyección de un esferoide de células de glioma fluorescentes en la corteza cerebral a una profundidad de 200 micras seguido por el sellado de la duramadre con un gel de dextrano hemi-Bead reticulado y pegamento compatible con histo . El crecimiento del tumor se limita entonces a la parénquima cerebral que mantiene las limitaciones físicas fisiopatológicos. Una ventana de cristal crónica implantados por encima del tumor permite un acceso óptico fácil para intravital microscopía de dos fotones. El uso de animales transgénicos que expresan etiquetas fluorescentes en las células de interés que es posible realizar un seguimiento de el crecimiento del glioma en el tiempo y para estudiar su interacción con su microambiente (aquí con las neuronas y la vasculatura resaltados con dextranos fluorescentes).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1337">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:425px;">Drill</td>
			<td style="width:383px;">Dremel (Germany)</td>
			<td style="width:156px;">398</td>
			<td style="width:375px;">any high quality surgical bone drill would suffice</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:425px;">Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>501860 (#1/4)</td>
			<td>also sold by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Tissue scissors</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>14395</td>
			<td style="width:375px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Dumont tweezers M5S</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Dental cement</td>
			<td>GACD (USA)</td>
			<td>12-565 &#38; 12-568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Cyanoacrylate</td>
			<td>Eleco-EFD (France)</td>
			<td>Cyanolit 201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Glass capillaries without filament</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments (UK)</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Microliter syringe (25 &#181;l)</td>
			<td>Hamilton (USA)</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>Kite-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">T derivation (3-way stopcock - Luer lock)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>14035-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Stereotactic frame (mouse adaptor)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Glass coverslips</td>
			<td>Warner Instruments (USA)</td>
			<td>CS-5R (64-0700)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 &#181;m beads</td>
			<td>Available from various suppliers including Sigma (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Eye ointment</td>
			<td>TVM (France)</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Fluorescence macroscope</td>
			<td>Leica MZFLIII (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss LSM 7MP (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies (Nikon, &#8230;)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Infrared tunable femtosecond laser (Ma&#239;-Ta&#239;)</td>
			<td>Spectra Physics (USA)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy

El glioblastoma multiforme (GBM) es el tipo más agresivo de los tumores cerebrales sin tratamientos curativos disponibles hasta la fecha. Los modelos murinos de esta patología se basan en la inyección de una suspensión de células de glioma en el parénquima cerebral después de la incisión de la duramadre. Considerando que las células se tienen que inyectar superficialmente para ser accesible a intravital microscopía de dos fotones, las inyecciones superficiales dejar de recapitular las condiciones fisiopatológicas. De hecho, escapando a través del tracto inyección mayoría de las células tumorales alcanzan el espacio extra-dural donde se expanden con mayor velocidad en ausencia de limitaciones mecánicas de la parénquima. Nuestros mejoras consisten no sólo en focalmente la implantación de un esferoide de glioma en lugar de la inyección de una suspensión de células de glioma en las capas superficiales de la corteza cerebral, pero también en la obstrucción del sitio de la inyección por un gel de dextrano hemi-Bead reticulado que está pegado a la surrounding parénquima y sellado de duramadre con cianoacrilato. En total, estas medidas hacen cumplir la expansión fisiológica y la infiltración de las células tumorales en el interior del parénquima cerebral. Craneotomía se cerró con una ventana de cristal cimentado en el cráneo para permitir imágenes crónica durante semanas en ausencia de desarrollo de tejido cicatricial. Tomando ventaja de los animales transgénicos fluorescentes injertados con células tumorales fluorescentes hemos demostrado que la dinámica de las interacciones que se producen entre las células de glioma, las neuronas (por ejemplo, ratones Thy1-PPC) y la vasculatura (resaltado por una inyección intravenosa de un colorante fluorescente) se pueden visualizar por intravital microscopía de dos fotones durante la progresión de la enfermedad. La posibilidad de una imagen del tumor en la resolución microscópica en un ambiente cerebral mínimamente comprometida representa una mejora de los actuales modelos de animales con GBM que debería beneficiar al campo de la neuro-oncología y la prueba de la droga. </p&gt;

Una vez que el protocolo quirúrgico se lleva a cabo (Figura 1), los animales pueden ser observados por medio de microscopía fluorescente sobre semanas hasta el sacrificio. Una reacción inflamatoria puede ser observada después de la cirugía que desaparece en una o dos semanas. El crecimiento del tumor se puede observar por diversas técnicas de microscopía incluyendo macroscopía fluorescente y microscopía de dos fotones (Figura 2). Imágenes de ejemplo representadas aquí se real...

Watch this Scientific Journal Video about An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy at JoVE.com

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Hemos establecido un modelo ortotópico de glioblastoma cortical en ratones para intravital microscopía de dos fotones que recapitula las limitaciones biofísicas normalmente en juego durante el crecimiento del tumor. Una ventana de cristal crónica reemplazando el cráneo por encima de la del tumor permite el seguimiento de la progresión del tumor con el tiempo por microscopía de dos fotones.

El mantenimiento de un modelo de ratón ortotópico Glioblastoma Restricciones cerebral parenquimatosa físicas y Conveniente para intravital microscopía de dos fotones

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

an-orthotopic-glioblastoma-mouse-model-maintaining-brain-parenchymal

Research

JoVE Journal

Medicine

19.6K vistas.  Aix Marseille University.  Hemos establecido un modelo ortotópico de glioblastoma cortical en ratones para intravital microscopía de dos fotones que recapitula las limitaciones biofísicas normalmente en juego durante el crecimiento del tumor. Una ventana de cristal crónica reemplazando el cráneo por encima de la del tumor permite el seguimiento de la progresión del tumor con el tiempo por microscopía de dos fotones. 

Video: An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga murino

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Investigación

Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Combinación de radioterapia en un modelo ortotópico de tumor cerebral del ratón

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Un modelo de ratón ortotópico de carcinoma de tiroides anaplásico

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Trauma cerebral aguda en ratones seguido de Longitudinal dos fotones de imágenes

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

La bioluminiscencia de imágenes de un Modelo inmunocompetentes Animal para Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

Un modelo de ratón ortotópico de cáncer de mama metástasis espontánea

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

Microscopia intravital y trombos de inducción en el lóbulo de la oreja de un ratón sin pelo

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...