저자는 따뜻하게 박사 KK Fenrich 박사 MC 감사합니다. Amoureux, P. 웨버와 도움이 토론 A. JAOUEN; M. Hocine, C. 무니, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, IBDML의 동물 시설 및 기술 지원 IBDML에서 PicSIL 이미징 플랫폼의 직원의 직원. 이 작품은 GR, 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), 연맹 문화원 국립 뒤 암 (INCA-DGOS-INSERM6038)에서 교부금에 의해 지원 된 연맹에서 장학금으로, FD 라 공들인 쉬르 르 Cerveau (FRC)을 부어 CR에 드 라 공들인 Médicale 및 Cancéropole PACA.

모든 실험 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 프랑스의 법률에 따라 11 월 24 일의 유럽 공동체위원회 지침, 1986 (86/609/EEC)을 준수 하였다. 동물에 대한 연구는 방향 Départementale 데 서비스 Vétérinaires 데 부슈 - 뒤 - 론 (라이센스 D-13-055-21)에 의해 승인 프로방스 코트 다 쥐르 N ° 14 (프로젝트 87-04122012)의 윤리위원회의 승인을 받았다 . 1. 상체 준비 <ol><li> 아가로 오스 코팅 된 배양 접시의 준비 <ol><li> 소 태아 혈청으로 보충되지 세포 배양액 100 ㎖로 아가로 오스 1g을 혼합한다. 전자 레인지 사용 (40 초 850 와트, 다음 3 × 15 초, 각 전자 세션 사이에서 솔루션을 저어) 솔루션을 끓여 완전히 아가 로스를 해소 할 수 있습니다. steri을 확보하기 위해 120 ° C에서 20 분 동안이 1 % 아가로 오스 솔루션을 압력솥. 품 질 참고 : 완전 오토 클레이브 프로토콜 전에 아가로 오스를 해산주의하십시오. 비균질성은 상체의 형성을 손상시킬 수 있습니다. </li><li> 일단 오토 클레이브에서 검색, 100 X 20mm 배양 접시에 1 % 아가로 오스 용액 10 ㎖를 붓는다. 1 % 아가로 오스 용액을 응고시킬 실온에서 페트리 접시에서 20 분을 남긴다. </li><li> 습도를 유지하기 위해, 아가 로스 상기 PBS 10 ㎖를 추가. 증발을 방지하기 위해 파라 필름으로 그들을 포장하여 아가 로스 코팅 된 배양 접시의 뚜껑을 밀봉합니다. 제대로 PBS 층 가습 경우 배양 접시는 4 ° C에서 최대 2 개월 동안 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 회전 타원체 문화 <ol><li> 단일 층으로 권장되는 매체에서 75cm 2 플라스크, 문화에서 신경 교종 세포. </li><li> 신경 교종 세포의 2 차원 단층을 함유하는 플라스크에서 수집 &quot;프리 컨디셔닝 매체」의 1.5 ml의 기준을 1 % 아가 로스 코팅 페트리 접시 중 하나에서 PBS 바꾸기의. </li><li> 신경 교종 세포의 2 차원 단층을 함유하는 플라스크에서 배지를 제거한다. </li><li> 부드럽게 PBS 10 mL로 단일 층을 씻어. </li><li> 트립신 / EDTA 용액의 0.05 %의 2 ML을 추가하고 37 ° C. 주에서 플라스크 4 분 배양 : 배양 시간은 사용 된 세포주에 따라 달라질 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 세포 현탁액을 세척, 트립신의 활동을 중지하는 문화 매체의 8 ML을 추가 참고 :.이 세포 죽음을 증가로 세포 현탁액에 공기를 세척하지 않도록주의하십시오. </li><li> 멸균 유리 병에 세포 현탁액 6 ㎖를 넣어. </li><li> 800 rpm에서 유리 병 4 분 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 제거하고 부드럽게 배지 3 ㎖의 세포 침전물을 일시 중지합니다. </li><li> 제조 된 아가로 코팅 된 배양 접시에 세포 현탁액을 시드. </li><li> 원하는 직경의 상체가 형성 될 때까지 환자가 2 ~ 3 일 전부터 시작된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 배양 접시를 넣어. </li></ol></li></oL&gt; 2. 회전 타원체 및 창 주입 <ol><li> 분사 시스템의 제조 <ol><li> 10 분 동안 70 % 에탄올로 초음파 처리하여 깨끗한 유리 모세관 (직경 1 ㎜). 건조까지 인큐베이터 안에 물 이전 배치로 2 회 씻어. </li><li> 작은 주식을 준비하기 위해 피펫 풀러 여러 세정 된 유리 모세관을 당깁니다. </li><li> 일반적으로 300 ~ 350 ㎛, 외부 직경 250 ~ 300 μm의 내부 직경 : 원하는 크기의 경 사진 말단을 얻기 위해 조직 종이에 극한을 긁어서 뽑아 모세관의 끝을 휴식. 이 성형 과정에서 안구 졸업 미라 탑재 macroscope을 이용​​한 모세관의 직경을 제어한다. </li><li> 내경의 모세관의 외경 적합하다 플라스틱 배관의 조각을 사용하여 3 웨이 매니 폴드에 모세관의 비 경 말단을 연결한다. </li><li> 플라스틱 tubin 사용g는, 매니 폴드의 다른 두 가지 방법을 연결 25 μL 마이크로 리터 주사기 및 조직을 호환 미네랄 오일로드 1 ML의 주사기에. </li><li> 마이크로 리터 주사기 1ml의 주사기 사이의 경로를 설정하기 위해 매니 폴드 선택​​을 조정합니다. 제거 마이크로 리터 주사기의 피스톤과는 1 ㎖ 주사기의 피스톤을 눌러 새어까지 마이크로 리터 주사기로 역방향 미네랄 오일을 주입. 을 돌보는 것은 튜브에 공기 방울을 남기지 않도록하는 동안 마이크로 리터 주사기의 피스톤을 교체합니다. </li><li> 모세관은 1 ML의 주사기 사이의 경로를 설정하기 위해 매니 폴드 선택​​을 조정합니다. 튜브에 공기 방울을 남기지 않도록주의하면서 그것이 끝에서 새어까지 미네랄 오일과 모세관을 입력합니다. </li><li> 마이크로 리터 주사기와 모세관 사이의 연결을 설정하기 위해 매니 폴드 선택​​기를 조정한다. 미네랄 오일의 약 10 μl를 추방. </li><li> PBS 용액에 모세관 팁을 찍어및 마이크로 리터 주사기의 게이지를 이용하여, 모세관의 PBS의 5μL 빨아. 석유와 PBS의 메 니스 커스가 명확하게 볼 수 있습니다. </li><li> 수술 macroscope에서 맞는 3 축 미세 조작기에 모세관을 고정합니다. 이 시스템은 카메라 제어하에 주사 부위에 모세관을 대상으로 사용될 것이다. </li></ol></li><li> 회전 타원체 주입 <ol><li> 가볍게 (1-1.5 분 동안 공기 1.5 %) 유도 챔버에 아이소 플루 란을 흡입하여 마우스를 마취. </li><li> 케타민 / 자일 라진 (120 ㎎ / kg, 12 ㎎ / kg)의 혼합물을 복강 내 주사하여 동물을 마취. 마취는 종종 동물의 체온을 감소 유의. 그것은 26 ° C에서 방에 수술을 진행하고 기본 thermocontrolled 가열 패드로 동물을 따뜻하게 유지하는 것이 좋습니다. </li><li> 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 동물의 두피를 면도. </li><li> 장소귀 바, 마우스 피스를 사용하여 정위 프레임의 동물. </li><li> 포비돈 요오드 (3 % 비누, 다음 10 % 용액)로 피부를 청소합니다. </li><li> 메스와 두피의 중앙에 길이 방향으로 1 cm 긴 절개를합니다. 가위 정수리 뼈 위의 피부를 잘라 제거를 사용. </li><li> 메스의 칼날로 부드럽게 두개골 위의 골막을 제거합니다. 아낌없이 나중에 시멘트 준수를위한 거친 표면을 생성하는 뼈의 상단에 시아 노 아크릴 레이트를 적용합니다. </li><li> 4 개 mm 직경의 개두술을 생성하는 수술 macroscope에서 정수리 뼈를 뚫습니다. 아낌없이 가열을 방지하기 위해 전체 공정 중에 Pencillin (1,000 U / ㎖) 및 Streptomicin (1 ㎎ / ㎖)을 함유하는 빙냉 PBS를 추가한다. 집게와 젖은 멸균 거즈로 작은 뼈 조각을 제거합니다. 멀리 출혈을 방지하기 위해 정수리 두개골 봉합 적어도 1mm 드릴주의하십시오. </li><li> 유리 창문이 밀폐 될 개두술의 국경에서 얇은 뼈. 목표는 전자입니다뇌와 유리 사이의 최대 접촉 표면과 유리 창 nsure 저장 평면형 포지셔닝. 천천히 집게를 사용하여 뼈를 제거하고 PBS 용액으로 노출 DURA-이잖아요을 청소합니다. </li><li> , 5 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립을 알코올로 청소하고 휴지 말립니다. 개두술의 덮개로 커버 슬립을 사용하여 뇌의 대형 평면 표면이 유리와 접촉에 들어간 것을 확인하려고합니다. 필요한 경우 커버 슬립에 더 얇은 쪽의 뼈를 제거합니다. 조심스럽게 제자리에 한 번 커버 슬립에 압력을 적용하면 뇌가 평면 압착 얻을 수있을 때까지 계속 진행합니다. </li><li> 다시 알코올로 커버 슬립을 청소 티슈로 건조, 따로 따로 저장합니다. </li><li> 26 게이지 바늘로 아직 주요 혈관을 피하는 개두술의 중심에 두라 - 이잖아요에 구멍을 만든다. 그냥 두라 - 이잖아요을 열려면이 단계의 목적으로 뇌 실질 조직입니다 손상되지 않도록해야합니다. </li><li> 조심스럽게 경질 이잖아요 위스콘신 청소출혈성 혈액을 제거하는 PBS 솔루션을 토륨. 구형 주입을 준비하는 동안 휴지 조각으로 커버. </li><li> 2.1 단계에서 제조 된 구형 사출 시스템으로, 단계 1.2에서 제조 된 배양 접시에서 모세 혈관 내경 (약 200 ~ 250 μm의) 적당한 둥근 구형을 빨아. 회전 타원체는 약 5 ㎕의 배지와 함께 와야한다. 그것은 그것의 무게에 모세관의 끝을 아래로 떨어질 것이다. </li><li> 개두술을 커버하고 분사 시스템에서 동물을 배치하는 데 사용되는 물티슈 용지를 제거합니다. </li><li> 그것은 경질 이잖아요에서 만든 구멍에 닿을 때까지 주입 피펫을 낮 춥니 다. 그 후, 250 μm의 다시 내려. 30 초를 기다립니다. </li><li> 천천히 티슈 페이퍼의 얇은 조각으로 과량의 액체를 펌핑하는 동안 마이크로 리터 주사기의 피스톤 (2-3 μL)을 사용하여 회전 타원체를 주입. 30 초를 기다린 후 부드럽게 표면을 향해 50 ㎛에 의해 주입 피펫을 올립니다. 30 초와 반복 하오 다시 기다립니다표면까지 50 ㎛의 단계로 절차를 밟아야 톤. 대기 시간은 피펫에 충실 할 것 회전 타원체의 추출을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 형광 macroscope을 사용하여 뇌의 회전 타원체의 존재를 확인합니다. </li><li> 100 ~ 300 μm의 직경에게 페트리 접시에 PBS 용액으로 가교 덱스 트란 젤 구슬을 섞는다. 1 분을 기다린 후 약간의 수화 구슬 물고기. 개두술에 인접한 뼈에 배치. </li><li> 거시적 제어에서 경질-이잖아요 개구부의 크기와 비슷한 직경을 가진 하나의 구슬을 선택합니다. 집게를 사용하여 두 개의 반쪽의 가교 덱스 트란 젤 구슬을 잘라. </li><li> 부드럽게 회전 타원체를 향해 볼록한 얼굴 주입 구멍에 가교 덱스 트란 젤 헤미 - 구슬을 넣어. 오목의 국경이 주변의 경질 이잖아요과 접촉 얻을 때까지 조심스럽게 아래로 회전 타원체를 눌러를 제거하지 않도록주의하십시오. </li><li> 유리 슬라이드에 시아 노 아크릴 레이트 접착제 한 방울을 넣어 DRO에 이쑤시개의 끝을 찍어접착제의 소량 걸리는 P. 신속 주위 접착제를 스탬핑하여 인접한 경질 교인에 가교 덱스 트란 겔 헤미 - 비드의 가장자리를 밀봉. 이쑤시개에 가교 덱스 트란 젤 헤미 구슬을 접착 방지하기 위해 신속하고 정확한 움직임을 수행하기 위해주의하십시오. 건조하면 영상을 방지하지 않을 경우 확산 방해 할 수 접착제의 과잉을 피하십시오. 접착제가 건조하고 PBS 용액으로 개두술과 주변 뼈를 청소하는 2 분을 기다립니다. </li></ol></li><li> 윈도우 주입 <ol><li> 개두술 위의 coverslip의 둘레에 5 mm 직경의를 착용 할 것 (2.2.12 참조). 커버 슬립의 가장자리는 개두술의 외부에 얇아진 두개골에 있어야합니다. 커버 슬립의 가장자리에 두라 - 교인과 얇게 뼈와 접촉해야합니다. 그것은 그렇지 않으면 흉터 조직은 광학 선명도를 개발하고 방해 할 수있는 경질-이잖아요과 유리 커버 슬립 사이의 직접 접촉을하는 것이 매우 중요합니다. </li><li> 티슈로, 일에 PBS를 흡수커버 슬립의 중앙에 작은 압력을 적용 할 때 전자의 coverslip의 가장자리는 해당 솔루션 있도록 완전히 개두술을 포함하지 않습니다. 이것은 뼈, 유리, 뇌는 관심 영역의 측면에 접착되어 있는지 확인합니다. </li><li> 부드럽게 뼈와 커버 슬립 사이의 경계에서 시아 노 아크릴 레이트를 적용하는 동안 집게로 커버 슬립의 중심에 작은 압력을 유지한다. 접착제는 자발적 PBS 용액과의 계면까지 확산된다. 해결 방법은 접착제의 소수성 주어진 장벽 역할을합니다. 씰링 분 안에 효과가 있지만 해결 될 때까지 커버 슬립을 이동하지 않도록 매우주의해야한다. 이것은 그렇지 않으면 경질 이잖아요 따라서 수술의 실패로 이어질에 시아 노 아크릴 레이트를 노출시키는 결과를 가져올 것입니다. </li><li> 접착제는 유리의 상단에 확산했을 경우가 그렇지 않은 경우 광학 선명도를 줄일 수 있으므로, 나선형의 움직임을 수행하여 마이크로 메스 블레이드를 사용하여 제거합니다. 유리 coverslip에 DURIN을 깰하지 조심g 과도한 압력에 의한 절차. </li><li> 인접한 두개골 향하여 커버 슬립의 가장자리에 치과 용 시멘트를 적용하여 유리 고정 통합. 두피까지 전체 노출 된 두개골을 포함해야합니다. 여분의 시멘트를 사용하여, 목적의 침적에 필요한 풀을 생성하는 커버 슬립 주위 측벽을 구축. 치과 용 시멘트보다 10 분에서 치료됩니다. </li></ol></li></ol> 3. 수술 후 관리 및 이미징을위한 준비 <ol><li> 수술 후 관리 <ol><li> 정위 프레임에서 마우스를 제거 Dexamethazon (0.2 ㎎ / ㎏)과 Rimadyl 골반 지역에 (5 ㎎ / ㎏) 사우스 캐롤라이나를 주입하고 따뜻한 조직 둥지 새장에 그녀를 배치합니다. </li><li> 마취의 효과가 사라 때까지 동물을 모니터링합니다. 수술 후 일반적으로 2 ~ 3 시간에, 마우스는 완전히 이동할 수 있습니다. 동물이 음식과 물에 쉽게 액세스 할 수 있는지 확인하십시오. 아가로 오스가 포함 포도당 (과 동물을 제공 아가로 오스3 %, 글루코스 3 %). </li><li> 매일 동물의 체중을 모니터링하고 수술 후 첫 10D에 Dexamethazon (0.2 ㎎ / ㎏)과 Rimadyl (5 ㎎ / ㎏) 사우스 캐롤라이나를 주입. 손실은 원래 체중의 15 %를 초과 할 때, 윤리적 고려 사항은, 마우스를 안락사. 두개 내 압력은 동물 용 모터 장애로 이어지는 종양의 크기에 따라 증가한다. 이 종속 종양 세포 라인과 다양한 지연 수술 후 발생합니다. 특별한주의가 사용한 세포주와 실험의 끝점을 특성화하기 위해주의해야한다. </li></ol></li><li> 이미징을위한 준비 <ol><li> 가볍게 유도 챔버 (1-1.5 분 동안 공기 1.5 %)에서 아이소 플루 란을 흡입하여 마우스를 마취. </li><li> 케타민 / 자일 라진 (100 ㎎ / kg, 10 ㎎ / kg)의 혼합물을 복강 내 주사하여 동물을 마취. 이러한 마취는 일반적으로 관찰 45 분 수 있습니다. 이상 촬상 세션을 수행하기 위해, 마우스를 아이소 플루 란으로의 연속 흡입하에 배치공기 (0.25-0.75 %). </li><li> 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 정위 프레임에 동물을 넣고 earbars와 두개골을 차단합니다. </li><li> 혈관을 시각화하기 위해, 형광 염료는 정맥 내 주입 될 수있다. </li><li> 윈도우가 더러워 나타나면 부드럽게 얇은 칼날과 조직의 모서리와 이물질을 제거하여 세정 될 수있다. 항상 치과 시멘트와 호환되지 않습니다하고 창 아래의 뇌를 냉각 수있는 창을 청소하기 위해 알코올을 사용하지 마십시오. </li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이러한 접근 방식은 광학 이미징 방법의 사용이 일 주간 orthotopically 주입 된 신경 교종의 증식을 통해 모니터링 할 수있다. 같은 동물은 이후 병리의 과정에서 거의 모든 뇌 영상 기법을 실시 할 수있다; 아직 두 광자 현미경 특정 준비는 살아있는 동물의 뇌 속에있는 세포 이하의 해상도를 달성 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 우리의 프로토콜은 신경 교종 세포가 손상된 경막을 통해 중추 ?...

glioblastoma의 multiforme의 12 개월의 평균 생존과 성인의 뇌 종양의 가장 적극적인 형태와 5 %의 5 년 생존율로 나타납니다. 임상 관리는 수술, 방사선 치료 및 자주 조합에 사용되는 화학 요법에 의존합니다. 그러나, 이러한 치료의 효과는 1-3 완화 남아있다. 지금까지 신경 종양학 연구의 대부분은 (예를 들어 4.5에 대한 참조) 만 정적 뷰를 제공 할 수있는 종양 베어링 동물의 대규모 코호트에서 수행 다른 시간 지점에서 희생 기술에 의존하고 있습니다. 의 intravital 촬상에 근거 후속 방법의 최근 개발은 신경​​ 교종 성장 및 종양 세포 및 시간 이상의 동일한 동물에 미치는 병태 미시 사이의 상호 작용을 연구한다. 이 6 지금까지 이룰 수 있었다 정보의 독점적 인 조각의 길을 엽니 다. 그 세포에서 형광 물질을 발현하는 형질 전환 동물에 사용 될 수 있습니다이 논문에서 종양 세포 및 예를 들어 신경 세포 사이의 특정한 상호 작용을 연구하는 D. 지난 10 년간의 intravital 두 광자 현미경 (7)과 (&gt; 500 DURA-이잖아요 아래 μm의) 기본적인 신경 종양학 연구와 임상 실험 쥐의 뇌의 깊은의 intravital 관찰을 수행 할 수있는 능력에 대한 8,9의 황금 표준이되었습니다 마이크로 미터 공간 해상도 10. 만성 뇌 창 (11)이 주입 orthotopical 동물 모델의 intravital 이광자 현미경을 사용하여, 동일 마우스 9,12에서 시간에 따른 종양의 진행을 수행하는 것이 가능하다. 이러한 이전에 발행 된 동물 모델의 주요 단점 중 하나는 경질 교인이 세포 현탁액 9,13,14의 주입 후 밀봉되지 않는 종양의 성장을 제어하는 물리적 제약을 모방하지 않는 것이 그러나이다. 신경 교종 세포에서 누출 될이소성 하나에 소성을 신경 교종 모델을 변환 경막 외 공간. 여기에 제시된 동물 모델은 가교 덱스 트란 젤 헤미 - 구슬과 조직을 호환 접착제로 경질-이잖아요의 밀봉 한 다음 200 ㎛의 깊이에서 대뇌 피질에있는 형광 신경 교종 세포의 회전 타원체의 주입으로 구성 . 종양의 성장은 다음의 병태 생리 학적 물리적 제약을 유지하는 뇌 실질 조직으로 제한됩니다. 종양 위에 이식 만성 유리창의 intravital 두 광자 현미경을위한 쉬운 광 액세스 할 수 있습니다. 시간이 지남 신경 교종의 성장의 후속을 수행하고 (형광 덱스 트란을 강조하는 신경과 혈관 구조와 여기)의 미세 환경과의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다 관심의 세포에 형광 물질을 발현하는 형질 전환 동물을 사용하여.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1337">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:425px;">Drill</td>
			<td style="width:383px;">Dremel (Germany)</td>
			<td style="width:156px;">398</td>
			<td style="width:375px;">any high quality surgical bone drill would suffice</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:425px;">Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>501860 (#1/4)</td>
			<td>also sold by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Tissue scissors</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>14395</td>
			<td style="width:375px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Dumont tweezers M5S</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Dental cement</td>
			<td>GACD (USA)</td>
			<td>12-565 &#38; 12-568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Cyanoacrylate</td>
			<td>Eleco-EFD (France)</td>
			<td>Cyanolit 201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Glass capillaries without filament</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments (UK)</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Microliter syringe (25 &#181;l)</td>
			<td>Hamilton (USA)</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>Kite-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">T derivation (3-way stopcock - Luer lock)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>14035-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Stereotactic frame (mouse adaptor)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Glass coverslips</td>
			<td>Warner Instruments (USA)</td>
			<td>CS-5R (64-0700)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 &#181;m beads</td>
			<td>Available from various suppliers including Sigma (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Eye ointment</td>
			<td>TVM (France)</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Fluorescence macroscope</td>
			<td>Leica MZFLIII (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss LSM 7MP (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies (Nikon, &#8230;)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Infrared tunable femtosecond laser (Ma&#239;-Ta&#239;)</td>
			<td>Spectra Physics (USA)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy

아교 모세포종의 multiforme (GBM)는 날짜에 사용할 수없는 치료 치료와 뇌 종양의 가장 적극적인 형태입니다. 이 병리의 쥐 모델은 경질 이잖아요의 절개 다음 뇌 실질에 신경 교종 세포 현탁액의 주입에 의존하고 있습니다. 세포의 intravital 두 광자 현미경에 액세스 할 수 피상적으로 주입해야하는 반면, 표면 주사는 physiopathological 조건을 요점을 되풀이하지. 실제로, 주입 관을 통해 탈출하는 대부분의 종양 세포들이 실질로부터의 기계적인 제약 조건의 부재하에 비정상적으로 빠른 확장 여분 경막 공간에 도달한다. 우리 개선 focally 교종 타원체 주입보다는 대뇌 피질의 표면층에서 신경 교종 세포의 현탁액을 주입 에서뿐만 아니라의 surroun에 접착되어 가교 덱스 트란 겔 헤미 - 비드로 주사 부위를 막힘뿐만 이루어져땡 실질 및 시아 노 아크릴 레이트와 경질 이잖아요 밀봉. 합해서 이러한 조치는 뇌 실질 내부 종양 세포의 생리 학적 팽창 및 침윤을 시행. 유리 창은 흉터 조직 발달의 부재시 주 이상의 만성 이미징을 허용하도록 두개골에 시멘트와 개두 최종적으로 닫혔다. 우리가 신경 교종 세포, 신경 세포 (예를 들어 Thy1-CFP 마우스)과 혈관 (형광 염료의 정맥 주사에 의해 강조) 사이에서 발생하는 상호 작용의 역학의 intravital으로 시각화 할 수있는 것으로 나타났습니다 형광 종양 세포를 이식 형광 형질 전환 동물을 활용 질병의 진행 중에이 광자 현미경. 최소한의 손상된 뇌 환경에서 현미경 해상도의 이미지 종양 가능성은 신경 종양학과 약물 검사의 필드를 수혜 현재 GBM 동물 모델의 개선을 나타냅니다. </p&gt;

수술 프로토콜 (도 1)이 수행되면, 동물들은 희생 될 때까지 주 동안 형광 현미경에 의해 관찰 될 수있다. 염증 반응은 1 ~ 2 주 이내에 사라 수술 후 관찰 할 수있다. 종양의 성장 형광 macroscopy 두 광자 현미경 (그림 2) 등 다양한 기술 현미경으로 관찰 할 수있다. 여기에 묘사 된 예제 이미지는 형광 macroscope 및 펨토초 펄스 적외선 파장 가변 레이저와 집 수정 20X 침수 목적 (1....

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An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

우리는 종양의 성장하는 동안 재생에 일반적으로 생물 물리학 적 제약 조건을 되풀이되었습니다의 intravital 두 광자 현미경을위한 마우스에서 대뇌 피질의 소성을 glioblastoma의 모델을 설립했다. 종양 위의 두개골을 대체 만성 유리 창에는 두 개의 광자 현미경에 의해 시간이 지남에 따라 종양의 진행을 추적 할 수 있습니다.

소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

an-orthotopic-glioblastoma-mouse-model-maintaining-brain-parenchymal

Research

JoVE Journal

Medicine

19.6K 조회수.  Aix Marseille University.  우리는 종양의 성장하는 동안 재생에 일반적으로 생물 물리학 적 제약 조건을 되풀이되었습니다의 intravital 두 광자 현미경을위한 마우스에서 대뇌 피질의 소성을 glioblastoma의 모델을 설립했다. 종양 위의 두개골을 대체 만성 유리 창에는 두 개의 광자 현미경에 의해 시간이 지남에 따라 종양의 진행을 추적 할 수 있습니다. 

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An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Murine 방광 암의 Orthotopic 모델

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

연구

의학

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Orthotopic 마우스 뇌종양 모델의 조합 방사선 치료

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

역 형성 갑상선 암의 동소 마우스 모델

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

유전자 전달 연구 동소 방광암 모델

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

교 모세포종에 대한 면역 적격 동물 모델의 생물 발광 영상

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

자발적 유방암 전이의 동소 이식 마우스 모델

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate postprandial delivery of nutrients and hormones to insulin-sensitive tissues. We here describe a technique for combining intravital microscopy (IVM) and contrast-enhanced ultrasonography (CEUS) of the adductor compartment of the mouse hindlimb to simultaneously visualize muscle resistance arteries and perfusion of the microcirculation in vivo. Simultaneously assessing insulin's effect at multiple levels of the vascular tree is important to study relationships between insulin's multiple vasoactive effects and muscle perfusion. Experiments in this study were performed in mice. First, the tail vein cannula is inserted for the infusion of anesthesia, vasoactive compounds and ultrasound contrast agent (lipid-encapsulated microbubbles). Second, a small incision is made in the groin area to expose the arterial tree of the adductor muscle compartment. The ultrasound probe is then positioned at the contralateral upper hindlimb to view the muscles in cross-section. To assess baseline parameters, the arterial diameter is assessed and microbubbles are subsequently infused at a constant rate to estimate muscle blood flow and microvascular blood volume (MBV). When applied before and during a hyperinsulinemic-euglycemic clamp, combined IVM and CEUS allow assessment of insulin-induced changes of arterial diameter, microvascular muscle perfusion and whole-body insulin sensitivity. Moreover, the temporal relationship between responses of the microcirculation and the resistance arteries to insulin can be quantified. It is also possible to follow-up the mice longitudinally in time, making it a valuable tool to study changes in vascular and whole-body insulin sensitivity.

Insulin-induced vasodilation regulates muscle perfusion and increases the microvascular surface area (microvascular recruitment) available for solute exchange between blood and tissue interstitium. Combined intravital microscopy and contrast-enhanced ultrasonography is presented to simultaneously assess insulin&#39;s action at the larger vessels and the microcirculation in vivo.

Intravital 현미경 검사 법 및 대비 향상 된 초음파 마우스 Hindlimb의 인슐린 유도 된 혈관과 근육 관류 결합

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...