Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de subvención NSF-IOS Nacional N º 1144391 de SHB.

1. Preparación de Plantas <ol><li> Semillas de Arabidopsis se pueden germinaron directamente en el suelo o sobre placas de MS. Cultivar las plantas de cuatro a seis semanas en cámaras de crecimiento con un fotoperíodo de 12 horas (22 ° C el día, 15 ° C la noche 14). Las plantas de agua una o dos veces a la semana. Utilice la bandeja inferior para riego; qué no plantas de agua desde la parte superior, permiten que las bandejas que se seque antes de volver a regar. Asegúrese de que las plantas estén bien hidratados en el momento de la cosecha. </li></ol> 2. Preparación de las soluciones y platos <ol><li> K-EDTA solución 2: Haga una mM K 2-EDTA solución solución de 100 acciones, que se puede guardar en el refrigerador. En el día de la recogida, se diluye la solución de un solo a cinco (una solución de EDTA parte, cuatro partes de agua) para obtener una solución de 20 mM de K 2-EDTA. </li><li> Llene un vaso o una placa de Petri (diámetro de 7-15 cm) hasta la mitad con la solución de 20 mM K 2-EDTA. Si la recogida de muestras de diferentes tratamientos (por ejun amplio control y las plantas de sal estrés o diferentes genotipos), preparan platos separados para cada tratamiento. </li><li> Llenar número deseado de tubos de reacción de 1,7 ml con 1,4 ml de solución de 20 mM de K 2-EDTA. Llenar un número igual de tubos de reacción con 1,4 ml de agua desionizada autoclave o Millipore. </li><li> Ponga toallas de papel en el banco para establecer plantas de, obtener una nueva hoja de afeitar y se puso los guantes. </li></ol> 3. Colección de floema exudados (Representado en el Diagrama de flujo en la Figura 1) <ol><li> Cosechar las hojas de roseta de cuatro a seis semanas de edad, las plantas cortándolos con la hoja de afeitar en la base del pecíolo cerca del centro de la roseta. </li><li> Coloque inmediatamente las hojas de los platos que contienen 20 mM K 2-EDTA. Asegúrese de que el extremo cortado del peciolo se sumerge en la solución (Figura 2). </li><li> Una vez que se han recogido 15 hojas (aproximadamente tres y cincuenta y siete plantas), la pila con cuidado las hojas en la parte superior de uno al otro como tsombrero pecíolos el corte están alineados uno con el otro. Volver a cortar la base de los pecíolos (ca. 1 mm) y transferir inmediatamente las hojas en uno de los tubos de reacción con la solución de 20 mM de K 2-EDTA. Las hojas se ajustan más fácil si están ligeramente enrolladas. Evite apretar las hojas en ya que esto puede causar lesiones de las células y, por lo tanto, conduce a la colección del extendido de la hoja. </li><li> Si se necesita más material, cubra suavemente las muestras con una toalla de papel húmeda. Utilice un nuevo conjunto de platos, si para la recogida de muestras de diferentes tratamientos o genotipos. </li><li> Una vez que todas las muestras se colocan en tubos de reacción, recoger los exudados, ya sea en la oscuridad o en la luz. </li><li> Para la recogida en la oscuridad, la línea del piso de un gran plato hondo con toallas de papel mojadas. Coloque el bastidor con los tubos de reacción de hojas llenas en el plato y bien cubierta con toallas de papel húmedo o poner en una parte trasera de plástico negro con aberturas de aireación. Toda la instalación en un armario o una habitación oscura. </li><li> Para la recolección de la luz, cubrir el fondo de un recipiente de plexiglás transparente con toallas de papel mojadas. Coloque el bastidor con los tubos de reacción de hojas llenas en el recipiente y cerrarlo. </li><li> Después de 1 hora, quitar las hojas con cuidado desde el contenedor y los tubos de reacción y lavar a fondo con agua destilada, desionizada o Millipore para eliminar todo el EDTA. Este paso sirve para tres propósitos: (1) que elimina el EDTA para minimizar el daño a las células, (2) que elimina la interferencia de EDTA con SDS-PAGE y cromatografía, y (3) elimina los compuestos que se han acumulado a partir de corte / dañado las células. Transferir inmediatamente a los tubos de reacción preparados que contienen agua tratada en autoclave y volver a los contenedores de recogida humedecidas para la recogida de exudados. En este punto, añadir inhibidor de RNasa si el exudado necesita ser utilizado para la extracción de ARN. Opcional: inhibidor de la proteinasa puede ser añadido si se desea el análisis de proteínas. </li><li> Después de la hora de recogida previsto, sacar y discaª las hojas y congelar los exudados del floema en N2 líquido para su uso posterior. Si se necesita un almacenamiento prolongado, liofilizar las muestras y almacenar a -80 ° C. </li><li> En el caso de Arabidopsis, ya metabolitos pueden ser detectados después de la recogida de exudados durante 1 hora. Sin embargo, la colección de 5-8 horas es aconsejable si se prevé el análisis de los componentes menos abundantes. Para las plantas más grandes como Perilla, se recomiendan tiempos de recogida más largos (8 h). Exudado recogido de 15 hojas es normalmente suficiente para un carril en un gel de SDS-PAGE (proteínas), para la extracción de ARNm, GC-MS (azúcares y metabolitos). Para el análisis de los lípidos de la puesta en común de 2-3 muestras (exudado 30-45 hojas) se recomienda y conduce a resultados más claros. </li></ol> 4. Análisis posteriores (para vídeo sólo mostramos 4.4) <ol><li> Para el análisis de proteínas, muestra de resuspender en 15 l de agua y 30 l tampón Lämmli, calentar a 95 ° C durante 5 min, girar rápidamente por cualquier precipitates y cargar totalidad de la muestra en un gel de SDS-PAGE (45 bolsillos de carga l). Las muestras se tiñeron con Coomassie coloidal u otras manchas sensibles desde la abundancia de proteínas es muy bajo. </li><li> Para el azúcar y el análisis de metabolitos pequeña, añadir agentes de derivatización de la muestra seca como se describe en la literatura 14. </li><li> ARNm puede ser analizada mediante RT-PCR, el análisis de microarrays o ARN-Seq. </li><li> Para el análisis de lípidos inmediatamente piscina dos y cincuenta y ocho muestras de partición y contra cloroformo: metanol (01:01) en la campana de humos de la siguiente manera: añadir una cantidad igual de cloroformo: metanol a cada muestra, de vórtice durante unos pocos segundos, y se centrifuga durante 4 min a 400 x g. Recoger la fase inferior (orgánica) en un tubo de vidrio con tapa de teflón y la partición de repetición con la fase superior tres veces más. Se secan las fases orgánicas reunidas bajo una corriente de N 2 y someter a análisis adicional (cromatografía en capa fina: TLC 14, 37; cromatografía líquida espectrometría de masa: LC-MS 14). </li></ol>

No tenemos nada que revelar.

La colección de EDTA-facilitado de floema exudados es muy simple, necesita un mínimo de equipo, y es aplicable a la mayoría de las plantas. En general, este método se extiende a la capacidad de analizar exudados del floema de más especies. A pesar de que el exudado se diluye, que es fácil de recoger muchas muestras diferentes o de muchas plantas a escala hasta una gran cantidad de material. Esto entonces permite la detección de nuevos compuestos que se encuentran en muy baja abundancia y de otro modo se pasan por alto. Este método puede ser utilizado para múltiples especies de plantas y funciona como se describe para los que se enumeran en este manuscrito. Si se exploran nuevas especies, los dos aspectos que podrían necesitar modificaciones son el número de hojas utilizadas y el tiempo de la exudación. En la mayoría de los casos, una hora exudación siete y cincuenta y cinco debe ser adecuado. Para confirmar el uso de este método para una nueva especie vegetal, exudado necesita ser recopilada y uno o más de los análisis posterior tal como se describe en el protocolo de la parte 4 nECESIDADES a realizar. Dependiendo de la intensidad de la señal observada, puede necesitar ser reducido hasta el volumen de recogida. En general, los lípidos y análisis de proteínas se requieren más material que el análisis de azúcar y el metabolito ya que los primeros son menos abundantes en los exudados del floema. Debido a que el exudado de la colección de EDTA-facilitado consiste en superficies de corte, así como un efecto potencialmente dañino de EDTA, varios puntos tienen que ser considerados: (1) después de la una hora de incubación con EDTA, los pecíolos tienen que ser lavado a fondo. Esto elimina cualquiera de los compuestos obtenidos a partir de células heridos, así como el propio EDTA, lo que podría dañar las células o interferir con la extracción. (2) Los controles positivos y negativos deben ser incluidos para asegurar que los datos obtenidos se derivan de la savia del floema y no de las células dañadas (ver pasos críticos a continuación). (3) savia del floema contiene varias enzimas, que podrían ser activa durante la recogida de exudado. Por lo tanto, en algunos casos, puede ser útil para recoger FOr diferentes cantidades de tiempo. (4) Dado que el método implicaba exudación en agua, una cuantificación absoluta de los compuestos no es posible. Los pasos críticos: La clave para el uso exitoso de este método es el uso de precauciones durante la manipulación de la muestra no debe dañar a las células, así como el uso de controles apropiados (véase la referencia 14.). Un control adecuado es la colección de exudados del floema sin tratamiento previo con EDTA. En este caso, el floema sellará en sí y no hay exudado puede ser recogido. Cualquier compuestos contaminantes procedentes de las células heridos serán detectados aquí. Un segundo control sería el análisis de los azúcares en el exudado. En Arabidopsis, sacarosa debe ser el metabolito predominante dentro de la savia del floema, con fructosa a la relación de sacarosa de 01:04-01:08 (ref 8, 14). Para la extracción de ARN es necesario el uso de un inhibidor de RNAsa. Además, un control positivo de los anteriormente describiendoed ARNm floema-localizada (UBC9: enzima de conjugación de ubiquitina 9, At4g27960; 8, 14) y un control negativo de por ejemplo un ARNm cloroplasto (Rubisco LSU) son aconsejables. Debido a que el exudado contiene enzimas activas, un curso de tiempo se aconseja para asegurar que los cambios en el perfil de floema no son simplemente debido a las variaciones en el tiempo de recogida. En algunos casos, puede ser beneficioso utilizar inhibidores de proteinasas. Sin embargo, los investigadores deben tener en cuenta, que el exudado recogido se concentra y que los compuestos añadidos se concentran en gran medida. Un segundo paso crítico en el protocolo es el recutting del pecíolo bajo EDTA. Este paso tiene un doble propósito: en primer lugar, que elimina cualquier placa de tamiz sellados mientras que la prevención de la formación de nuevas bujías permitiendo así la libre circulación de la savia del floema. En segundo lugar, se elimina la burbuja de cavitación en el xilema generado durante el corte y por lo tanto permite el transporte xilema. El tamaño de la segunda corte dependes de las plantas utilizadas. En las plantas con pecíolos más grandes que debería ser de varios milímetros (hasta 1 cm) por encima del primer corte, en plantas como Arabidopsis, 1-2 mm son suficientes. El uso de este método puede conducir al descubrimiento de nuevos compuestos en los exudados del floema que podría haber de señalización, consecuencias para el desarrollo o biomédica. Se ha impulsado una mirada más profunda a la señalización de lípidos de larga distancia, que era un campo poco estudiado dentro de la ciencia de la planta debido a la falta de acceso al floema.

Las plantas no pueden moverse para escapar de condiciones adversas. Por lo tanto, tuvieron que desarrollar mecanismos para detectar el estrés ambiental, obtener y transmitir una señal relacionada con toda la planta, y ajustar en consecuencia el desarrollo. Existen dos sistemas de transporte para la distribución de agua, nutrientes y otros compuestos (señalización). El primero es el xilema; que normalmente transporta agua y minerales absorbidos por las raíces en toda la planta. El segundo es el floema. La vista de la floema ha cambiado de un sistema de transporte asimilar sencilla a un conducto para el ARN, proteínas, virus, lípidos y otras moléculas pequeñas. Desempeña un papel importante en la asimilación y transporte de nutrientes, la respuesta al estrés biótico y abiótico, así como en el crecimiento y desarrollo de plantas. Ahora se llama la &quot;supercarretera de la información&quot; de la planta 18. El floema se compone de varios tipos de células: parénquima del floema, así como compañero especializada ceLLS y elementos de tamiz. El elemento de tamiz es el sitio del movimiento de larga distancia. Para permitir el flujo sin obstáculos longitudinal, elementos de tamiz están perdiendo la mayoría de los orgánulos, así como núcleos y se cree que contienen en el mejor de una maquinaria de traducción limitada 21, 33. Se cree que las células de compañía sintetizan proteínas y otros compuestos, que viajan en la corriente de floema. Estos compuestos son entonces transportados en el elemento de tamiz a través de los plasmodesmos y pueden funcionar como señales de larga distancia 4,16. Varios grupos de compuestos se pueden encontrar en los exudados del floema: <ul><li> Los azúcares son con frecuencia los productos de la fotosíntesis y son transportados como &quot;portadora de energía&quot; moléculas a otras partes de la planta para el almacenamiento o como bloques de construcción. Sin embargo, también pueden funcionar como anticongelante o como compuestos de señalización. </li><li> Las proteínas también se pueden encontrar en los exudados del floema. Ellos incluyen enzimas metabólicas, sino también tener una función de señalización. Una exampLe de una proteína que sirve como una señal de desarrollo es la proteína T locus de floración, lo que indica la inducción de la floración, así como abscisión de las hojas en las plantas de temporada. 6 </li><li> Los ácidos nucleicos que están presentes en los exudados del floema en forma de ARNm, ARN pequeños y micro, y ARN virales. Ellos parecen estar implicadas en gran medida en la señalización 27, 28, 39. Al mismo tiempo, ARNr y ARNt para casi todos los aminoácidos se han observado en la savia del floema de las cucurbitáceas 42. Parecen ser transferida selectivamente en el sistema de tubo de tamiz. Los ARNt muestran modificaciones necesarias para la capacidad de transferencia de aminoácidos para el aparato de traducción. Sin embargo, en lugar de participar en la traducción, que parecen inhibir este proceso. Alternativamente, podrían servir como una fuente de citoquinina o señalar el estado metabólico de la planta 42. </li><li> Los ácidos grasos, Oxylipins, y otros lípidos también se han encontrado en el floema exudados 3, 13, 14, 23. Jasmoácido NIC, un oxylipin mueve a través del floema como parte de la respuesta a la infección por patógenos 22, 29, 31, 32. Mientras que el papel de la mayoría de los lípidos del floema todavía no está claro, algunos de ellos probablemente tienen una función de señalización 4. </li></ul> El desafío en el trabajo con el floema de plantas reside en su capacidad para sellar heridas a sí mismo. Hay cuatro métodos principales que se utilizan para recoger exudados del floema, sin embargo, sólo funcionan en especies seleccionadas: 1) En cucurbitáceas es posible obtener cantidades razonables de floema exudado a través de recortes de la pecíolo. Una vez que la caída inicial con la contaminación de las células lesionadas se retira, es posible obtener cantidades razonablemente grandes de pura savia del floema 1, 15. Sin embargo, con el aumento de tiempo de recogida, este exudado se espesa, por lo que es cada vez más inadecuados para enfoques de cromatografía de líquidos (no publicado). Publicaciones recientes sugieren, que dependiendo de la especie, esta savia del floema se deriva de either la fascicular (FP) o la extrafascicular floema (PE) y que, mientras que sí contiene &quot;móvil&quot; savia del floema de los elementos de tamiz (FP), que también es propenso a la contaminación de otros tipos de células, incluyendo el xilema 40, 41 . 2) Un segundo enfoque es el de obtener savia del floema a través de cortes poco profundos o punciones en tallo o pecíolo. Este método ha sido utilizado con éxito en altramuz 17, 25, 36 cucurbitáceas, y Brassica napus 12. Aquí la contaminación de las células lesionadas es mínimo y los exudados muy puro. Sin embargo, las plantas necesitan para estar sanos y bien regada, ya que es muy difícil para perforar selectivamente sólo los elementos cribosos. Si están mellados vasos del xilema, todos exudado es arrastrado en el flujo de xilema. Esto hace que el método adecuado para plantas con pecíolos o tallos muy frágiles o altamente lignificada. 3) stylectomy áfidos pulgones permite insertar su estilete en los elementos cribosos deln retirar el pulgón con un láser. Savia del floema es exudada a través de la restante estilete 2, 9, 10, 35, 38. En teoría, cualquier planta que puede ser infectado por los áfidos se puede utilizar para este enfoque. Sin embargo, la mayoría de invernadero o administradores de cámara de crecimiento no apoyará el uso de un agente patógeno. Además, los áfidos introducen varias proteínas en el floema con su saliva 19, 33. Esto conduce a una reprogramación transcripcional limitada 30 y tiene el potencial de cambiar la composición del floema 26. 4) El método descrito aquí es la exudación EDTA-facilitado de savia del floema. Este método emplea EDTA para evitar la obturación del floema 20. EDTA quelatos de iones Ca 2 + que participarían de otra manera en los procesos que sellan el floema. Mientras que el EDTA puede conducir a daño celular 30, varios grupos han utilizado este método y se observó ningún efecto adverso de las concentraciones de EDTA de 10 mM a 20 mM sobre la ultraestructura de células o en phloem carga y transporte 5, 24. Para reducir cualquier efecto perjudicial así como la interferencia de EDTA con cromatografía y electroforesis en gel, las plantas se mueven en el agua después de 1 h, y sólo la parte posterior de la exudado se utiliza 14. Por lo tanto, en lugar de exudación en EDTA, floema se exudados en agua (EDTA-facilitado exudación). Se trata de un sencillo, de bajo costo y baja tecnología, método para la recogida de exudados del floema. Savia del floema obtenidos de este modo se puede utilizar para analizar las proteínas, moléculas pequeñas, lípidos, y ARN y se ha utilizado con éxito en muchas plantas. Si bien una cantidad limitada de experimentos se ha realizado en monocotiledóneas 11, el método parece ser más adecuado para las dicotiledóneas (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, álamo 7). Colección de exudados tiene que ocurrir en un ambiente húmedo para evitar la pérdida de exudados a través de la transpiración. Dependiendo de la planta, la incubación en EDTA durante una a dos horas essuficiente para evitar el sellado de los elementos del floema / tamiz. La colección, entonces puede ocurrir en agua. Esto tiene la ventaja de evitar el efecto negativo de EDTA tiene en la estructura celular y la estabilidad. También elimina la interferencia de EDTA con métodos como HPLC o SDS-PAGE. Se muestra como se aplica a Arabidopsis. Para las plantas más grandes, la incubación en EDTA y exudado colecciones tiene que ser ampliado y se realiza en vasos y no en tubos de reacción de 1,7 ml.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">K2-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">ED2P-500G</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm)</td>
			<td>PYREX or Corning</td>
			<td></td>
			<td>Any clean, shallow dish will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>EMD</td>
			<td>CX1054-1</td>
			<td style="width:223px;">Only open containers in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:111px;">9070-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">53283-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">Sun Sri</td>
			<td style="width:111px;">13-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:152px;">Denville</td>
			<td style="width:111px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

El floema de plantas es esencial para el transporte de larga distancia (foto-) asimila, así como de transmitir señales de estrés biótico o abiótico. Contiene azúcares, aminoácidos, proteínas, ARN, lípidos y otros metabolitos. Aunque hay un gran interés en la comprensión de la composición y la función del floema, el papel de muchas de estas moléculas y, por tanto, su importancia en el desarrollo de la planta y la respuesta de estrés aún no se ha determinado. Una barrera para el análisis de floema radica en el hecho de que los propios sellos del floema sobre hiriendo. Como resultado, el número de plantas de las que savia del floema puede obtenerse es limitada. Un método que permite la recogida de exudados del floema a partir de varias especies de plantas sin el equipo añadido es la colección de EDTA facilitado por floema exudado se describe aquí. Si bien es fácil de usar, que hace lugar a las heridas de las células y el cuidado tiene que ser tomado para eliminar contenidos de las células dañadas. Además, varios controles para demostrar la pureza del exudadoson necesarios. Debido a que es una exudación en lugar de una colección directa de la savia del floema (no es posible en muchas especies) sólo cuantificación relativa de sus contenidos puede ocurrir. La ventaja de este método sobre los demás es que puede ser utilizado en muchas especies de plantas herbáceas o leñosas (Perilla, Arabidopsis, álamo, etc) y requiere un mínimo de equipo y la formación. Esto conduce a cantidades razonablemente grandes de exudados que pueden ser utilizados para el análisis posterior de proteínas, azúcares, lípidos, ARN, virus y metabolitos. Es bastante simple que se puede utilizar en una parte de investigación, así como en un laboratorio de enseñanza.

Se ha hecho evidente en los últimos años que la complejidad de la savia del floema puede ser la respuesta a la pregunta de cómo las plantas envían señales que varían en el desarrollo y el estrés de respuesta óptima. El uso de EDTA facilitado exudación floema puede proporcionar la oportunidad de analizar los exudados del floema de las plantas que no son adecuadas para otros enfoques, pero puede ser de interés económico o fisiológico. Este método permite la cosecha de floema exudados suficiente para identificar las proteínas floema-localizados y detectar cambios en su nivel en respuesta al desarrollo o el estrés (Figura 3). Como muestra la figura, las proteínas se encuentran en muy baja abundancia, sin embargo, su nivel es lo suficientemente alto como para proteómica experimentos posteriores utilizando LC-MS/MS o para el análisis de Western blot. Los hallazgos en cucurbitáceas sugieren que el corte del vástago conduce a una ruptura del equilibrio potencial de agua y una afluencia posterior de agua yposibles contaminantes desde el apoplasto 41. Sin embargo, para los tiempos de recogida que van desde una a ocho horas no afecta el perfil floema proteína / composición en Arabidopsis (. Sólo la cantidad absoluta varía Guelette et al), la cantidad de proteína recogida y el patrón de proteínas que se encuentran varía entre las especies (Arabidopsis: A, Perilla, carril I y NI) y tratamientos (Perilla cultiva en diferentes longitudes de día, carril I y NI). Como resultado, las señales proteicas se pueden visualizar, identificados y seguidos. ARNm y micro ARN también se pueden identificar en los exudados del floema por este método. Sin embargo, el tratamiento con inhibidor de ARNasa es necesario para prevenir la degradación del ARNm durante el tiempo exudación extendida. Puesto que los elementos de tamiz no contienen cloroplastos funcionales, pequeña de Rubisco o subunidad grande (glóbulos rojos o rbcL, respectivamente) los ARNm pueden utilizarse como controles negativos, mientras que conocida floema-Localizada ARNm como enzima de conjugación de ubiquitina puede ser utilizado como un control positivo (Figura 4). Del mismo modo, azúcares o pequeñas metabolitos pueden ser analizados utilizando GC-MS o LC-MS. Aquí se debe mencionar que los exudados del floema contienen un gran número de enzimas funcionales, incluyendo casi la totalidad de la vía glucolítica 12. Por lo tanto, el uso de varios puntos de tiempo puede revelar procesos metabólicos durante la recogida de exudado. Un ejemplo se muestra en la Figura 5: En todos los exudados, la sacarosa es el metabolito más abundante, lo que es más evidente después de una colección durante 1 hora. Sin embargo, después de cinco horas, la relación de sacarosa a fructosa se reduce ligeramente. Si el exudado de la misma se recoge durante una hora y se dejó en el banco para los siguientes cuatro horas, la relación de sacarosa a fructosa se reduce en un grado mucho mayor, lo que sugiere que las enzimas activas en el floema exudados conducen a una degradación de la sacarosa a temperatura ambientetura (para más interpretaciones pico ver 14). Esto es consistente con los hallazgos que floema carga y el transporte de moléculas a partir de células acompañantes en los elementos de tamiz pueden continuar durante exudación hasta que el sistema pierde su vitalidad 34. Los lípidos en los exudados del floema y, por extensión, de señalización de lípidos de larga distancia son un campo relativamente reciente de interés en la ciencia de las plantas. Debido a sus lípidos naturaleza hidrófoba sólo están presentes en bajas concentraciones y se puede unir a otras moléculas para la solubilización. Sin embargo, la exudación de EDTA-facilitado permite la colección de material suficiente para visualizar (TLC; Figura 6) e identificar (LC-MS; Figura 7) los lípidos del floema de varias especies de plantas. Como muestra la figura, es posible identificar y separar varias especies de lípidos. LC-MS permite identificar las diferentes especies de lípidos y para monitorear los cambios en el perfil lipídico de diferegenotipos nt o tratamientos. Esto permite el estudio del papel de los lípidos durante el desarrollo de la planta y la respuesta al estrés. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Diagrama de flujo de la colección de floema exudados de Arabidopsis o Perilla. Diferentes caminos conducen a diferentes productos finales, que se indican en azul. Para la preparación de ARN, inhibidor de ARNasa (100 U / ml, Roche) se añade al agua en la que se recoge el exudado floema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Configuración de los materiales de floema exudado recogerde iones. La instalación muestra todos los materiales necesarios para los pasos del protocolo 3.1 a 3.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Figura 3 Proteínas que se encuentran en el floema exudados de dos especies diferentes de plantas de Arabidopsis, (A) y (I Perilla y NI; diferentes longitudes días); MW: marcador de peso molecular (carril 2). Las proteínas se separaron usando un gradiente de 10-20% de SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Análisisde la presencia de ARNm para la pequeña de Rubisco y la subunidad grande (los glóbulos rojos y rbcL, respectivamente) y la enzima de conjugación de ubiquitina (UBC). ARNm se recogió a partir de hojas de Arabidopsis (L), pecíolos (P), y los exudados del floema (Ph), revertir transcripciones transcritas y específica visualizaron utilizando PCR. La figura fue modificado a partir Guelette et al. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Perfil de GC-MS del floema exudados recogidos para diversa cantidad de veces. Tenga en cuenta cómo la cantidad relativa de los cambios de sacarosa a partir de 1 hora de recogida (A) a 5 horas de tiempo de recogida (B). Exudado perfil después de la recolección durante 1 hora seguido de &quot;incubación&quot; en la sala<html> temperatura (RT) durante cuatro horas (C). Hoja perfil de metabolito (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Cromatograma en capa fina comparando los lípidos de Perilla (izquierda) y hojas de Arabidopsis (derecha) y exudados del floema. Los asteriscos indican los lípidos específicos para exudados del floema. DGDG: digalactosildiacilglicerol; PG: fosfatidilglicerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; La parte de la figura mostrando lípidos Arabidopsis ha sido modificado desde Guelette et al 14.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. Perfil lipídico de floema exudados de Arabidopsis (cloroformo fase) utilizando LC-MS / modo de iones negativos. Los gráficos en la parte superior (mutante, A) y la parte inferior (de tipo salvaje, B) muestran las diferencias en los perfiles de lípidos entre los dos genotipos diferentes (indicadas por flechas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

El conocimiento de la composición de la savia del floema, así como el mecanismo de su transporte de carga y de larga distancia es esencial para la comprensión de la señalización de larga distancia en el desarrollo de la planta y el estrés / respuesta patógeno y de transporte de asimilados. Este manuscrito describe la colección de exudados del floema utilizando el método de EDTA-facilitado.

Recopilación y análisis de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floema exudados mediante el método de EDTA-facilitado

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

collection-analysis-arabidopsis-phloem-exudates-using-edta

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

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24.2K vistas.  Michigan State Universtiy.  El conocimiento de la composición de la savia del floema, así como el mecanismo de su transporte de carga y de larga distancia es esencial para la comprensión de la señalización de larga distancia en el desarrollo de la planta y el estrés / respuesta patógeno y de transporte de asimilados. Este manuscrito describe la colección de exudados del floema utilizando el método de EDTA-facilitado. 

Video: Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Un método simple para imágenes Arabidopsis Uso de hojas perfluorodecalina como un medio de imágenes infiltrativas

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Investigación

Biología

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Análisis específico de célula de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Hojas usando citometría de flujo

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Con el método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Método estandarizado para la esterilización de alto rendimiento de semillas de Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Un método versátil para el montaje de Arabidopsis las hojas para la proyección de imagen de Time-lapse Intravital

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

Método sándwich de membrana de dos capas para la recolección de saliva de Laodelphax striatellus

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental step required towards this end. Thus, it is paramount to establish high-throughput Arabidopsis seed surface sterilization methods to handle tens to hundreds of samples (e.g., transgenic lines, ecotypes, or mutants) at once. A seed surface sterilization method based on the efficient elimination of liquid in tubes with a homemade suction device constructed from a common vacuum pump is presented in this study. By dramatically reducing labor-intensive hands-on time with this method handling several hundreds of samples in one day is possible with little effort. Series time-course analyses further indicated a highly flexible time range of surface sterilization by maintaining high germination rates. This method could be easily adapted for surface sterilization of other kinds of small seeds with simple customization of the suction device according to the seed size, and the speed desired to eliminate the liquid.

A high-throughput protocol for the surface sterilization of Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) seeds is provided, optimizing the liquid handling steps with a simple suction device constructed with a vacuum pump. Hundreds of seed samples can be surface-sterilized in one day.

Método de alto rendimiento, robusto y altamente flexible en el tiempo para la esterilización superficial de semillas de Arabidopsis

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un ensayo de quimiotaxis mejorado para la identificación rápida de quimioatrayentes rizobacterianos en exudados radiculares

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female gametophyte are essential for double fertilization and subsequent seed development. The interactions between male and female gametophytes during pollen tube reception culminate in pollen tube rupture and the release of two sperm cells to effect double fertilization. As pollen tube growth and double fertilization are deeply hidden within the tissues of the flower, this process is difficult to observe in vivo.
A semi-in vitro (SIV) method for the live-cell imaging of fertilization in the model plant Arabidopsis thaliana has been developed and implemented in several investigations. These studies have helped to elucidate the fundamental features of how the fertilization process occurs in flowering plants and which cellular and molecular changes occur during the interaction of the male and female gametophytes. However, because these live cell imaging experiments involve the excision of individual ovules, they are limited to a low number of observations per imaging session, making this approach tedious and very time-consuming. Among other technical difficulties, a failure of the pollen tubes to fertilize the ovules in vitro is&#160;often reported, which severely confounds such analyses.
Here, a detailed video protocol for the imaging of pollen tube reception and fertilization in an automated and high-throughput manner is provided, allowing for up to 40 observations of pollen tube reception and rupture per imaging session. Coupled with the use of genetically encoded biosensors and marker lines, this method enables the generation of large sample sizes with a reduced time investment. Nuances and critical points of the technique, including flower staging, dissection, medium preparation, and imaging, are clearly detailed in video format to facilitate future research on the dynamics of pollen tube guidance, reception, and double fertilization.

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Here, we describe an improvement of the semi-in vitro (SIV) method for observing pollen tube guidance and reception in Arabidopsis thaliana,&#160;which increases the receptivity of ovules. The high-throughput SIV cum septum method may be coupled with gametophyte marker lines and genetically encoded biosensors to monitor the dynamic process of fertilization.

Imágenes en vivo de la recepción del tubo polínico de Arabidopsis y la doble fertilización utilizando el método semi-in vitro cum septum

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...