Nos gustaría agradecer a todos los miembros del laboratorio McMahon por su asistencia y apoyo. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de un R01 CA176839-01 NIH / NCI (MM) y un Premio de Investigación Institucional y Académica Desarrollo Profesional (IRACDA a JS).

1. Preparación de lisados ​​de células enteras de cultivo celular <ol><li> Coloque placas de cultivo de células en hielo y añadir PBS frío con EDTA 5 mM (por ejemplo, 5 ml de PBS con 5 mM EDTA/10 cm 2 placas). Retire las células adherentes de la placa utilizando un raspador de células y luego transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml de frío. </li><li> Sedimenten las suspensiones de células por centrifugación a baja velocidad a 1.000 rpm (230 xg) durante 5 min a 4 ° C. Colocar tubos cónicos en hielo y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento. </li><li> Lavar el pellet con 1 ml de PBS con EDTA 5 mM y transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 1,5 ml en frío. Suspensión de giro rápido a 13.000 rpm (13.226 xg) durante 10 segundos para sedimentar las células. Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar los tubos de pellets y colocar en hielo. </li><li> Resuspender el precipitado en 25-200 l (dependiendo del tamaño de los gránulos, es decir, para 3 x 10 6 células ~ añadir 150 l de tampón RIPA) enTampón RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, 10 mM NaF, 0,1% de SDS, desoxicolato de sodio 0,5%, 1% de NP-40) que contiene la proteasa recién añadido y inhibidores de la fosfatasa a una concentración final de 2x. En resumen vórtice cada tubo y se incuba la suspensión durante 20-30 min en hielo. Nota: hay varios tampones de lisis que se pueden usar para extraer las proteínas, que difieren en su capacidad para solubilizar proteínas y fuerza de su detergente de desnaturalización (es decir, SDS, Triton X-100, o NP-40). Tampón RIPA es útil para la preparación de lisados ​​de células enteras y perturbar las interacciones proteína-proteína. </li><li> Para crear una fracción post-nuclear, lisados ​​de centrifugación a 14.000 rpm (15.339 xg) durante 5 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo sin interrumpir los tubos de pellets y lugar nucleares enriquecido en hielo. Nota: el pellet nuclear enriquecido también puede desprenderse del tubo mientras se extrae el sobrenadante. Para evitar recoger el sedimento nuclear enriquecido, coloque la punta de la pipeta directamente into el sedimento nuclear enriquecido viscosa y dibujarlo con la pipeta con el fin de disponer de él. </li><li> Determinar las concentraciones de proteína de cada muestra de acuerdo a las instrucciones del fabricante, utilizando tales ensayos de cuantificación de proteína como de BCA o de Bradford. </li></ol> 2. Preparación de la muestra y electroforesis <ol><li> Prepare cada muestra de acuerdo con el siguiente cuadro se detalla a continuación. Como alternativa, β-mercaptoetanol también se puede utilizar a una concentración final de 2,5%. Sin embargo, el agente reductor debe añadirse a cada muestra hasta una hora antes de cargar el gel. Las cuentas de volumen total de las variaciones de pipeteo con sólo 20 l de cada muestra preparada cargados por pocillo. <table border="1"><tbody><tr><td> REACTIVO </td><td> MUESTRA REDUCIDA </td></tr><tr><td> Proteína de la muestra </td><td> X l </td></tr><tr><td> Sample Buffer 4x LDS </td><td> 6 l </td></tr><tr><td> 500 nM de DTT RojoAgente ucing </td><td> 2.4 l </td></tr><tr><td> Agua desionizada </td><td> Hasta 15,6 l </td></tr><tr><td> Volumen Total </td><td> 24 l </td></tr></tbody></table></li><li> Muestras de calor a 70 ° C durante 10 min. Mientras que las muestras se están calentando, prepare 1000 ml de MES 1x o MOPS funcionamiento de amortiguación (50 ml 20x MES o MOPS funcionamiento de amortiguación, más 950 ml de agua desionizada). MOPS funcionamiento de amortiguación resuelve proteínas de tamaño entre 14-200 kDa, mientras MES Running Buffer resuelve las proteínas de peso molecular más pequeños entre 2-200 kDa con un pKa menor, lo que permite a los MES Running Buffer para correr más rápido que los MOPS 4. Por lo tanto, estas dos memorias intermedias han de contraste efectos sobre la migración de iones dentro del gel de apilamiento que conduce a diferencias en la separación de las bandas de proteínas 4. Ponga a un lado y se combinan 200 ml de MES 1x o MOPS funcionamiento de amortiguación con 500 l de antioxidantes, los cuales serán utilizados para llenar la Sala Constitucional del Alto Min Bufferunidad de electroforesis i-Cell. </li><li> Una vez que las muestras se acaban de calefacción, muestras vuelta rápida antes de colocarlos en hielo. </li><li> Para el montaje de los prefabricados de hormigón Bis-Tris geles en la unidad Mini-Cell para electroforesis siga las instrucciones del fabricante. Nota: asegúrese de que cada gel está orientado de tal manera que el casete más corto (más pequeño) de cada gel se enfrenta hacia el interior del Buffer Core y los geles son de nivel y firmemente presionado contra el Buffer Core para evitar fugas de la Cámara de búfer superior. </li><li> Llene la cámara de amortiguación superior con los 200 ml de MES o MOPS Running Buffer que contiene el antioxidante y la Cámara de búfer inferior de la unidad Mini-Cell con unos 600 ml de MES o MOPS Running Buffer 1x 1x. El extra de 200 a 300 ml de tampón se pueden guardar para su uso posterior. Sin embargo, no se recomienda para reciclar el tampón utilizado durante la ejecución de la electroforesis como el pH y la calidad de la memoria intermedia pueden ser alterados. </li><li> Cargue 20 l de cada samp proteínaLe en cada pocillo. Si el corte de la membrana en varias tiras con el fin de sondear para múltiples anticuerpos (es decir, más de 2), es muy recomendable para cargar 2-5 l de la proteína estándar prestained en los primeros y últimos pocillos de cada gel ya que esto servirá como guías de corte para la separación de las diferentes secciones de la membrana sin afectar a la formación de imágenes de las bandas de proteínas. </li><li> Geles de funcionar a 200 V constante durante 35 minutos con una corriente esperado de 110-125 mA / gel en la salida y 70-80 mA por gel al final. La electroforesis es completa cuando el colorante migra hacia el seguimiento de alambre de platino a lo largo del tampón Core. </li></ol> 3. Transfer Protein Usando el Sistema Blotting iBlot seco <ol><li> Completamente separar los mini-geles rompiendo las partes unidas de la casete (esto puede producir un ruido crepitante). Deseche la placa más corta (más pequeño) y transfiera con cuidado el gel de la (ranurado) ya la placa en un recipiente con agua desionizada yeliminar la porción de espesor de pierna del gel situado en la parte inferior. Nota: en casos poco frecuentes, el gel puede conectar a la placa más corta en lugar de la más larga, la placa ranurada. En este caso, desechar la, placa ya ranurada y quitar la parte gruesa pierna del gel localizado en la parte inferior. Entonces, transferir cuidadosamente el gel de la placa más corta a agua desionizada. </li><li> Montar las pilas de transferencia de ánodo y cátodo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: las membranas tanto de nitrocelulosa o PVDF proporcionan alta calidad y eficiente transferencia de las proteínas y son compatibles con la detección fluorescente 8. Sin embargo, la membrana de PVDF tiene una capacidad de unión más alta (240 g / cm 3) de nitrocelulosa (200 g / cm 3) 8. </li><li> Quite cuidadosamente cualquier burbuja o el aire atrapado entre el gel y la membrana, ya que esto evitará que cualquier distorsión de las bandas de proteínas durante la transferencia. Nota: no se recorte la membrana o la transfer apilar para adaptarse a su tamaño de gel, ya que esto hará que el contacto directo entre las pilas de ánodo y cátodo. </li><li> Después de ensamblar correctamente las pilas de transferencia en el dispositivo secante seco, seleccione el programa voltaje apropiado (es decir, el Programa 3: 20 V durante 7 min) y comenzar la transferencia. Nota: Las proteínas de más de 150 kDa suelen migrar más lentamente y pueden requerir un tiempo de transferencia más larga de 8-10 min. Además, la incubación previa del gel en etanol al 20% durante 5-10 min también ayudará a mejorar la eficiencia de la transferencia de estas grandes proteínas. Una vez que el programa de transferencia se haya completado, el dispositivo se apagará automáticamente la corriente. Lo mejor es retirar inmediatamente la membrana y continuar con el procedimiento de bloqueo para asegurar una mejor detección de la proteína y evitar la desecación de la membrana. </li></ol> 4. Detección de la proteína fluorescente en el infrarrojo <ol><li> Bloquear la membrana (s) en un mínimo de 0,8 ml / cm 2 de Odyssey tampón de bloqueo (no añadir Tween-20) durante 1 hora ola noche a 4 ° C. Membrana (s) también puede ser bloqueada con leche en polvo sin grasa, sin embargo esto puede causar mayor fondo e interferir con la detección de la proteína. </li><li> Incubar la membrana (s) en el anticuerpo primario a la concentración deseada en la Odisea tampón de bloqueo con 0,1% de Tween-20 durante la noche a 4 ° C. Para la detección de dos colores, en el que dos antígenos diferentes se visualizan en la misma transferencia, los dos anticuerpos primarios deben ser derivados de diferentes especies huésped y se añaden simultáneamente a la membrana (s). Nota: antes de la incubación de la membrana (s) en el anticuerpo primario, la membrana (s) puede ser seccionado en varias piezas con el fin de sondear para múltiples anticuerpos (es decir, más de 2) en la misma membrana. </li><li> Lavar la membrana (s) de 3x durante 10 min en TBS más 0,1% de Tween-20 con agitación suave. </li><li> Incubar la membrana (s) con los anticuerpos secundarios fluorescentemente marcado a una dilución de 1:20.000 para el canal de 700 nm y 1:6,000-1:10,000 para el canal de 800 nm en Odyssey tampón de bloqueo con 0,1% de Tween-20 durante 30-60 minutos (incubando la membrana (s) durante más de 1 hora puede aumentar el fondo). Protege la membrana (s) de la luz. Nota: los anticuerpos secundarios necesitan ser derivado de la misma especie hospedadora como cada uno de los anticuerpos primarios y etiquetados con diferentes fluoróforos. </li><li> Lavar la membrana (s) de 3x durante 10 min en TBS más 0,1% de Tween-20 con agitación suave. Protege la membrana (s) de la luz. </li><li> Membrana (s) puede secarse o almacenarse en cualquiera de TBS o PBS sin Tween-20 a 4 º C hasta su escaneado y la imagen con un sistema de imagen de infrarrojos. Señal de fluorescencia se mantendrá estable durante varios meses si se protege adecuadamente de la luz. </li></ol>

<ol>
	<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling.">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li><li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support.">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBlot+Dry+Blotting+System.">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blot+Analysis.">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030.">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li><li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Milk+Composition.">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li><li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes.">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos críticos en la generación de alta calidad, transferencias de Western cuantitativos en función de este protocolo son las siguientes: 1) la medición de las concentraciones de proteínas, 2) la preparación de la muestra, y 3) el bloqueo de la membrana y, 4) la calidad y el calibre de la primaria de anticuerpos. La precisión de la medición de las concentraciones de proteína total puede tener un impacto importante en la cuantificación de las bandas de proteínas ya que la excep...

<html> La técnica de Western Blot se desarrolló por primera vez entre 1977 y 1979 con el fin de crear un mejor método para la detección de proteínas utilizando anticuerpos 1-3. Este procedimiento utiliza la transferencia electroforética de las proteínas a las membranas de los geles de SDS-PAGE con proteínas diana visualizados utilizando anticuerpos secundarios y detectadas por autorradiografía, la luz ultravioleta, o un producto de reacción de la peroxidasa 3. Por lo tanto, estos mismos principios básicos siguen siendo ampliamente utilizados en los protocolos de transferencia de Western de hoy. Sin embargo, esta clásica técnica de Western Blot sí presenta muchos inconvenientes, como los tiempos de ejecución lentos electroforesis, baja resolución y bandas de proteínas artificiales, la susceptibilidad a la degradación de las proteínas, y una sensibilidad limitada, así como la mala calidad de los datos 4. Por lo tanto, este protocolo se describen los avances y mejoras significativas para el procedimiento de transferencia Western estándar que genera los datos cualitativos y cuantitativos más precisos. &quot;&gt; El sistema de Laemmli para la separación de una amplia gama de proteínas utilizando SDS-PAGE es el sistema de gel más utilizado para el Western Blot 5. A pesar de la popularidad de este sistema de Western Blot, este método puede dar lugar a una distorsión de la banda, la pérdida de resolución, y bandas espurias 4. Esto puede ser una consecuencia de la desaminación y de alquilación de las proteínas debido a la alto pH (9,5) de la separación de gel, la reoxidación de la reducción de enlaces disulfuro debido a la variación de estado redox del gel, y la escisión de aspartil-prolil bonos debido al calentamiento de la proteína en tampón de Laemmli (pH 5,2) 4,6 peptídicos. El sistema de gel Bis-Tris, que opera a un pH neutro (7.0), proporciona beneficios significativos sobre el sistema Lamemmli. Este sistema mejora la estabilidad de la proteína, minimiza modificaciones de la proteína, mantiene las proteínas en sus estados reducidos, impide la división aspartil-prolil durante la electroforesis, y lo más importante, el tiempo de electroforesis ejecutar es 35 min 4,6,7. Además, Tsistema de gel Bis-Tris él también produce bandas más nítidas, mayor resolución y separación, y aumento de la sensibilidad que resulta en datos más fiables 4. En conjunto con el sistema de gel Bis-Tris, el sistema de transferencia seco iBlot utiliza alta intensidad de campo y corrientes para reducir significativamente el tiempo de transferencia de las proteínas a partir de geles a membranas dentro de 7 min 8. Este sistema de transferencia se basa en el método de transferencia en seco que genera una transferencia más eficiente y fiable de las proteínas de 8. Para una comparación detallada de la eficacia del sistema de transferencia iBlot a los sistemas convencionales de transferencia, consulte la siguiente página web: <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application</a>s/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Se utiliza una pila ánodo y el cátodo, que se compone de una matriz de gel que contiene los tampones de transferencia adecuados, que actúan como reservorios de iones 8. Durante la transferencia, la electrólisis del agua ayuda a prevenir la generación de oxígeno del ánodo de cobre que resulta en una transferencia de proteínas más consistente sin causar la distorsión de la banda 8. Por otra parte, este sistema de transferencia también aumenta la velocidad de transferencia reduciendo la distancia entre los electrodos 8. Aunque quimioluminiscencia es la técnica más común y tradicional para la detección de proteínas de análisis de Western blot, la detección fluorescente en el infrarrojo de dos colores mejora en gran medida la sensibilidad, la calidad y precisión de los datos de transferencia de Western. Este método de detección utiliza excitación de láser infrarrojo en dos longitudes de onda óptimas, 700 nmy 800 nm, para generar una imagen clara de datos con la mayor relación señal-ruido y alta sensibilidad 9. Por lo tanto, dos proteínas diana pueden ser visualizados simultáneamente en la misma membrana utilizando el 700 nm y 800 canales de detección fluorescentes nm. Más importante aún, la linealidad y rango dinámico de fluorescencia infrarroja permite el análisis cuantitativo preciso de bandas tanto fuertes y débiles de proteínas 9. Además, este protocolo ofrece enormes ventajas y mejoras sobre la clásica técnica de Western Blot por la disminución de la electroforesis y los tiempos de transferencia de este experimento sin comprometer la eficacia de estos procesos y la utilización de detección de la proteína fluorescente en el infrarrojo para producir mayores Western blot datos cualitativos y cuantitativos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:297px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:204px;">Thermo Scientific/Pierce</td>
			<td style="width:123px;">23225</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">4x NuPAGE&#174; LDS Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10x NuPAGE&#174; Sample Reducing Agent&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0002</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MOPS SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NuPAGE&#174; Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0335BOX</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0336BOX</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SeeBlue&#174; Plus2 Pre-Stained Standard&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">XCell SureLock&#174; Mini-Cell&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, PVDF Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, Nitrocellulose Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, Nitrocellulose Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Gel Transfer Device&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2228</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-BIM (S69)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total BIM</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>1036-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total ERK1/2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9107</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Blocking Buffer&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-40000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-32211&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68020&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Western Incubation Box, Medium&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>929-97205&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Classic Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Application Software V3.0.30</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis

Las técnicas de transferencia Western que se establecieron originalmente en la década de 1970 todavía se utilizan activamente en la actualidad. Sin embargo, este método tradicional de la transferencia Western tiene varios inconvenientes que incluyen la resolución de baja calidad, bandas espurias, disminución de la sensibilidad, y la pobre integridad de la proteína. Los avances recientes han mejorado drásticamente numerosos aspectos del protocolo de transferencia Western estándar para obtener datos cualitativos y cuantitativos más elevados. El sistema de gel Bis-Tris, una alternativa al sistema de Laemmli convencional, genera una mejor separación y la resolución de la proteína, mantiene la integridad de la proteína, y reduce la electroforesis a un tiempo de 35 min de ejecución. Por otra parte, el sistema de transferencia seco iBlot, mejora drásticamente la eficacia y la velocidad de la transferencia de la proteína a la membrana en 7 min, lo que es en contraste con los métodos de transferencia de proteínas tradicionales que son a menudo más ineficiente con largos tiempos de transferencia. En combinación con estas modificaciones altamente innovadoras, proteína Detection usando infrarrojos resultados de imagen fluorescente de mayor calidad, más precisa y de datos en comparación con la técnica de Western Blot estándar de quimioluminiscencia. Esta tecnología puede detectar simultáneamente dos antígenos diferentes en la misma membrana mediante la utilización de dos colores tintes de infrarrojo cercano que se visualizan en diferentes canales fluorescentes. Además, la linealidad y rango dinámico amplio de imagen fluorescente permite la cuantificación precisa de las bandas de proteínas tanto fuertes y débiles. Por lo tanto, este protocolo se describen las mejoras clave para el método de transferencia Western clásico, en el que estos avances aumentan significativamente la calidad de los datos al tiempo que reduce enormemente el tiempo el rendimiento de este experimento.

Dos colores de fluorescencia infrarroja detecta bandas tanto fuertes y débiles en la misma membrana con aumento de la sensibilidad y la relación más alta de señal a ruido para producir imágenes de Western blot claras. Los resultados típicos generados por dos colores de detección de transferencia de Western visualizado tanto en el 700 nm y 800 nm canales fluorescentes se ejemplifican en las Figuras 1 y 2. El Western blot más superior en la Figura 1 muestra el con...

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The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Este protocolo explora los últimos avances en la realización de análisis de Western blot. Estas nuevas modificaciones emplean un sistema de gel Bis-Tris con una electroforesis en tiempo de ejecución 35 min, un sistema de transferencia Blot seco 7 min, y detección de la proteína fluorescente en el infrarrojo y formación de imágenes que genera una resolución más alta, la calidad, la sensibilidad, y la mejora de la precisión de los datos occidentales.

El más rápido de Occidente en la ciudad: un toque contemporáneo en el análisis clásico de Western Blot

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

26.9K vistas.  University of California, San Francisco.  Este protocolo explora los últimos avances en la realización de análisis de Western blot. Estas nuevas modificaciones emplean un sistema de gel Bis-Tris con una electroforesis en tiempo de ejecución 35 min, un sistema de transferencia Blot seco 7 min, y detección de la proteína fluorescente en el infrarrojo y formación de imágenes que genera una resolución más alta, la calidad, la sensibilidad, y la mejora de la precisión de los datos occidentales. 

Video: The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

Western Blot utilizando el Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Investigación

Biología

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

Inducción quirúrgica de edema endolinfático por la obliteración del conducto endolinfático

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: Preparación de muestras para la detección

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imágenes y Reconstrucción 3D de Estructuras Embrionarias cerebrovasculares en pez cebra

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

La diferenciación de ratón recién nacido piel derivados de las células madre en células germinales-como<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Una guía para la moderna cuantitativa fluorescente Western Blot con las estrategias de solución de problemas

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Floral-Dip transformación de lino (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Para generar transgénicos progenies con una alta tasa de Transformación

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

Imágenes del tráfico intracelular de APP con GFP fotoactivable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...