Biz onların yardım ve destek için McMahon laboratuvarın tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma bir NIH / NCI R01 CA176839-01 (MM) ve Kurumsal Araştırma ve Akademik Kariyer Geliştirme Ödülü (JS IRACDA) hibe tarafından desteklenmiştir.

1.. Hücre Kültürü alınan bütün hücre lizatları hazırlanması <ol><li> Buz üzerinde hücre kültür kaplarına koyun ve 5 mM EDTA (PBS örneğin 5 ml 5 mM EDTA/10 cm 2 tabanı ile), soğuk PBS ilave edin. Bir hücre kazıyıcı kullanılarak tabaktan yapışmayan hücreler giderilmiş ve sonra soğuk bir 15 ml konik tüp hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1000 rpm&#39;de (230 x g) düşük hızlı santrifüjleme ile hücre süspansiyonları Pelet Buz üzerinde konik tüpler yerleştirin ve dikkatli pelet bozmadan süpernatant aspire. </li><li> 5 mM EDTA içeren PBS içinde 1 ml pelet yıkayın ve soğuk 1.5 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın. Hücreler pelet 10 saniye boyunca 13,000 rpm (13,226 xg) Quick Spin süspansiyonu. Dikkatle buz üzerinde pelet ve yer tüpleri aksatmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> In, (örneğin 3 x 10 6 hücre için RIPA tampon ~ 150 ul ekle topak boyutuna bağlı olarak) 25-200 ul pelletiniRIPA tamponu (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10 mM NaF,% 0.1 SDS,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 1 NP-40), 2x nihai konsantrasyonda taze ilave proteaz ve fosfataz inhibitörleri ihtiva etmektedir. Kısaca her tüp vorteks ve buz üzerinde 20-30 dakika süreyle askıya inkübe. Not: proteinleri ve denatüre edici deterjan (örneğin SDS, Triton X-100 ya da NP-40) gücünü çözündürülmesi için kabiliyetleri farklı proteinleri çıkarmak için kullanılabilecek çeşitli liziz tampon vardır. RIPA tamponu bütün hücre lizatları hazırlanması ve protein-protein etkileşimlerini bozan için yararlıdır. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 14,000 rpm (15,339 xg), bir post-nükleer fraksiyonu santrifüj lizatları oluşturmak için Buz üzerinde nükleer zenginleştirilmiş pelet ve yer tüpleri bozmadan yeni bir tüp süpernatant aktarın. Not: süpernatantı genişletilirken nükleer pelet bakımından zenginleştirilmiş, aynı zamanda, borunun ayırmak olabilir. Nükleer zenginleştirilmiş pelet toplama önlemek için, ben doğrudan pipet yerleştirmekviskoz nükleer zenginleştirilmiş pelet nto ve onu imha etmek için pipet ile o kadar çizin. </li><li> BCA ya da Bradford gibi protein miktar tahliller kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak, her numunenin protein konsantrasyonunu belirleyin. </li></ol> 2. Numune Hazırlama ve Elektroforez <ol><li> Aşağıda özetlenen aşağıdaki tabloya göre her bir örnek hazırlayın. Bir alternatif olarak, β-mersaptoetanol da% 2.5 &#39;lik bir son konsantrasyonda kullanılabilir. Bununla birlikte, söz konusu indirgeme ajanı, jel yüklemeden önce bir saat için, her numune kadar eklenmelidir. Hazırlanan her numunenin sadece 20 ul pipet varyasyonlar için toplam hacim hesaplar iyi başına yüklendi. <table border="1"><tbody><tr><td> REAKTİF </td><td> DÜŞÜK NUMUNE </td></tr><tr><td> Protein Numune </td><td> X ul </td></tr><tr><td> 4x LDS Sample Buffer </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> 500 nM DTT Reducing Ajan </td><td> 2.4 ul </td></tr><tr><td> Deiyonize Su </td><td> Kadar 15.6 ul </td></tr><tr><td> Toplam Hacim </td><td> 24 ul </td></tr></tbody></table></li><li> 10 dakika boyunca 70 ° C&#39;de ısı örnekleri. Örnekler ısıtma olsa da, (50 mi 20x veya MES çalışma buffer MOPS artı 950 ml deiyonize edilmiş su) akan tampon 1x MES veya MOPS 1000 ml hazırlar. Tampon Koşu MES MES hızlı MOPS 4 daha çalıştırmak için Buffer Koşu sağlayan bir düşük pKa ile 2-200 kDa arasında daha küçük molekül ağırlıklı proteinler giderir ise tampon Koşu MOPS, 14-200 kDa arasında orta boy proteinleri giderir. Bu nedenle, bu iki tampon protein bantlarının 4&#39;ün ayrılmasından farklılıklara neden olan istifleme jel içinde iyonlarının göçü üzerindeki etkileri zıt var. Kenara ve Min Üst Tampon Odası&#39;nı doldurmak için kullanılacak 200 1x MES ml veya Antioksidan 500 ul ile Buffer Koşu MOPS, birleştirmeki-Cell elektroforez birimi. </li><li> Numuneler buz üzerinde yerleştirmeden önce ısıtma, hızlı sıkma örnekleri bitirdikten sonra. </li><li> Elektroforez için Mini-Cell ünitesine prekast Bis-Tris jellerin montajı için üreticinin yönergelerini izleyin. Not: Her bir jel, her jel kısa (küçük) kaset Tampon Çekirdek içeriye doğru dönük ve jeller düzey ve sıkı Üst Tampon Odası sızmasını önlemek için tampon Çekirdek bastırılan böyle bir moda odaklı olduğundan emin olun. </li><li> 1x MES veya Antioksidan ve 1x MES veya Buffer Koşu MOPS yaklaşık 600 ml Mini-Hücre biriminin Alt Tampon Odası&#39;nı içeren Buffer Koşu MOPS 200 ml Üst Tampon Odası&#39;nı doldurun. Tampon çalışan ekstra 200-300 ml daha sonra kullanmak üzere kaydedilebilir. Bununla birlikte, tamponun pH değeri ve kalite değiştirilmiş edilebilir elektroforez çalışması sırasında kullanılan tampon geri dönüşüm için tavsiye edilmez. </li><li> Her bir protein samp 20 ul yükle her bir kuyunun içine. Birden antikorlar (yani en fazla 2) problanması için çeşitli şeritler halinde membran kesit halinde, oldukça bu olarak görev yapacak her jel ilk ve son kuyularda Önceden Boyanmış protein standart 2-5 ul yük önerilir protein bantlarının görüntüleme etkilemeden, zarın farklı bölümleri ayırmak için, kesme alanlar. </li><li> Sonunda başlangıç ​​ve jel başına 70-80 mA&#39;da 110-125 mA / jel beklenen bir akımı ile 35 dakika boyunca 200 V sabit çalıştır jeller. Izleme boya Buffer Çekirdek boyunca platin tel göç Elektroforez tamamlanır. </li></ol> 3. IBlot Kuru Blot Sisteminin Kullanılması Protein Transferi <ol><li> Tamamen (bu çatırdatacak üretebilir) kasetin bağlanmış tarafı kırarak Mini-jeller ayırın. Daha kısa (küçük) plaka atın ve dikkatli bir şekilde deiyonize su ile bir kabın içine daha fazla (yarıklı) plakadan jel aktarmakalt kısmında yer alan, jel kalın ayaklı kısmını çıkarmak. Not: Nadir durumlarda üzerine, jel uzun kısa plaka yerine eklemek olabilir, plaka yaptı. Bu durumda, daha uzun, oluklu levha atmak ve alt kısmında yer alan, jel kalın ayaklı kısmını çıkarmak. Daha sonra, dikkatli bir şekilde iyondan arındırılmış su ile kısa plakadan jel aktarın. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak anot ve katot aktarma yığınları birleştirin. Not: nitroselüloz veya PVDF membranları iki protein arasında yüksek kaliteli ve verimli transferi sağlar ve floresan algılaması 8 ile uyumludur. Bununla birlikte, PVDF membran nitroselüloz daha yüksek bir bağlama kapasitesine (240 ug / cm 3) (200 ug / cm 3) 8 var. </li><li> Dikkatlice kabarcıklar veya bu gibi jel ve membran arasına sıkışmış hava transferi sırasında protein bantlarının herhangi bozulmasını engeller çıkarın. Not: membran veya transf Döşeme yoker bu anot ve katot yığınlar arasında doğrudan temasın neden olacak gibi jel boyutuna sığacak şekilde yığını. </li><li> Sonra düzgün kuru emme cihazda aktarma yığınları montaj, uygun voltaj programı (yani Program 3: 7 dakika 20 V) seçin ve transferi başlar. Not: 150 kDa&#39;dan büyük bir proteinler daha yavaş göç eğilimi ve 8-10 dakika daha uzun bir aktarım zaman gerektirebilir. Buna ek olarak, 5-10 dakika boyunca% 20 etanol içinde jelin önceden kuluçka da bu büyük proteinlerin aktarım etkinliğini artırmak için yardımcı olacaktır. Transfer programı tamamlandığında, cihaz otomatik olarak akımı kapanacaktır. Hemen membran kaldırmak ve daha iyi protein algılama sağlamak ve membran kurumasını önlemek için engelleme prosedürü ile devam etmek en iyisidir. </li></ol> 4. Kızılötesi Floresan Protein Algılama <ol><li> Odyssey 1 saat ya da için Buffer (Tween-20 ekleyin Etmeyin) Engelleme 0.8 ml / cm 2 minimum blok membran (ler)gece boyunca at 4 ° C. Membran (ler), aynı zamanda, ancak bu daha yüksek bir arka plan neden olabilir ve protein algılama engelleyebilir, yağsız kuru süt ile bloke edilebilir. </li><li> 4 ° C de bir gece boyunca,% 0.1 Tween-20 ile Bloklama Tamponu Odyssey&#39;de istenen konsantrasyonda primer antikor olarak membran (lar) inkübe Iki farklı antijenler, aynı blot üzerinde görselleştirildiği edildiği iki renkli algılama için, iki primer antikorlar, farklı ev sahibi türünden türemiş olması ve membran (lar) aynı anda ilave edildi. Not: önce, birincil antikor olarak membran (lar) kuluçka için, zar (lar), aynı zar üzerinde birden fazla antikor (yani en fazla 2) için araştırmak amacıyla çeşitli parçalar halinde bölümlere edilebilir. </li><li> TBS içinde 10 dakika artı% 0.1 Tween-20 hafifçe çalkalanarak için membran (lar) 3 kez yıkayın. </li><li> Odysse olarak 800 nm kanal için 700 nm kanal ve 1:6,000-1:10,000 için bir 1:20,000 seyreltide floresan etiketli sekonder antikor ile membran (lar) inkübey (daha uzun süre, 1 saat boyunca membran (lar) enkübe arka arttırabilir), 30-60 dakika boyunca,% 0.1 Tween-20 ile Bloklama Tamponu. Işıktan membran (ler) koruyun. Not: ikincil antikorlar birincil antikor her biri aynı ev sahibi türünden türemiş farklı fluorophores işaretlenmelidir gerekmektedir. </li><li> TBS içinde 10 dakika artı% 0.1 Tween-20 hafifçe çalkalanarak için membran (lar) 3 kez yıkayın. Işıktan membran (ler) koruyun. </li><li> Taranır ve Kızılötesi Görüntüleme Sistemi ile görüntülenmiş kadar membran (lar) Tween-20, 4 ° C &#39;de kurutulur ve TBS veya PBS ile ya da depolanabilir. Düzgün ışıktan koruyarak floresan sinyal birkaç ay boyunca stabil olacaktır. </li></ol>

<ol>
	<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling.">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li><li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support.">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBlot+Dry+Blotting+System.">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blot+Analysis.">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030.">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li><li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Milk+Composition.">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li><li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes.">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokole uygun olarak yüksek kaliteli, niceliksel Western blotları elde edilmesinde kritik adımlar aşağıdaki gibidir: 1) protein konsantrasyonlarının ölçülmesi, 2) örnek hazırlama, 3) bloke edilmesi ve, 4), birincil antikor kalite ve kalibre. Toplam protein konsantrasyonları ölçüm doğruluğu kızılötesi floresan tespit olağanüstü duyarlılık örneklerin protein konsantrasyonu bulunan herhangi bir hafif farklılıkları büyütmektedir çünkü protein bantları mi...

<html> Western blot tekniği kullanılarak ilk antikorlar 1-3 proteinlerinin bulgulanması için daha iyi bir yöntem yaratmak için 1977 ve 1979 yılları arasında geliştirilmiştir. Bu prosedür, ikincil antikorlar kullanılarak görselleştirildi ve otoradyografi, UV ışığı veya bir peroksidaz reaksiyon ürünü 3 tarafından tespit hedef proteinler SDS-PAGE jelleri zarlara proteinlerinin elektroforetik transferi kullanılmıştır. Bu nedenle, bu aynı temel prensipler hala yaygın olarak bugünün Batı benek protokolleri kullanılır. Ancak, bu klasik Western lekeleme tekniği böyle yavaş elektroforez çalışma süreleri, düşük çözünürlükte ve yapay protein bantları, protein yıkımı yatkınlık, ve sınırlı duyarlılık yanı sıra zayıf veri kalitesi 4 olarak mevcut birçok dezavantajları yapar. Bu nedenle bu protokol daha doğru nitel ve nicel veriler üretir standart Batı benek prosedüre önemli ilerlemeler ve geliştirmeleri açıklar. &quot;&gt; SDS-PAGE kullanılarak proteinlerin geniş bir ayrılması için Laemmli sistemi bu Western blotting sistemin popülerlik rağmen. Western blot 5 için en çok kullanılan jel sistemi olup, bu yöntem, bant bozulma, çözünürlük kaybı ve neden olabilir sahte bantları 4. bu ayırma jel, indirgenmiş disülfid jelin farklı redoks durumuna bağlı bağlar, ve aspartil-prolil bölgesinin parçalanmasının reoksidasyon yüksek pH (9.5) nedeniyle proteinlerin deaminasyon ve alkilasyon bir sonucu olabilir, Laemmli tampon maddesi (pH 5.2) 4,6 proteini ısıtılması nedeniyle peptid bağlar., nötr pH değerinde (7.0) ile çalışır Lamemmli sistemi üzerinde önemli avantajlar sağlar Bis-Tris jel sistemi. Bu sistem, protein stabilitesi, en aza artırır protein modifikasyonları, bunların düşük eyalette proteinleri muhafaza elektroforez sırasında aspartil-prolil bölünmesini önler ve daha da önemlisi, elektroforez çalışma süresi t, ek olarak. 35 dk 4,6,7 olduğuO Bis-Tris jel sistemi de daha güvenilir veri 4 sonuçlanan keskin bantlar, yüksek çözünürlük ve ayırma, ve artan duyarlılığı üretir. Bis-Tris jel sistemi ile bağlantılı olarak, iBlot kuru blot sistemi önemli ölçüde, 7 dakika içinde 8 zarının üzerine jellerinden proteinlerin devir süresini azaltmak için yüksek bir alan kuvveti ve akımlarını kullanır. Bu transfer sistemi proteinleri, 8, daha verimli ve güvenilir transferi oluşturur kuru lekeleme yöntem dayanmaktadır. : Konvansiyonel aktarım sistemlerine iBlot transfer sisteminin etkinliği ayrıntılı bir karşılaştırma için aşağıdaki web sitesine bakın <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application</a>s/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Bu iyon rezervuar 8 olarak hareket uygun aktarma tamponlar içeren bir jel matrisinin oluşmaktadır bir anot ve katot yığını kullanmaktadır. Transferi sırasında, su elektroliz bant bozulma 8 neden olmadan daha tutarlı bir protein transferi ile sonuçlanan bakır anot oksijen üretilmesini engellemeye yardımcı olur. Ayrıca, bu transfer sistemi, aynı zamanda, elektrotlar 8 arasındaki mesafeyi azaltarak aktarım hızını artırır. Kemiluminesan Western Blot protein tespiti analizleri için en yaygın ve geleneksel bir teknik olmasına rağmen, iki renkli kızılötesi floresan tespiti büyük ölçüde Western Blot veri duyarlılık, kalite, ve doğruluğunu artırır. Bu saptama metodu, iki uygun dalga boyunda, 700 nm olarak kızıl ötesi lazer kullanır uyarmave 800 nm, büyük sinyal-gürültü oranı ve yüksek duyarlılık 9 ile net bir veri görüntü oluşturmak için. Bu nedenle, iki hedef proteinler, 700 nm ve 800 nm floresan saptama kanalları kullanılarak, aynı zar üzerinde eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Daha da önemlisi, kızıl ötesi floresan doğrusallık ve dinamik aralık güçlü ve zayıf hem de protein bantları 9 hassas kantitatif analiz için izin verir. Ayrıca, bu protokol bu işlemlerin etkinliğini tehlikeye ve daha nitel ve nicel Western blot verileri üretilmesi için, kızılötesi floresan protein algılama kullanmadan bu denemenin elektroforez ve transfer kez azaltarak klasik, Western lekeleme tekniği üzerinde büyük bir avantaj ve geliştirmeleri sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:297px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:204px;">Thermo Scientific/Pierce</td>
			<td style="width:123px;">23225</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">4x NuPAGE&#174; LDS Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10x NuPAGE&#174; Sample Reducing Agent&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0002</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MOPS SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NuPAGE&#174; Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0335BOX</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0336BOX</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SeeBlue&#174; Plus2 Pre-Stained Standard&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">XCell SureLock&#174; Mini-Cell&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, PVDF Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, Nitrocellulose Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, Nitrocellulose Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Gel Transfer Device&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2228</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-BIM (S69)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total BIM</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>1036-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total ERK1/2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9107</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Blocking Buffer&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-40000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-32211&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68020&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Western Incubation Box, Medium&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>929-97205&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Classic Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Application Software V3.0.30</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis

Aslında 1970&#39;lerin sonlarında kurulan Western Blot teknikleri hala aktif olarak bugün kullanılmaktadır. Ancak, Batılı beneklenmesinin bu geleneksel yöntem, düşük kaliteli çözünürlük, sahte bantları, duyarlılık azalması ve zayıf protein bütünlüğü dahil birçok sakıncaları vardır. Yeni gelişmeler büyük ölçüde yüksek nitel ve nicel veri üretmek için standart Batı benek protokolü birçok yönlerini düzeldi. Bis-Tris jel sistemi, geleneksel Laemli sistemine alternatif, daha iyi protein ayırma ve çözünürlük üretir protein bütünlüğünü korur ve bir 35 dk çalışma süresi elektroforezini azaltır. Ayrıca, iBlot kuru blot sistemi, büyük ölçüde sık sık uzun transfer süreleri daha verimsiz olan geleneksel protein transfer yöntemleri aksine, 7 dakika içinde zara transfer protein etkinliğini ve hızını artırır. Bu çok yenilikçi değişiklikler, protein D ile birlikteetection, yüksek kalitede kızıl ötesi floresan görüntüleme sonuçları kullanılarak daha hassas ve kemiluminesans standart Western blot tekniği ile karşılaştırıldığında veriler tutarlı. Bu teknoloji, aynı anda farklı flüoresan kanallar olarak görüntülenen iki renkli yakın kızıl ötesi boyalar kullanarak, aynı zar üzerinde iki farklı antijenlerini tespit edebilir. Ayrıca, flüoresan görüntüleme doğrusallık ve geniş dinamik aralık güçlü ve zayıf hem de protein bantlarının hassas ölçümü sağlar. Böylece, bu protokol, büyük ölçüde bu denemenin performans zaman azaltırken, bu gelişmelerin önemli verilerin kalitesini arttıran klasik Western lekeleme yöntemi için anahtar geliştirmeleri açıklar.

İki renkli kızılötesi floresan gelişmiş hassasiyet ve net Western Blot görüntüler üretmek için en yüksek sinyal-gürültü oranı ile aynı zar üzerindeki güçlü ve zayıf hem bantları algılar. 700 nm ve 800 nm flüoresan kanallar hem de görsel iki renkli Western blot algılama tarafından oluşturulan tipik sonuçlar, Şekil 1 ve 2&#39;de örneklenmiştir. Şekil 1 &#39;de üst Western blot insandan lizatlarının, iki kat seri dilüsyonları 700 nm k...

Watch this Scientific Journal Video about The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis at JoVE.com

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Bu protokol Western Blot analizleri gerçekleştirerek son gelişmeleri araştırıyor. Bu yeni değişiklikler 35 dk elektroforez çalışma süresi, 7 dk kuru emme transfer sistemi ve yüksek çözünürlük, kalite, hassasiyet ve Batı verilerin gelişmiş doğruluğu üretir kızılötesi floresan protein algılama ve görüntüleme ile Bis-Tris jel sistemini kullanır.

Town Batı Hızlı: Klasik Western Blot Analizi Üzerine Bir Çağdaş Büküm

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

the-fastest-western-town-contemporary-twist-on-classic-western-blot

Research

JoVE Journal

Biology

26.9K Görüntüleme.  University of California, San Francisco.  Bu protokol Western Blot analizleri gerçekleştirerek son gelişmeleri araştırıyor. Bu yeni değişiklikler 35 dk elektroforez çalışma süresi, 7 dk kuru emme transfer sistemi ve yüksek çözünürlük, kalite, hassasiyet ve Batı verilerin gelişmiş doğruluğu üretir kızılötesi floresan protein algılama ve görüntüleme ile Bis-Tris jel sistemini kullanır. 

Video: The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Biyoloji

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

Endolenfatik Kanal obliterasyonu endolenfatik hidrops Cerrahi İndüksiyon

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Sorun Giderme Stratejileri Modern Kantitatif Floresan Western Blot A Guide

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Keten Çiçekli-Dip Dönüşüm (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Yüksek Dönüşüm Oranı ile Transgenik progeny&#39;lerinde oluşturmak için

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Dalga boyundaki ve Oksidatif Stres Kırmızı / yakın-kızılötesi ışık Terapisi şiddetler bir Range Etkilerinin Değerlendirilmesi için Yöntemi<em&gt; İn Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

Photoactivatable GFP ile APP Hücre içi Ticareti Görüntüleme

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...