我々は彼らの支援とサポートのためのマクマホン研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。この研究は、NIH / NCI R01 CA176839-01（MM）と制度研究学問的なキャリア開発賞（JSへIRACDA）からの補助金によって支えられている。

1。細胞培養からの全細胞溶解物の調製<ol><li>氷上で細胞培養皿を置き、5mMのEDTA（5 mMのEDTA/10 CM 2プレートとのPBS 例えば 5ml）で冷PBSを追加します。セルスクレーパーを用いて皿から接着細胞を除去した後、冷たい15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li> 4℃で5分間1,000 rpmで（230×g）で低速遠心分離により細胞懸濁液をペレット氷の上に円錐形のチューブをセットし、慎重にペレットを中断することなく、上清を吸引除去する。 </li><li> 5mMのEDTAを含むPBS 1mlでペレットを洗浄し、冷たい1.5ミリリットル遠心チューブに細胞懸濁液を移す。細胞をペレットに10秒間、13,000 rpmで（13226×g）でクイックスピンサスペンション。慎重に氷上でペレットと場所のチューブを中断せずに上清を除去します。 </li><li>で、（ つまり、3×10 6個の細胞のためのRIPA緩衝液の〜150μLを加えペレットサイズに応じて）25〜200μL中でペレットを再懸濁RIPA緩衝液（50mMトリス、150mMのNaCl、0.5mMのEDTA、10mMのNaFを、0.1％SDS、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1％NP-40）2×最終濃度で新たに追加されたプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む。簡単に言えば、各チューブをボルテックスし、氷上で20〜30分のために停止をインキュベートする。注：タンパク質およびそれらの変性界面活性剤（ すなわち、SDS、トリトンX-100、またはNP-40）の強度を可溶化する能力が異なるタンパク質を抽出するために使用できるいくつかの溶解緩衝液が存在する。 RIPA緩衝液は、全細胞溶解物を調製し、タンパク質 - タンパク質相互作用を破壊するために有用である。 </li><li> 4℃で5分間14,000 rpmで（15339×g）で、ポスト核分画、遠心溶解物を作成するには氷の上で核濃縮ペレットと場所のチューブを中断することなく、新しいチューブに上清を移します。注：上清を抽出しながら、核濃縮ペレットを、チューブから切り離すことがあります。核に富んだペレットを集めないようにするには、私が直接ピペットチップを配置粘性の核に富んだペレットNTO、それを処分するために、ピペットでそれを描画します。 </li><li> BCA又はブラッドフォードなどのタンパク質定量アッセイを使用して製造業者の指示に従って、各サンプルのタンパク質濃度を決定する。 </li></ol> 2。サンプルの調製および電気泳動<ol><li>以下に概略次の表に従って各サンプルを準備します。代替として、β-メルカプトエタノールはまた、2.5％の最終濃度で使用することができる。しかし、還元剤は、ゲルをロードする前に、各サンプル時間までに添加されるべきである。ウェルあたりロードされた各調製した試料のわずか20μlのピペット操作のバリエーションの合計容量を占めています。 <table border="1"><tbody><tr><td>試薬</td><td>減少したサンプル</td></tr><tr><td>タンパク質試料</td><td> XμL </td></tr><tr><td> 4X LDSサンプルバッファー</td><td> 6μL </td></tr><tr><td> 500 nMのDTTレッドucingエージェント</td><td> 2.4μL </td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td>最大15.6μL </td></tr><tr><td>全容積</td><td> 24μL </td></tr></tbody></table></li><li> 10分間、70°Cでの加熱試料。サンプルが加熱している間、（50ミリリットルの20倍のMESまたはMOPSランニングバッファーを加えた950ミリリットルの脱イオン水）をランニングバッファー1X MESまたはMOPSの千ミリリットルを用意。 MESがバッファを実行すると、ランニングバッファーMESが速くMOPS 4よりも実行することができます低いpKaを持つ2〜200 kDaの間のより小さな分子量のタンパク質を解決するのに対し、MOPSランニングバッファーは、14から200 kDaの間の中間サイズのタンパク質を解決します。従って、これら2つのバッファがタンパク質バンド4の分離の違いにつながるスタッキングゲル内のイオンの移動に影響を対比している。取っておくと酸化防止剤の500μlのランニングバッファー1X MESまたはMOPSの200ミリリットルを組み合わせ、最小の上部バッファー商工を埋めるために使用されるI細胞電気泳動装置。 </li><li>サンプルは、氷の上にそれらを配置する前に加熱、クイックスピンサンプルを完了したら。 </li><li>電気泳動用ミニ電池ユニットへのプレキャストBis-Trisゲルの組み立てについては、製造元の指示に従ってください。注：各ゲルは各ゲルの短い（小さい）カセットをバッファコアに向かって内側に面しており、ゲルはレベルであり、しっかりと上部バッファーチャンバーからの漏れを回避するためのバッファコアに押し付けるようなやり方で配向されていることを確認してください。 </li><li> 1X MESや抗酸化剤および1X MESまたはMOPSランニングバッファーを約600ミリリットルとミニセルユニットの下部バッファ商工を含むMOPSランニングバッファー200mlで上部バッファーチャンバーを埋める。ランニング緩衝液の余分200〜300ミリリットル、後で使用するために保存することができる。しかし、緩衝液のpHと品質が変更することができるように、電気泳動の実行中に使用されるバッファを再利用することは推奨されません。 </li><li>ロード各タンパク質SAMP20μlのルの各ウェルに。複数の抗体（ すなわち 2つ以上）を探るために、種々のストリップに膜を区画した場合、それは非常にこれはとなるように各ゲルの最初と最後のウェル中予備染色タンパク質標準の2-5μLをロードすることをお勧めしますタンパク質バンドの画像化に影響を与えることなく、膜の異なる部分を分離するための切断ガイド。 </li><li>最後にスタートし、ゲルあたり70〜80ミリアンペアで110〜125ミリアンペア/ゲルの期待される電流で35分間200 V一定にゲルを実行します。追跡用色素がバッファコアに沿って白金線に移行するときに電気泳動が完了します。 </li></ol> 3。 iBlotドライブロッティングシステムを用いたタンパク質導入<ol><li>完全に（これはパチパチノイズが発生する場合があります）、カセットの結合した側面を破ってミニゲルを分離する。短い（小さい）プレートを捨て、慎重に脱イオン水で容器に長い（マイナス）プレートからゲルを転送し、底部にあるゲルの厚い足の部分を削除します。注：まれに、ゲルは長い短いプレートの代わりに取り付けることができる、プレートスロット付き。この場合は、より長い、溝付きプレートを破棄し、一番下にあり、ゲルの厚い足の部分を削除します。その後、慎重に脱イオン水に短いプレートからゲルを移す。 </li><li>製造業者の指示に従って、アノードとカソード転写スタックを組み立てる。注：両方のニトロセルロースまたはPVDF膜は、タンパク質の高品質かつ効率的な転送を提供し、蛍光検出8と互換性があります。しかし、PVDF膜は、ニトロセルロースよりも高い結合容量（240μgの/ cm 3）と （200μgの個/ cm 3）8を持っています。 </li><li>慎重にこれを転送中にタンパク質バンドの歪みを防ぐことができますようにゲルと膜の間に閉じ込められた気泡や空気を除去。注：膜または変圧トリムしない小胞体これは、アノードとカソードのスタックとの間の直接的な接触を引き起こすとしてゲルサイズに合わせてスタック。 </li><li>正しく転送を組み立てた後、ドライブロッティング装置上にスタック、適切な電圧プログラムを選択します（ つまり、プログラム3：7分20 V）を、転送を開始します。注意：150 kDaのより大きいタンパク質は、よりゆっくりと移動する傾向があり、8月10日分の長い転送時間が必要な場合があります。また、5〜10分間、20％エタノール中のゲルのインキュベーション前は、これらの大きなタンパク質の転写効率を向上させることができます。転送プログラムが完了すると、デバイスは自動的に電流を遮断します。それはすぐに膜を除去し、より良いタンパク質の検出を確実にし、膜を乾燥を避けるためにブロック化手順を続行することをお勧めします。 </li></ol> 4。赤外蛍光タンパク質検出<ol><li> 1時間ブロッキングバッファーオデッセイ（トゥイーン20を追加しないでください）の0.8ミリリットル/ cm 2の最小のブロック膜（S）または4℃で一晩膜（単数または複数）はまた、しかし、これはより高いバックグラウンドを生じ、タンパク質の検出を妨害し得る、無脂肪乾燥ミルクでブロックすることができる。 </li><li> 4℃で一晩、0.1％Tween-20をOdysseyブロッキング緩衝液中の所望の濃度で一次抗体にメンブレン（複数可）をインキュベート二つの異なる抗原が同じブロット上で可視化した二色検出のための二次抗体は、異なる宿主種に由来しなければならず、膜（単数または複数）に同時に添加した。注：前の一次抗体で膜（複数可）をインキュベートし、膜（s）は同じ膜上に複数の抗体（ すなわち 2つ以上）のためにプローブするために、種々の小片に区分され得る。 </li><li>穏やかに振盪しながら、TBS中で10分間メンブレン（S）3X +0.1％のTween-20を洗ってください。 </li><li> Odysse 800 nmのチャネルのために700 nmのチャネルのために1:20,000の希釈で蛍光標識した二次抗体を用いた膜（複数可）をインキュベートし、1:6,000-1:10,000yが（より長い1時間膜（複数可）をインキュベートすると、バックグラウンドを増加させることができる）、30〜60分間、0.1％Tween-20でブロッキングバッファー。光から膜（複数可）を保護します。注：二次抗体が一次抗体のそれぞれと同じ宿主種に由来し、異なる蛍光体で標識される必要がある。 </li><li>穏やかに振盪しながら、TBS中で10分間メンブレン（S）3X +0.1％のTween-20を洗ってください。光から膜（複数可）を保護します。 </li><li>スキャンされ、赤外線イメージングシステムで画像化されるまで、膜（単数または複数）Tween-20で4℃にてずに乾燥又はTBSまたはPBSのいずれかに格納されてもよい。適切に遮光している場合、蛍光シグナルは、数ヶ月間安定したままになります。 </li></ol>

<ol>
	<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling.">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li><li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support.">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBlot+Dry+Blotting+System.">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blot+Analysis.">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030.">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li><li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Milk+Composition.">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li><li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes.">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルによれば、高品質の定量的なウエスタンブロットを生成する際の重要なステップは以下の通りである：1）タンパク質濃度を測定するステップと、2）試料調製、3）膜をブロッキングし、4）一次抗体の品質および口径。 総タンパク質濃度の測定精度は、赤外蛍光検出の感度は例外的なサンプルのタンパク質濃度で検出されたわずかな違いを増幅するので、?...

<html>ウエスタンブロッティングの技術は最初の抗体1-3を使用してタンパク質を検出するためのより良い方法を作成するために、1977年と1979年の間に開発されました。この手順では、二次抗体を用いて可視化し、オートラジオグラフィー、UV光、又はペルオキシダーゼ反応生成物3により検出された標的タンパク質とSDS-PAGEゲルからメンブレンへのタンパク質の電気泳動転写を利用した。したがって、これらの同じ基本原理が依然として広く、今日のウエスタンブロットプロトコルで使用される。しかし、この古典的なウェスタンブロッティング技術は、低速の電気泳動の実行時 ​​間、低い解像度と人工タンパク質バンド、タンパク質分解に対する感受性、および限定された感度だけでなく、データ品質4として存在する多くの欠点を行います。したがって、このプロトコルは、より正確な定性および定量的データを生成し、標準的なウェスタンブロット手順に大きな進歩と改善について説明します。 &quot;&gt; SDS-PAGEを用いてタンパク質の広い範囲を分離するためのLaemmliシステムがこのウェスタンブロッティングシステムの人気にもかかわらず。ウェスタンブロッティング5に最も広く使用されているゲルシステムであり、この方法は、バンド歪み、解像度の損失、およびもたらし得るこれは、分離ゲルの高pH（9.5）に起因するタンパク質の脱アミノ化およびアルキル化の結果、ゲルの様々な酸化還元状態による減少ジスルフィド結合の再酸化、およびアスパ-プロリルの切断であるスプリアスバンド4。 Laemmli緩衝液（pH 5.2）、4,6タンパク質を加熱することによるペプチド結合、中性pH（7.0）で動作Lamemmliシステムよりも有意な利点を提供するのBis-Trisゲルシステム、このシステムは、タンパク質安定性、最小限を改善するタンパク質修飾は、その縮小状態でタンパク質を維持する電気泳動中アスパルチル-プロリル切断を防止し、より重要なことに、電気泳動実行時 ​​間tは、さらに35分間4,6,7ある彼のBis-Trisゲルシステムはまた、シャープなバンドは、高解像度化、分離、およびより信頼性の高いデータが得られる増大した感度を生成する4。 ビス-Trisゲルシステムと共に、iBlotドライブロッティングシステムは、著しく7分以内膜上にゲルからのタンパク質の転送時間を減らすために高い電界強度および電流を使用する。この搬送システムは、タンパク質8のより効率的で信頼性の高い転写を生成するドライブロッティング法に基づいている。従来の転写システムにiBlot転送システムの有効性の詳細な比較については、次のWebサイトを参照してください。 <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application</a>s/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html .これは、イオンリザーバ8として作用する適切な転写緩衝液を含有するゲルマトリックスから構成され、アノードとカソードのスタックを利用する。転送中に、水の電気分解は、バンド8歪みを引き起こすことなく、より一貫性のタンパク質転写を生じる銅アノードからの酸素の発生を防止するのに役立つ。また、この転写システムはまた、電極8間の距離を減少させることによって転送速度を増加させる。 化学発光ウェスタンブロットのタンパク質検出のための最も一般的かつ伝統的な技法であるが解析し、二色赤外蛍光検出感度が大きく、品質、およびウェスタンブロットデータの精度を向上させることができる。この検出方法は、2つの最適な波長700nmの赤外線レーザー励起を使用しておよび800 nmの最大の信号対雑音比及び最高感度9鮮明な画像データを生成する。従って、2つの標的タンパク質は700 nmおよび800 nmの蛍光検出チャネルを使用して、同じ膜上で同時に可視化することができる。より重要なことには、赤外蛍光の線形性およびダイナミックレンジは強弱両方のタンパク質バンド9の正確な定量分析を可能にする。さらに、このプロトコルは、これらのプロセスの有効性を損なう、より大きな定性的および定量的ウェスタンブロットデータを生成するために赤外蛍光タンパク質検出を利用せずにこの実験の電気泳動および転写回数を減少させることによって、古典的なウェスタンブロッティング技術を超える多大な利点および改善を提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:297px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:204px;">Thermo Scientific/Pierce</td>
			<td style="width:123px;">23225</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">4x NuPAGE&#174; LDS Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10x NuPAGE&#174; Sample Reducing Agent&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0002</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MOPS SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NuPAGE&#174; Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0335BOX</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0336BOX</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SeeBlue&#174; Plus2 Pre-Stained Standard&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">XCell SureLock&#174; Mini-Cell&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, PVDF Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, Nitrocellulose Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, Nitrocellulose Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Gel Transfer Device&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2228</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-BIM (S69)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total BIM</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>1036-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total ERK1/2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9107</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Blocking Buffer&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-40000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-32211&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68020&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Western Incubation Box, Medium&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>929-97205&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Classic Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Application Software V3.0.30</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis

もともと1970年代後半に設立されたウエスタンブロット法はまだ積極的に、今日利用されている。しかし、ウエスタンブロッティングのこの伝統的な方法は、低品質の解像度、スプリアスバンド、感度が低下し、貧困層のタンパク質の完全性を含むいくつかの欠点がある。最近の進歩は、劇的に高い定性的および定量的データを生成するために標準的なウェスタンブロットプロトコルの多くの側面を改善している。ビス - トリスゲルシステム、従来のLaemmliシステムに代わるものは、良好なタンパク質の分離及び解像度を生成し、タンパク質の完全性を維持し、35分の実行時間電気泳動を低減する。また、iBlotドライブロッティングシステムは、飛躍的に多くの場合、長い転送時間でより多くの非効率的であり、従来のタンパク質導入の方法とは対照的である7分、内膜へのタンパク質導入の有効性と速度を向上させます。これらの非常に革新的な改良、タンパク質Dと組み合わせて、化学発光の標準的なウェスタンブロッティング技術と比較して、より高品質、より正確で一貫性のあるデータにおける赤外蛍光イメージング結果を用いてetection。この技術は、同時に異なる蛍光チャネルで可視化された二色近赤外色素を利用して同じ膜上の2つの異なる抗原を検出することができる。さらに、蛍光イメージングの直線性と広いダイナミックレンジは強弱両方のタンパク質バンドの正確な定量が可能になります。したがって、このプロトコルは、大きく、この実験の実行時間を低減しつつ、これらの進歩は著しく、データの質を向上する古典的なウェスタンブロッティング法、カギ改良を記載している。

二色赤外蛍光感度が向上し、鮮明ウェスタンブロット画像を生成するために最高の信号対雑音比と同じ膜上に強弱両方のバンドを検出する。 700 nmおよび800 nmの蛍光チャンネルの両方において可視化二色ウェスタンブロット検出によって生成された典型的な結果を図1および図2に例示されている。 図1の最上段のウェスタンブロットは、ヒト由来の溶解物?...

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The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

このプロトコルは、ウエスタンブロット分析を行う上での最新の進歩を探る。これらの新規な修飾は、35分間の電気泳動の実行時間を7分乾燥ブロッティング転送システムのBis-Trisゲルシステムを採用して、高解像度、品質、感度、およびウエスタンのデータの精度向上を発生する赤外蛍光タンパク質検出およびイメージング。

町の西部最速：クラシックウェスタンブロット分析に現代風にアレンジ

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

the-fastest-western-town-contemporary-twist-on-classic-western-blot

Research

JoVE Journal

Biology

27.0K ビュー.  University of California, San Francisco. このプロトコルは、ウエスタンブロット分析を行う上での最新の進歩を探る。これらの新規な修飾は、35分間の電気泳動の実行時間を7分乾燥ブロッティング転送システムのBis-Trisゲルシステムを採用して、高解像度、品質、感度、およびウエスタンのデータの精度向上を発生する赤外蛍光タンパク質検出およびイメージング。 

ビデオ: The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

西洋は、Invitrogen NuPage NOVEXビストリスミニゲルを用いたウェスタンブロット

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

生物学

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

内リンパ管の閉塞による内リンパ水腫の外科的誘導

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

イメージングおよび胚ゼブラフィッシュにおける脳血管構造物の3次元再構成

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

生殖様細胞に新生マウス皮膚由来幹細胞の分化<em&gt;インビトロ</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

トラブルシューティングの方法と現代の定量的蛍光ウェスタンブロッティングへのガイド

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

亜麻の花-DIP変換（<em&gt;アマ</em&gt;）高転換率のトランスジェニック子孫を生成するために、

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

酸化ストレスに赤/近赤外光療法の波長および強度の範囲の効果の評価のための手法<em&gt;インビトロ</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

光活性化GFPでAPPの細胞内輸送をイメージング

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...