Los autores desean agradecer a FI Ataullakhanov para ayudar a diseñar y fabricar cámaras de flujo reutilizables, N. Dashkevich, N. y A. Gudimchuk Korbalev para proporcionar imágenes de figuras, N. y P. Gudimchuk Zakharov para el desarrollo de un protocolo y proporcionar reactivos para preparar semillas microtúbulos marcadas con digoxigenina, A. Potapenko para obtener ayuda con la edición de texto y otros miembros del laboratorio Grishchuk para consejos y discusiones. Esta obra fue financiada en parte por subvención NIH R01 GM-098389 y una subvención piloto de Pennsylvania Muscle Instituto de ELG, que es un Kimmel Scholar, por RFBR ofrece 12-04-00111-A, 13-04-40190-H y 13 -04-40188-H, Academia Rusa de Ciencias del Presidium de Subvenciones (Mecanismos de Sistemas Molecular Integración y programas de Biología Celular Molecular y Moleculares) a FI Ataullakhanov, NIH subvención GM R01 GM033787 a JR McIntosh, y una beca postdoctoral de la Fundación Dinastía Zimin Dmitry al VAV

Los autores no tienen nada que revelar.

Muchos ensayos de una sola molécula hoy en día utilizan habitualmente cubreobjetos especialmente tratadas para reducir drásticamente la adherencia no específica de proteínas. El procedimiento se describe aquí es una modificación del protocolo original desarrollado en Howard laboratorio 32, y nos encontramos con que silanizar los cubreobjetos es bien vale la pena el esfuerzo, incluso con ensayos de cuentas basados ​​en la DIC, que no utilizan la fluorescencia. Cámaras ensambladas con tales cubreobj...

Los microtúbulos son altamente conservadas estructuras citoesqueléticas que son importantes para la arquitectura celular, la motilidad celular, la división celular, y el transporte intracelular 1. Estos polímeros dinámicos se ensamblan a partir de tubulina en presencia de GTP, y cambian de forma espontánea entre el crecimiento y acortamiento 2. Los microtúbulos son muy delgado (sólo 25 nm de diámetro), por lo tanto las técnicas ópticas especiales para incrementar el contraste debe ser utilizado para observar los microtúbulos con un microscopio óptico. El trabajo previo con estos polímeros examinó su comportamiento dinámico mediante contraste de interferencia diferencial (DIC) 3. Este y otros estudios in vitro revelaron que en condiciones típicas experimentales, los microtúbulos se someten a la catástrofe y cambie a la despolimerización sólo en raras ocasiones, una vez cada 5-15 minutos (esta frecuencia es de 7-15 concentración de tubulina soluble mM examinada en 28-32 ° C ) 4. Así, se han propuesto diferentes técnicas para la induccióne microtúbulos despolimerización de una manera controlada. Acortamiento de microtúbulos puede ser activado mediante el lavado de distancia tubulina soluble en 5,6, corte microtúbulos con un haz de láser 7, o el uso de los microtúbulos segmentados 8, tal como se describe aquí. El trabajo previo utilizando los microtúbulos segmentados, así como polímeros de conmutación estocásticamente, se ha encontrado que pequeñas cargas intracelulares, tales como cromosomas, vesículas, y perlas de proteína recubiertos, se pueden mover en los extremos de los microtúbulos acortamiento 9-13. Este fenómeno se cree que tiene una implicación directa de los movimientos de los cromosomas en las células mitóticas, y los mecanismos subyacentes están actualmente bajo investigación activa 14-16. Recientemente, las técnicas a base de fluorescentes, incluyendo la reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) microscopía, se han empleado para estudiar la motilidad con microtúbulos dinámicos extremos 17-24. La ventaja de este enfoque es que permite el examen de la interaccións entre los microtúbulos y proteínas de unión a microtúbulos en tiempo real utilizando proteínas marcadas con diferentes fluoróforos. Se encontraron varios complejos de proteínas para mover processively con el alargamiento y / o acortamiento de los extremos de los microtúbulos. Ellos incluyen las proteínas asociadas a los microtúbulos Dam1 10,12,18, Ska1 19, y XMAP215 20, así como motores de quinesina Kif18A 21,22, MCAK 23 y CENP-E 24. Estas proteínas exhiben processive punta-de seguimiento, que es fundamentalmente diferente de la de las proteínas de punta de seguimiento de clásicos como EB1 25. Aunque las moléculas EB1 y los socios parecen permanecer de manera estable asociada a los microtúbulos dinámica termina, las moléculas individuales permanecen atados a la punta de los microtúbulos por sólo ~ 0,8 seg, intercambiar rápidamente con la piscina soluble 26. Por el contrario, procesivas punta-trackers, como Dam1, viajan con los microtúbulos termina para muchos micras, y su asociación con las puntas de los microtúbulos pueden durar mningún segundo. La punta tiempo asociación, así como el que resulte de seguimiento, depende en gran medida del número de moléculas que forman la punta de rastreo complejo 27. Grandes conjuntos de proteínas suelen ser mucho mejores de punta-trackers. Por ejemplo, dichos ensamblajes complejos como los cinetocoros de levadura aisladas pueden permanecer acoplado a microtúbulos termina por hora 28. Algunas proteínas de unión a microtúbulos, por ejemplo Ndc80 complejo de proteínas cinetocoro, se han encontrado para ser incapaces de realizar un seguimiento con microtúbulos termina en un solo nivel de molécula, sin embargo Ndc80 es muy eficiente en el acoplamiento del movimiento del talón de carga 19,29-31. Por lo tanto, para entender el mecanismo de la punta de seguimiento por diferentes complejos de proteínas, así como sus funciones biológicas, es importante examinar la punta de seguimiento como una función del número de moléculas en el complejo punta de seguimiento, así como para determinar la capacidad de estos complejos para exhibir la motilidad colectiva en la superficie de la carga de talón. (Figura 1A). En primer lugar, los portaobjetos de vidrio disponibles comercialmente son modificados para unir tubos de polietileno corto (Protocolo 1). La cámara de flujo microscopía reutilizable se ensambla a partir de una diapositiva tal y el plasma-limpiado y cubreobjetos silanizada (protocolo 2) 32-34 químicamente o. El volumen de la cámara resultante es sólo 20-25 l (o tan pequeño como 15 l, véase la nota 3 en el Protocolo 1), incluyendo el volumen de la tubería de entrada. Cámaras de flujo disponibles comercialmente también se pueden usar, pero su volumen es generalmente más grande, que conduce a la pérdida innecesaria de proteínas. Si se emplea una cámara más grande, el volumen de todas las soluciones en los protocolos a continuación debe ser escalado proporcionalmente. Semillas de microtúbulos continuación, se preparan, por ejemplo, usando GTP analógico lentamente hidrolizable, GMPCPP (guanosina-5&#39;-[(α, β)-methyleno] trifosfato) (Protocolo 3, ver también Hyman &lt;em&gt; et al. 35). Las semillas se inmovilizan sobre un cubreobjetos de limpiado y la superficie es posteriormente bloqueando los comandos para prevenir la absorción no específica de otras proteínas 32 ​​(protocolo de 4 describe semillas inmovilización utilizando digoxigenina). Los microtúbulos segmentados pueden ser preparados usando el Protocolo 5. La razón principal de este enfoque es que los polímeros de microtúbulos dinámicos, que se forman en presencia de GTP, se pueden estabilizar temporalmente mediante la adición de los cortos &quot;topes&quot; de segmentos de tubulina estables, que contienen GMPCPP. Estas tapas también contienen tubulina marcada con rodamina, para que puedan ser retirados simplemente iluminando el campo de visión con un láser de 530-550 nm o lámpara de arco de mercurio (Protocolo 6) 36. La intensidad de fluorescencia de la señal de la punta de seguimiento se puede usar entonces para estimar el número de moléculas que se desplazan con los extremos de los microtúbulos desmontaje, teniendo en cuenta la falta de uniformidad de la iluminación de campo del microscopio (Protocolo 7). Un enfoque similar se puede utilizarpara estudiar las interacciones entre los microtúbulos depolymerizing y perlas de proteína-revestido, preparado como se describe en el 27 (Protocolo de 8). Algunas proteínas se unen fácilmente a las paredes de los microtúbulos segmentados, pero pinzas láser también pueden utilizarse para sostener el cordón cerca de la pared de microtúbulos, promoviendo así su unión.

<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 1: Microscopy and other equipment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>Axio Imager 2 
			Eclipse Ti</td>
			<td>other microscope models capable of DIC and epi-fluorescence-imaging can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Zeiss 
			Nikon</td>
			<td>420490-9900-000 
			CFI Apo 100x Oil 1.49</td>
			<td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective heater</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>150803, 150819-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49004 or 49008 
			41017 or 49020</td>
			<td>optimized for Rhodamine fluorescence&#160; 
			optimized for GFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>freeware MicroManager 
			Molecular Devices</td>
			<td>not applicable 
			MetaMorph 7.5</td>
			<td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 
			other software can be used to acquire images and for a particle tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td>
			<td>Highly sensitive EMCCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trapping laser</td>
			<td>IPG Photonics</td>
			<td>YLR-10-1064-LP</td>
			<td>1064 nm laser, 10 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence excitation lasers</td>
			<td>Coherent, Inc. 
			Coherent, Inc.</td>
			<td>Sapphire 488 LP 
			Sapphire 552 LP</td>
			<td>excitation of green fluorophores 
			excitation of red fluorophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial flow chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-20 or RC-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole Palmer 
			Harvard Apparatus</td>
			<td>Masterflex 77120-52 
			Pico Plus</td>
			<td>Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2: Microscopy chamber preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified microscope slides for reusable chambers</td>
			<td>Precision Glassblowing of Colorado</td>
			<td>Custom order www.precisionglassblowing.com</td>
			<td>Sonic slots in slides using schematics in Figure 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427410</td>
			<td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tubing</td>
			<td>Intramedic</td>
			<td>427400</td>
			<td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Other similar slides can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-150, 48366-067</td>
			<td>Other similar coverslips can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon sealant</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>83082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Scotch 3M</td>
			<td>AD114</td>
			<td>Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 3: Coverslips cleaning and coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Sieves, Grade 564</td>
			<td>Macron</td>
			<td>4490-04</td>
			<td width="200px"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Jar</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>21036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Ceramic Holder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542e40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne Repel Silane</td>
			<td>GE Healthcare Biosciences</td>
			<td>17-1332-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin AB</td>
			<td>Roche applied science</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table>
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 4: Preparation of seeds and segmented microtubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin</td>
			<td>purified from cow brains 
			Cytoskeleton, Inc</td>
			<td>&#160; 
			T238P</td>
			<td>For purification protocols see 49&#8211;51 
			Unlabeled porcine tubulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeled tubulin</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc 
			Invitrogen 
			Invitrogen</td>
			<td>TL590M 
			C1171 (Rhodamine) 
			A-2952 (Digoxigenin)</td>
			<td>Rhodamine-labeled porcine tubulin 
			Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jena Biosciences</td>
			<td>NU-405</td>
			<td>Aliquot and store at -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VALAP</td>
			<td>vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass</td>
			<td></td>
			<td>see ref. 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of segmented microtubules to study motions driven by the disassembling microtubule ends

Despolimerización de microtúbulos puede proporcionar la fuerza para el transporte de diferentes complejos de proteínas y los granos proteicos recubierto in vitro. Los mecanismos subyacentes se cree que desempeñan un papel vital en los movimientos de los cromosomas microtúbulos dependientes durante la división celular, pero las proteínas correspondientes y sus funciones exactas están mal definidos. Por lo tanto, hay una necesidad creciente de desarrollar ensayos con el que estudiar tales motilidad in vitro utilizando componentes purificados y medio bioquímica definida. Los microtúbulos, sin embargo, son inherentemente inestables polímeros; su conmutación entre el crecimiento y acortamiento es estocástico y difícil de controlar. Los protocolos que describimos aquí se aprovechan de los microtúbulos segmentados que se hacen con el fotoescindible estabilizar tapas. La despolimerización de microtúbulos tales segmentados se puede activar con alta resolución temporal y espacial, ayudando así a los estudios de la motilidad en los extremos de los microtúbulos desmontaje. Esta técnica se puede utilizar para CArry a cabo un análisis cuantitativo del número de moléculas en los complejos de proteínas marcadas con fluorescencia, que se mueven processively con los extremos de los microtúbulos dinámica. Para optimizar una relación señal-ruido en este y otros ensayos fluorescentes cuantitativos, cubreobjetos deben ser tratados para reducir la absorción no específica de proteínas marcadas fluorescentemente-solubles. Protocolos detallados se proporcionan a tener en cuenta la falta de uniformidad de la iluminación fluorescente, y determinar la intensidad de un solo fluoróforo utilizando ajuste gaussiano equidistantes. Por último, se describe el uso de los microtúbulos segmentados para estudiar los movimientos de los microtúbulos dependientes de las microperlas de proteína-revestido, proporcionando conocimientos sobre la capacidad de las diferentes proteínas motoras y no motoras para acoplar la despolimerización de microtúbulos al movimiento de carga processive.

Proteína seguimiento con depolymerizing microtúbulos termina. Cinetocoro levadura componente Dam1 es, con mucho, el mejor consejo-tracker de los microtúbulos depolymerizing termina 14. Este complejo de 10 subunidad marcada con GFP se puede expresar fácilmente y se purifica a partir de células bacterianas 18,38, por lo que recomendamos su uso como un control positivo para el ensayo de la punta de seguimiento. Una proteína fluorescente que rastrea con el extremo despolimerizaci...

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Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Los microtúbulos son polímeros inherentemente inestables, y su conmutación entre el crecimiento y acortamiento es estocástico y difícil de controlar. Aquí se describen los protocolos que utilizan microtúbulos segmentados con tapones estabilizadores fotoescindible. La despolimerización de los microtúbulos segmentados puede ser activado con una alta resolución temporal y espacial, ayudando de este modo el análisis de los movimientos con los extremos de los microtúbulos desmontaje.

Preparación de segmentados microtúbulos para estudiar las mociones impulsadas por las que desmontan microtúbulos Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

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14.3K vistas.  Russian Academy of Sciences.  Los microtúbulos son polímeros inherentemente inestables, y su conmutación entre el crecimiento y acortamiento es estocástico y difícil de controlar. Aquí se describen los protocolos que utilizan microtúbulos segmentados con tapones estabilizadores fotoescindible. La despolimerización de los microtúbulos segmentados puede ser activado con una alta resolución temporal y espacial, ayudando de este modo el análisis de los movimientos con los extremos de los micro...