1. Generación de X. tropicalis Huevos Todas las ranas Xenopus tropicalis se ordenan de NASCO. Nuestros ranas se encuentran en un hábitat acuático sistema de recirculación de agua mantiene a 27 ° C. Hay muchas opciones para los sistemas de agua para el cuidado de X. tropicalis. buena información general sobre esta especie de rana se puede encontrar en los sitios web de los laboratorios de Harland y Grainger ( <a href="http://tropicalis.berkeley.edu/home/" target="_blank">http://tropicalis.berkeley.edu/home/</a> , <a href="http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis/" target="_blank">http://www.faculty.virginia.edu/xtropicalis /</a> ). Nuestros ranas se mantienen en tankwater que consiste en (0,4 g ciclid Lake sales, 0,6 g de sal marina, 0,625 g de NaHCO3 por litro de agua, pH 7,0) 20. Esta receta resulta en una conductividad de ~ 1800 mS, que es una alta salinidad para X. tropicalis. Sin embargo, hemos encontrado que nuestras ranas prosperan en thise mejora s medio ambiente y la calidad de los ovocitos. Recetas alternativas tankwater se encuentran arriba en la lista de recursos para el general X. cuidado tropicalis. <ol><li> Las ranas se inyectan con gonadotropina coriónica humana (hCG) en tres días sucesivos para estimular la puesta de huevos: En primer lugar, preparar dos concentraciones de la solución de hCG. Resuspender 10.000 U de hCG en polvo liofilizado en 10 ml estéril, desionizada H 2 O para una concentración final de 1,000 U / ml. A continuación, se diluye 1 ml de 1,000 U / ml de solución de hCG en 9 ml de H2O para una concentración final de 100 U / ml. Guarde ambas soluciones a 4 ° C. </li><li> El día 1, preparar 4-6 ranas para la puesta de huevos mediante la inyección de hCG entre 2:00-15:00. Inyectar cada rana en el saco linfático dorsal cerca de la cloaca con 0,2 ml de 100 U / ml de solución de hCG. Tener las ranas rápido durante los siguientes dos inyecciones reducirá al mínimo la cantidad de residuos rana presente durante la puesta de huevos, pero es opcional. </li><li> El día 2, inyectar las mismas ranascon 0,2 ml de 100 U / ml de solución de hCG entre 2:00-15:00. </li><li> En el día 3, inyectar las mismas ranas con 0,2 ml de 1,000 U / ml de solución de hCG, entre 07:00-10 a.m.. Configurar las ranas a poner huevos: llenar un cubo de plástico de 6 cuartos con tankwater fresca, agregue las ranas y el lugar en la oscuridad a 25 ° C. Después de esta inyección, la puesta de huevos comenzará después de 4 horas y se completará a 7 h. Las ranas deben poner los huevos en un entorno que se mantiene a un mínimo de 25 ° C. </li><li> Asegúrese de extraer soluciones y tener el equipo listo inmediatamente antes de recoger los huevos. </li></ol> 20X MMR: HEPES 100 mM, pH 7,8, 2 mM EDTA pH 7,8, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 40 mM CaCl 2. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente. Preparar 1 l de 1X MMR justo antes de extraer la preparación. XB 10X: HEPES 100 mM, pH 7,7, 10 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2, KCl 1 M, sacarosa 500 mM. Autoclave y almacenar a 4 ° C. Preparar 1 litro de 1X XB just antes de extraer la preparación. Solución Dejelly: Preparar 250 ml de solución de cisteína 3% en H2O desionizada y el pH a 7,8-8,0 con NaOH 10. Preparar inmediatamente antes de extraer la preparación. CSF-XB: tomar 200 ml de 1X XB y añadir 2 ml 0,5 M EGTA pH 7,7 y 200 l 1 M MgCl 2. Preparar inmediatamente antes de extraer la preparación. CSF-XB +: tomar 50 ml de CSF-XB y añadir 50 l de LPC (10 mg / ml cada población de leupeptina, pepstatina y Chymostatin en DMSO). Añadir 50 l citocalasina D (10 mg / ml en DMSO). Preparar inmediatamente antes de extraer la preparación. Preparar una solución de gelatina al 0,2% en H2O desionizada, microondas para disolver y filtrar esterilizar. Guarde a temperatura ambiente. Reserva 2 Beckman 2 x ½ tubos de ultracentrífuga pulgadas. Prepare dos tubos de centrífuga de fondo redondo de 15 ml de vidrio con 0,5 ml de H 2 O en cada uno para amortiguar elultracentrifugar tubo. Haga Pasteur pulida al fuego pipetas de vidrio. Coloque el extremo fuera de 5 ¾ pulgadas pipetas de vidrio para exponer una abertura amplia, y exponga a las llamas para suavizar la nueva punta de pipeta expuesta. <ol start="6"><li> Preparar un vaso de precipitados de 500 ml de vidrio para el almacenamiento de los huevos por agitación una solución de gelatina al 0,2% a alrededor de recubrir las paredes del vaso de precipitados. Deseche la solución de gelatina de vaso después de su uso. </li><li> Recoger los huevos desde el cubo de plástico utilizado para la colocación de 6-7 horas después de la tercera inyección en el día 3. Si lo desea, apriete suavemente cada rana una vez para obtener los huevos restantes. Lavar los huevos una vez con tankwater y traslado al vaso de 500 ml de vidrio recubierto con una solución de gelatina al 0,2% fresco. </li></ol> 2. Preparación del extracto de X. Huevos tropicalis Todos los pasos de la preparación del extracto se pueden realizar a temperatura ambiente, aproximadamente 25 º C. A lo largo de los lavados, es importante para mantener el huevos sumergida bajo el líquido, de modo que permanecen húmedas. La exposición al aire puede causar que los huevos para escapar de la detención del ciclo celular o lisis. <ol><li> Se decanta tanto tankwater como sea posible mientras se reserva suficiente líquido para mantener los huevos húmedos. Incline el vaso de precipitados que contiene huevos a un lado y añadir a ~ 300 ml de 1X MMR lentamente a la pared del vaso de precipitados, se reduce al mínimo por lo que la agitación física de los huevos. Deje que los huevos se instalan, entonces decantar los residuos que contiene sobrenadante. X. huevos tropicalis son fibrosa en esta etapa, por lo que la eliminación de los huevos activados se realiza después dejellying. Repita el procedimiento para un total de tres lavados 1X MMR. </li><li> Dejelly los huevos. Decantar tanto MMR como sea posible y añadir la mitad de la solución dejelly. Remolino de forma continua durante aproximadamente 5 min. Disolver capas jalea será visible en el sobrenadante después de un par de minutos. Decantar y la solución dejelly restante. Continuar a girar continuamente hasta que los huevos empacan muy bien y todo el Oriente con su polo vegetal (el polocon pigmento blanco) hacia la parte inferior del plato. Decantar rápidamente la solución dejelly tanto como sea posible. Una vez que los huevos se dejellied que son muy sensibles a las manipulaciones mecánicas. </li><li> Añadir con cuidado XB a los huevos. En el primer lavado XB, eliminar los huevos que han escapado MCA detención mediante la eliminación de los huevos lisadas, hinchado, blanco y pseudocleavage. Activado X. huevos tropicalis tienden a establecerse en la parte central superior, a fin de utilizar una pipeta de transferencia de plástico para tirar de ellos hacia fuera. También quite trozos de piel y de los residuos rana. Lavar los huevos de un total de tres veces con 300 ~ ml de solución 1X XB, girando suavemente entre los huevos lavados y que les permite asentarse en el fondo del vaso de precipitados. Al igual que antes, se decanta como la cantidad de cada solución de lavado como sea posible, manteniendo los huevos en húmedo. </li><li> Lavar los huevos dos veces con CSF-XB y decantar. </li><li> Añadir CSF-XB + a los huevos. El uso de un pulido al fuego gelatina tratada con pipeta Pasteur, huevos a tubos ultra-centrífuga de transferencia con CSF-XB +, teniendo cuidado de no exponer el correoSGG al aire. Coloque dentro de los tubos de centrífuga de vidrio de 15 ml con el cojín de agua. </li><li> Haga girar los huevos en una centrífuga clínica a 200 xg durante 1 min, aumentar la velocidad a 800 xg y el giro de 30 seg. </li><li> Utilice un aspirador para eliminar la mayor cantidad posible de tampón huevos. Deben ser casi seco en la parte superior. Mover rápidamente los huevos a una centrífuga Sorvall RC-6 centrífuga equipada con un rotor HB-6 (o equivalente) y girar 17.000 xg durante 15 min a 20 ° C. </li><li> Retire la capa de citoplasma amarillo entre el pigmento y capas de lípidos usando una aguja de calibre 18 unida a una jeringa de 1 ml. Perforar el lado del tubo y tirar del cuerpo de la jeringa lentamente para obtener la capa de extracto citoplasmático. Evite los gránulos de pigmento tanto como sea posible. </li><li> Transferencia citoplasma al nuevo tubo de ultracentrifugación. Es normal que el extracto que aparezca ligeramente nublado en este paso. Lugar dentro del tubo de centrífuga de 15 ml de vidrio con colchón de agua. Girar de nuevo 17.000 xg durante 10 minutos a 20 ° C. Repita extraction con aguja de calibre 18. </li><li> Transferencia citoplasma a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Estimar el volumen de extracto y diluir citocalasina D y LPC 1:1.000 en el extracto. Mezclar bien con una punta de pipeta de 1 ml, pipeta hacia arriba y abajo varias veces sin la introducción de burbujas de aire. Un rendimiento típico de una colonia saludable para las ranas es de aproximadamente 300 a 500 l de extracto / rana. Para preservar la actividad máxima, es necesario almacenar el extracto y realizar manipulaciones experimentales a temperatura ambiente (20-25 ° C). </li></ol> 3. Purificación Taxol estabilizado microtúbulos de X. tropicalis Extract <ol><li> Añadir Taxol a un 100-200 l alícuota de extracto a una concentración final de 10 mM y se incuba a temperatura ambiente durante 30 min. Para las reacciones de control, el tratamiento de un volumen equivalente de extracto con la Nocodazol drogas microtúbulos-destablilzing (10 mM). Reserva de 100 l de extracto sin tratar para el análisis. </li><li> Diluir el tratado con fármacoextraer con 10 volúmenes BRB-80 (TUBOS 80 mM pH 6,8, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA) + 30% de glicerol. Ensamble 14 tubos de polipropileno de fondo redondo ml que contienen 10 ml de BRB-80 + 60% cojín de glicerol. El uso de un gran taladro punta de pipeta, capa de la reacción extracto tratado con fármaco suavemente en la parte superior de la BRB-80 + 60% cojín de glicerol. Centrifugar durante 10 min a 17.000 xg a 20 ° C en una centrífuga Sorvall RC-6 centrífuga equipada con un rotor HB-6 (o equivalente) y adaptadores de tubo. </li><li> Aspirar el material que contiene extracto unsedimented sobrenadante y lavar el interfaz dos veces con H2O desionizada Aspirar el volumen amortiguador restante lentamente, teniendo cuidado de no perturbar el gel pastilla que contiene los microtúbulos, proteínas asociadas a los microtúbulos, y ARN asociadas a los microtúbulos en la muestra tratada con Taxol. La muestra Nocodazol tratado no contiene material visible. Resuspender el precipitado en 1 ml de TRIzol y proceder con las instrucciones del fabricante para el aislamiento de ARN. Untrextracto de eated (hasta 100 l) puede ser directamente resuspendió en 1 ml de TRIzol. </li><li> En la actualidad hay kits disponibles en el mercado para la preparación de bibliotecas transcriptoma adecuados para RNA-seq. Estos pueden ser adquiridos a través <a href="http://www.illumina.com/" target="_blank">http://www.illumina.com/</a> y <a href="http://www.454.com/" target="_blank">http://www.454.com/</a> . </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

En este informe hemos descrito un método sencillo para producir extractos de huevo CSF-detenidos de X. tropicalis 19 y utilizar este extracto para estudiar los ARN asociadas a los microtúbulos 7. El procedimiento básico para la producción de extractos de huevo de CSF-detenidos de X. tropicalis es el mismo que el utilizado para X. laevis con algunas diferencias clave. Uno de los aspectos más difíciles de trabajar con X. ranas tropicalis es la obtención de huevos lo suficientemente alta calidad para hacer un extracto con la nucleación de microtúbulos o actividad conjunto de eje comparable a X. extrae laevis huevo. Para lograr óptimas condiciones de puesta de huevos al tiempo que evita el deslizamiento de la meiosis II detención del ciclo celular, el intervalo entre las inyecciones de la hormona para X. tropicalis es más corta que la utilizada para X. laevis, y la temporización a partir de la tercera inyección de hCG para el inicio de la puesta de huevos también es mucho más corto. Con X. laevis la sincronización de la inyección de hCG para tél comienzo de la puesta de huevos es tal que es conveniente y eficiente para los huevos que se establezcan durante la noche en tampón. Sin embargo, debido al tiempo más corto entre la inyección de hCG y la puesta de huevos con X. tropicalis con frecuencia es necesario para expresar manualmente los huevos de ranas. Otra diferencia significativa entre hacer extracto de huevo de las dos ranas diferentes es el paso dejellying. Con X. laevis los huevos son tan grandes que es fácil de determinar cuando la capa de gelatina se haya disuelto mediante la observación de cómo de cerca se espacian los huevos en el vaso de precipitados. Como la reacción dejellying comienza, los huevos comienzan a acumular más y más denso. Sin embargo, X. huevos tropicalis son mucho más pequeños y puede ser bastante difícil determinar cuándo la capa de gelatina se haya disuelto por el huevo de la densidad de empaquetamiento solo. Hemos encontrado que el método más fiable para determinar cuando la capa de gelatina se haya disuelto es para controlar la orientación del animal (negro) y polos vegetales (blanco). Cuando todo el vegetal polos orient hacia la parte inferior del vaso de precipitados de la capa de gelatina se ha eliminado suficiente para proceder con el extracto. Por último, mientras que X. extracto de huevo laevis se puede almacenar a temperaturas frías (4-12 ° C) se ha observado que es crítico para mantener X. extracto de huevo tropicalis a temperatura ambiente (20-25 ° C) durante la preparación y manipulaciones experimentales para preservar la actividad bioquímica. Debido a las diferencias en la facilidad de uso se prefiere usar X. laevis ranas para la producción de extracto de huevo. Sin embargo, para los experimentos que requieren o son facilitadas por un organismo con un genoma secuenciado, X. tropicalis es un sistema excelente alternativa. El método que hemos descrito en este informe utiliza taxol como un agente estabilizador de microtúbulos para inducir la polimerización de microtúbulos. Elegimos este método porque el taxol es un agente estabilizador de microtúbulos-robusto que facilita el aislamiento a gran escala de los microtúbulos purificada. El método ªpor lo que describimos podría probablemente ser mejorado mediante la comparación de las proteínas y ARN asociados con los microtúbulos mediante métodos alternativos de polimerización de microtúbulos. Alternativas pueden incluir polimerización utilizando polimerización inducida por GTP (una técnica clásica), 22 o el uso de Ran-GTP como un polimerizador microtúbulos para imitar los microtúbulos inducida por conjunto de husillo accionado cromatina-23. Por último, el uso de núcleos de los espermatozoides purificada para inducir la polimerización de microtúbulos sería el más cercano imitan a los tipos de microtúbulos que se nuclean durante la mitosis (centrosoma, la cromatina, y cinetocoro mediada). Los inconvenientes de estas fuentes alternativas de nucleación de microtúbulos son que los agentes de nucleación no son tan fácilmente disponibles como taxol y no lo hacen nucleada o estabilizan los microtúbulos tan eficientemente como el taxol. Por lo tanto, cada uno de estos métodos sería más difícil de utilizar para purificaciones a gran escala. La ventaja de comparar múltiples diferentes tipos de nucleadores microtúbuloses que podría ser posible identificar proteínas y / o ARN que son específicos para cada vía de nucleación de microtúbulos. El método que hemos descrito aquí se aprovecha de los extractos citoplasmáticos de anfibios. Sin embargo, este enfoque podría extenderse a la utilización de sistema de extracción de otros organismos. Extractos mitóticas se han descrito desde sincronizados células de cultivo de tejidos humanos 24 que fielmente recapitular muchos aspectos de ensamblaje de los microtúbulos. Hemos utilizado con éxito estos extractos para identificar los ARN asociadas a los microtúbulos a partir de células HeLa 5. Esquemas de purificación de microtúbulos similares se han descrito para muchos organismos diferentes 25,26, aunque los RNAs asociados microtúbulos no se han examinado. El enfoque descrito aquí podría ser utilizado con cualquier organismo que puede producir un extracto citoplásmico concentrada capaz de nucleación microtúbulos. Por último, aunque el enfoque que deescriba aquí habla de la purificación de los microtúbulos y proteínas asociadas y ARN, este enfoque podría ser generalizado a otras estructuras subcelulares. Mientras que la mayoría de los ARNm localizadas no han sido identificados utilizando métodos bioquímicos los recientes avances en las tecnologías de secuenciación de ADN y ARN que este enfoque sea un método atractivo para identificar los ARN localizados. En este enfoque cualquier estructura subcelular o sub-embrión de interés se puede aislar o purificar. A continuación, las proteínas y ARN asociados se pueden identificar en una amplia escala de genoma. ARN a continuación, se pueden comparar con el contenido de ARN total de células del embrión o para identificar los ARN localizados enriquecidos. Este enfoque podría ser utilizado con los huevos enteros (animales y separación vegetal, similar al enfoque que se identificó el primer ARN localizadas en Xenopus 27), actina RNAs asociados, ARN ER-asociados, ARN mitocondrial asociadas, oa cualquier estructura subcelular que pueden ser purificado con ARN asociados intactas. Basado ennuestro trabajo en el ARN asociada a los microtúbulos que predecir que esto sería un excelente método para descubrir nuevas proteínas que funcionan en una ubicación determinada. Por otra parte, la identificación de la localización y extensión de todos los ARN localizadas proporcionará información sobre cómo las células y embriones utilizan localización del mRNA para controlar la expresión génica.

El control espacial y temporal de la expresión de genes es importante para todas las células, y es especialmente importante para el control de los primeros embrionario golpeteo 1. El control espacial de la expresión génica se consigue a través de la localización activa de los ARNm a destinos específicos dentro de las células o embriones. En muchos tipos de células muy grandes, (por ejemplo, oocitos, embriones, y las neuronas) la localización del mRNA se utiliza para restringir la expresión de la proteína con el sitio de acción de la proteína codificada. Desde un ARNm localizada puede catalizar muchas rondas de producción de proteínas que es más eficiente para localizar un ARNm que para localizar moléculas de proteína individuales. ARNm están localizados típicamente en traslación reprimidos hasta que llegan a su destino, que sirve para limitar aún más la localización de la proteína codificada 2. Además de los muchos casos bien documentados de localización del ARN para controlar el desarrollo embrionario, varios estudios han documentado los ARNm que se localizanpara el sitio de acción de la proteína codificada. Ejemplos destacados incluyen la localización de la β-actina 3 y Arp2 / 3 4 ARNm para el borde de ataque de los fibroblastos móviles y localización de los ARNm para muchos reguladores mitóticas y meióticas a husos mitóticos 5-7. Muchos de los ejemplos clásicos de ARNm localizadas fueron identificados a través de las pantallas de genética para las mutaciones de efectos maternos y más tarde se determinó que codifican ARN localizadas. Sin embargo, los estudios del genoma recientes han comenzado a proporcionar una visión más amplia en el ámbito de los ARN localizadas. Un reciente en la pantalla de hibridación in situ en embriones de Drosophila demostrado que ~ 70% de todos los mRNAs tienen una localización específica, incluyendo muchos destinos novedosos 8. La purificación de pseudópodos de fibroblastos de ratón identificado un grupo diverso de ARNm localizada 9. El trabajo de nuestro grupo utilizando purificación bioquímica de los microtúbulos de meiótica Xenopus huevo extractos identificados cientos de mRNAs que copurifican con el husillo 5,7. Nuestro trabajo mostró que la mayoría de los ARNm de microtúbulos localizadas codifican proteínas que funcionan en el control de la mitosis, el apoyo a la idea de que los ARNm se localizan en el sitio de acción de la proteína codificada. Por otra parte, la capacidad de detectar el enriquecimiento ARNm en una fracción subcelular por purificación bioquímica pone de relieve la potencia de este enfoque para la identificación de los ARNm localizadas. La mayoría de los ARN localizados utilizan transporte activo en el citoesqueleto, ya sea actina o los microtúbulos, para lograr un transporte a su destino final 10. Para obtener una mejor comprensión de la extensión y los tipos de ARN que se localizan a destinos específicos utilizando un enfoque bioquímico es necesario disponer de un sistema in vitro que pueden recapitular los procesos del citoesqueleto. Uno de los sistemas principales para el estudio de la biología del citoesqueleto es extractos de huevos producidosa partir de huevos no fertilizados de la rana Xenopus laevis. X. extractos de huevo laevis se han utilizado durante décadas para estudiar una amplia gama de procesos citoesqueleto y han contribuido mucho a nuestra comprensión de los mecanismos y las moléculas que controlan el conjunto del citoesqueleto y la dinámica 11. Además, X. extractos de huevo laevis son susceptibles de purificación a gran escala de los microtúbulos y proteínas asociadas a 12,13 y existen métodos bien diseñados para la producción de diversos tipos de extractos de huevo 14-16. Sin embargo, para los estudios genómicos hay varios inconvenientes a la utilización de X. laevis como un sistema modelo. Durante décadas ranas Xenopus laevis han sido un potente sistema para el estudio de la biología del desarrollo y celular, debido al gran tamaño de los ovocitos y robusto desarrollo externo 17. Por otra parte, el desarrollo de los sistemas de extracto de huevo que pueden recapitular muchos processe celulars en un tubo de ensayo se ha hecho de esta rana de un modelo experimental de gran alcance. Sin embargo, Xenopus laevis se ha visto obstaculizada por la falta de una secuencia completa del genoma, que se ha ralentizado por la naturaleza de alotetraploide el contraste genome.In, una especie estrechamente relacionada, Xenopus tropicalis, tiene un genoma diploide que fue secuenciado en 2010 18. Mientras X. tropicalis no es tan experimentalmente tratable como X. laevis 17 la disponibilidad de un genoma secuenciado hace que sea un sistema de modelo atractivo para realizar análisis de todo el genoma. En este informe se describe un método para hacer la meiosis II-, citostáticos extractos factor detenidos (LCR) de X. tropicalis 19. Se describe a continuación un método sencillo para purificar microtúbulos y ARN asociados a partir de este extracto. Los ARN a continuación, se pueden convertir en bibliotecas susceptibles de secuenciación usando las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento desarrollados recientemente. Una vez que las bibliotecasse secuenciaron que pueden ser alineados con el genoma de la rana para identificar ARNm específicos que se enriquecen en la muestra de microtúbulos en comparación con el extracto total. Esto proporciona un método eficaz para detectar la localización del mRNA microtúbulos orientados en un genoma de gran escala. Además de ser capaz de detectar ARNm localizadas, el uso de secuenciación de alto rendimiento y un genoma secuenciado ofrecen la posibilidad de descubrir nuevas transcripciones que no están actualmente presentes en las anotaciones de bases de datos públicas.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenopus tropicalis </td>
			<td>NASCO</td>
			<td>LM00823MX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chymostatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taxol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine, free base</td>
			<td>USB Corporation</td>
			<td>14030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cichlid Lake Salt</td>
			<td>Seachem</td>
			<td>47894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marine salt</td>
			<td>Seachem</td>
			<td>SC7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 gauge needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbermaid Plastic bucket</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Polyallomer 2 x &frac12; inch Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>326819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml round-bottomed glass centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>45500-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber adapter sleeves for 15 ml tubes</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>45550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &frac34; inch glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall HB-6 rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC-6 centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of xenopus tropicalis egg extracts to identify microtubule-associated rnas

Muchos organismos localizar mRNAs a destinos subcelulares específicos para la expresión de genes de control espacial y temporalmente. Estudios recientes han demostrado que la mayoría del transcriptoma se localiza en una posición aleatoria en las células y embriones. Un enfoque para identificar ARNm localizados es para purificar bioquímicamente una estructura celular de interés y para identificar todas las transcripciones asociadas. Uso de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento recientemente desarrollados ahora es sencillo identificar todos los RNAs asociados a una estructura subcelular. Para facilitar la identificación de transcripción que es necesario trabajar con un organismo con un genoma secuenciado en su totalidad. Un sistema atractivo para la purificación bioquímica de las estructuras subcelulares son extractos de huevos producidos a partir de la rana Xenopus laevis. Sin embargo, X. laevis actualmente no tiene un genoma secuenciado en su totalidad, lo que dificulta la identificación transcripción. En este artículo se describe un métodopara producir extractos de huevo de una rana relacionada, X. tropicalis, que tiene un genoma secuenciado en su totalidad. Proporcionamos información para la polimerización de microtúbulos, purificación y aislamiento transcripción. Mientras que este artículo se describe un método específico para la identificación de las transcripciones asociadas a los microtúbulos, creemos que se puede aplicar fácilmente a otras estructuras subcelulares y proporcionará un método potente para la identificación de ARN localizados.

Para identificar X. tropicalis transcripciones asociadas con microtúbulos, que preparan un extracto citosólico a partir de huevos no fertilizados detenidos en metafase de la meiosis II (LCR). El tratamiento de este extracto con taxol permite la formación de microtúbulos estables que pueden ser purificados por sedimentación a través de un cojín de glicerol (Figura 1A). El análisis en gel de Coomassie confirma que los sedimentos α / β-tubulina de una manera dependiente de taxol, y representa las principales especies de proteínas se recuperaron en estas preparaciones (Figura 1B). Los niveles más bajos de otras proteínas también están presentes en el sedimento taxol, pero no en preparaciones tratadas con la despolimerización de microtúbulos nocodazol drogas, lo que indica que las proteínas en la fracción de taxol específicamente asociada con los microtúbulos (MAPs). Un Bioanalyzer Agilent se utiliza para examinar la composición de ARN en general en todas las X. fracciones del extracto tropicalis (Figura 1C </strong&gt;). Tanto rRNA y tRNA especies están presentes en el extracto CSF y los microtúbulos que contiene taxol pellet, en consonancia con los resultados anteriores que la traducción se produce en microtúbulos y cabezales en X. extraer laevis huevos 5,21. Una traza de línea de la proyección de gel revela la señal de ARNm es notablemente inferior en los microtúbulos que contienen taxol pellets, más notablemente en la región por encima de la migración 28S rRNA, lo que indica que un subconjunto de mRNAs cosediment con los microtúbulos en X. tropicalis. ARN aislado de esta manera es adecuado para los experimentos de ARN-seq usando reactivos disponibles comercialmente. <img src="/files/ftp_upload/50434/50434fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50434/50434fig1hires.jpg" /> Figura 1. Purificación de MT-RNA para el ARN-seq. (A) Esquema de purificación para aislar MT-RNA. Los huevos se cosechan de mujeres X. troranas picalis. Después de la preparación de un extracto citoplasmático, se añade el taxol para inducir la polimerización de microtúbulos. Los microtúbulos y MT-ARN se purifican por sedimentación a través de un cojín de glicerol. (B) Análisis de gel de Coomassie de las proteínas aisladas utilizando el esquema descrito en (A). Totales del extracto CSF en comparación con las proteínas sedimentadas en presencia de taxol o nocodazol. (C) Análisis de gel de Bioanalyzer de ARN aislado utilizando el esquema descrito en (A). ARN aislado a partir de extracto de CSF en comparación con el ARN sedimentado en presencia de taxol o nocodazol. Se muestran Tanto la proyección de gel y las huellas de línea. Reproducido con permiso de Sharp, et al., (2011). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50434/50434fig1hires.jpg">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

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Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Se describe la colección de fertilizar<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Los huevos y la producción de un extracto de huevo II-arrestado meiosis. Este extracto de huevo se puede utilizar para purificar los microtúbulos y ARN asociadas a los microtúbulos.

Producción de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Huevos Extrae para identificar los ARN asociada a los microtúbulos

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

production-xenopus-tropicalis-egg-extracts-to-identify-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

13.6K vistas.  Massachusetts General Hospital. Se describe la colección de fertilizar Xenopus tropicalis Los huevos y la producción de un extracto de huevo II-arrestado meiosis. Este extracto de huevo se puede utilizar para purificar los microtúbulos y ARN asociadas a los microtúbulos.

Video: Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Investigación

Biología

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

En la Asamblea Vitro nucleares utilizando fraccionado extractos de huevo Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

La producción de transgénicos Xenopus laevis Integración mediada por la enzima de restricción y transferencia nuclear

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Estudio del Checkpoint Daño del ADN utilizando<em&gt; Xenopus</em&gt; Extractos de huevo

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em&gt; Xenopus</em&gt; Extracto de Huevo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

El aislamiento de los pequeños RNAs no codificantes de suero humano

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

La cuantificación de fenotipos en Orofacial<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Un híbrido método de extracción de ADN para la Evaluación de las comunidades bacterianas cualitativa y cuantitativa de Aves de Corral en muestras de producción

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

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