Reconocemos Justin Pinkney y Johannes Hohlbein para ayudar con la construcción del microscopio a medida y Seamus Holden para la localización de software. Rodrigo Reyes-Lamothe se dio las gracias por proporcionar el E. coli cepa. La investigación fue financiada por el Séptimo Programa Marco Europeo Comisión del Programa Beca FP7/2007-2013 SALUD-F4-2008 a 201.418, Reino Unido Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación Beca BB/H01795X/1, y el Consejo Europeo de Investigación Beca 261.227 a ANK. DJS fue financiado por una subvención WT083469 Programa de Wellcome Trust. SU fue apoyado por una beca de doctorado MathWorks.

1. Cultivo Celular Utilice tubos de cultivo estériles y puntas de pipeta. La E. coli cepa AB1157 Pola PAmCherry lleva un PAmCherry fusión C-terminal de Pol1. La fusión se inserta en la ubicación cromosómica nativa mediante la sustitución del gen de tipo salvaje utilizando recombinación lambda Red como se describe en Datsenko et al. 8 La funcionalidad de la proteína de fusión se confirmó a juzgar por las tasas de crecimiento celular y la sensibilidad a la que daña el ADN metil agente metanosulfonato (MMS). Más información sobre la construcción de la cepa de células se puede encontrar en Uphoff et al. 7, Datsenko et al. 8, y Reyes-Lamothe et al. 9 Los cultivos de células se cultivan en medio M9 mínimo para reducir la autofluorescencia y evitar las partículas de fondo en el portaobjetos de un microscopio. Alternativamente, un medio definido rico en nutrientes se puede utilizar 10. <ol><li> Racha de la E. AB115 coli cepa7 Pola PAmCherry de un stock de glicerol congelado en una placa de agarosa de caldo de Luria (LB) con antibióticos selectivos (aquí, 25 mg / ml de kanamicina) y se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> Inocular un cultivo de 5 ml de LB a partir de una sola colonia de células y crecer a 37 ° C con agitación a 220 rpm durante 3 horas. </li><li> Diluir la cultura 1:10.000 en 5 ml de medio mínimo (medio M9, aminoácidos MEM + prolina, vitaminas MEM, 0,2% de glicerol) y se incuba a 37 ° C con agitación a 220 rpm durante la noche. </li><li> A la mañana siguiente, medir la densidad óptica (DO) usando un espectrofotómetro y se diluye el cultivo en 5 ml de medio mínimo fresco a OD 0,025. Crecer durante 2 horas a 37 ° C con agitación a 220 rpm hasta la fase exponencial temprana (OD 0,1). </li><li> Concentrado 1 ml de células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por centrifugación a 2300 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 20 l medio residual y vórtice. </li></ol> 2. Portaobjetos de microscopio Preparation <ol><li> Preparar una solución de agarosa de baja fluorescencia del 1,5% en DH 2 O. Utilice un horno de microondas para fundir la agarosa hasta que la solución es clara. Mezclar 500 l de la solución de agarosa fundida con 500 l de medio mínimo 2x pipeteando suavemente hacia arriba y abajo varias veces. </li><li> Corre la solución de agarosa de manera uniforme en el centro de un cubreobjetos de microscopio (n 1.5 espesor). Esto tiene que hacerse rápidamente antes enfría la agarosa, evitando las burbujas. </li><li> Acoplar la almohadilla con un segundo cubreobjetos (No 1.5 espesor). Para eliminar las partículas fluorescentes de fondo, cubreobjetos fueron quemados previamente en un horno a 500 ° C durante 1 hora. Cubreobjetos quemadas pueden ser almacenados durante semanas a temperatura ambiente cubierto de papel de aluminio. </li><li> En experimentos de daño en el DNA, preparar una plataforma de agarosa que contiene 100 mM MMS. Siga el procedimiento de los pasos 2.1 a 2.3, pero añadir 8,3 MMS mu l a 500 l de medio M9 antes de la mezcla con 500 l de 1,5% de agarosa fundida, para una concentración final de 100 mM de MMS. (NOTA: MMS es tóxico y mutagénico y debe manejarse con guantes, mascarilla, gafas y bata de laboratorio). </li><li> Retire el carro superior de la almohadilla y añadir 1 l de suspensión celular concentrada en la almohadilla. Inmovilizar las células cubriendo la almohadilla con un cubreobjetos sin usar quemada (No 1.5 espesor, haciendo coincidir la especificación objetivo de microscopio) y presionando muy suavemente en la diapositiva. Las células deben ser reflejados dentro de los 45 min de inmovilización antes de que se seque la almohadilla de agarosa. Para evitar que se sequen durante los experimentos más largos, agarosa almohadillas pueden ser sellados mediante juntas de silicio. </li><li> Por experimentos daño de ADN, incubar las células inmovilizadas sobre la almohadilla de agarosa que contiene 100 mM de MMS durante 20 min en una recipiente humidificada a temperatura ambiente antes de formación de imágenes. </li></ol> 3. Preparación de Microscopía de Adquisición de Datos PALMA basa en la detección y localización precisa de las proteínas fluorescentes individuales. La sensibilidad y la alineación óptima deel microscopio es crítico para la calidad de los datos. Microscopios de fluorescencia individual-molécula emplean típicamente reflexión total interna (TIR) ​​de iluminación para mejorar la relación señal a ruido por emocionantes sólo fluoróforos dentro de una sección delgada por encima de la superficie del cubreobjetos. Aquí, las imágenes en el interior de E. coli requiere la iluminación muy inclinado el 11, que se puede conseguir en el microscopio TIRF al disminuir ligeramente el ángulo de la luz de excitación. De formación de imágenes PAmCherry requiere, además, un láser de fotoactivación 405 nm y un láser de excitación de 561 nm. La emisión de fluorescencia se registra en un electrón multiplicando CCD (EMCCD) de la cámara con un aumento resultante en una longitud de píxel de 114,5 nm / píxel. Para una precisión óptima localización, el tamaño del pixel debe coincidir aproximadamente con la anchura de la desviación estándar de la PSF para asegurar un muestreo suficiente sin la propagación de la señal a través de muchos píxeles. Figura 3 muestra un esquema de una configuración mínima PALMA. Película 1da la impresión de que el proceso de construcción del microscopio a medida, véase Uphoff et al 7 para una descripción detallada del instrumento.. <ol><li> Realizar la alineación rutina microscopio. Mida el 405 nm y 561 nm intensidades de láser de onda continua en frente del objetivo. Ajuste la intensidad de 561 nm a 3,5 mW (~ 400 W / cm 2) y 405 nm intensidad de 10 mW (~ 1 W / cm 2). Use una rueda de filtros de densidad neutral variable continua que permite el ajuste gradual de la intensidad de 405 nm de 0-10 mW. Desconectar la iluminación láser hasta el inicio del experimento. </li><li> Coloque la muestra en la platina del microscopio y traer las células en enfoque en el modo de microscopía de luz transmitida (Figura 4 A). La ganancia de la cámara EMCCD tiene que ser apagado para evitar daños en la cámara por la sobreexposición. </li><li> Definir un FOV recortado para reducir el tamaño de los datos y aumentar la velocidad de lectura de la cámara. </li><li> Cubra la muestra de la luz ambiente y switch en la ganancia de la cámara EMCCD. </li><li> Ajuste la velocidad de fotogramas de 15,26 ms / frame (incluyendo 0.26 cámara ms tiempo de lectura). Véase &quot;tiempo de exposición y de excitación intensidades&quot; en la sección de discusión. </li><li> Visualice los datos de la cámara para comprobar la señal de fondo oscuro (Figura 4B). </li><li> Encienda el láser de 561 nm y comprobar la señal de fondo de excitación (Figura 4C). </li><li> Encienda el láser de 405 nm para la fotoactivación de las proteínas de fusión Pol1-PAmCherry y aumentar la intensidad hasta que aparezcan PSFs fluorescencia. </li><li> Ajustar el ángulo del haz de excitación para iluminar sólo una sección delgada de la muestra cerca de la superficie cubreobjetos. <ol><li> Para este fin, el haz de láser se enfoca en el plano focal posterior de un 1,4 objetivo 100X NA (Figura 3). La traducción de la lente de enfoque perpendicular a la viga se mueve el foco de distancia desde el centro del objetivo haciendo que el haz para salir del objetivo bajo un ángulo. </li><li> Aim para maximizar la intensidad de fluorescencia y minimizar la señal de fondo. Tenga en cuenta que el estricto excitación TIR es óptimo fluoróforos imágenes dentro de 100 nm de la superficie del cubreobjetos, sin embargo, las proteínas de unión al ADN de imágenes asociadas a la E. coli nucleoide requiere una iluminación más profunda hasta 0,8 micras. </li></ol></li></ol> 4. Adquisición de Datos Aquí se describe el protocolo general para la adquisición de una película PALMA. El mismo procedimiento se aplica para obtener imágenes de las proteínas de fusión Pol1-PAmCherry en buen estado E. coli células y bajo tratamiento de daño del ADN continuo con MMS. La aplicación del método de las proteínas de fusión de diferente peso molecular o número de copias por célula requerirá diferentes ajustes de adquisición (véase la sección de debate). <ol><li> Encontrar un nuevo campo de visión (FOV) de las células en el modo de microscopía de luz transmitida y enfocar la imagen. Tomar una instantánea de la cámara para registrar la contornos celulares (Figura 4A).</li><li> Cubra la muestra de la luz ambiente y encienda la ganancia de la cámara EMCCD. </li><li> Encienda el láser de 561 nm y blanquear la autofluorescencia celular y manchas de fondo en el cubreobjetos durante unos segundos antes de iniciar la adquisición de datos. Para las células cultivadas y la imagen en medio M9 y utilizando cubreobjetos de quemado por lo general hay muy poca fluorescencia de fondo, sin embargo, preblanqueo podría ser útil para obtener imágenes de las células en un medio de crecimiento rico tal como LB. Tenga en cuenta que la iluminación intensa es tóxico para las células de modo preblanqueo debe mantenerse a un mínimo. </li><li> Iniciar la adquisición de una película PALMA bajo continua de excitación 561 nm a 15,26 ms / frame. </li><li> Encender el láser de 405 nm y aumentar gradualmente la intensidad en el transcurso de la película, que alcanza hasta 1 W / cm 2. Evitar mayores intensidades de 405 nm que causan la autofluorescencia celular. Preste atención a la densidad de las moléculas fluorescentes - es importante para mantener las tasas de activación baja tal que PSFs son claramenteaislados en cada cuadro (Figuras 4D-F). </li><li> Registre 10.000 marcos / película (dependiendo del número de moléculas para ser reflejado por célula); una película típicamente toma 2-3 min y requiere 0,5-1 GB de espacio en disco duro, dependiendo del tamaño del campo de visión FOV. </li><li> Repita el procedimiento de adquisición de múltiples FOV. Tenga en cuenta que cada campo de visión sólo se pueden obtener imágenes de una vez porque fluoróforos PAmCherry obtener fotoactivado y se blanquea de forma irreversible. </li></ol> 5. Análisis de Datos Un marco automatizado y robusto análisis de datos es esencial para el rendimiento y la eficiencia del método. Utilizamos software personalizado escrito en MATLAB. <ol><li> Realizar el análisis de localización utilizando algoritmos descritos en Crocker et al. 12, Holden et al. 13, HoldenI et al. 14, y Wieser et al. 15 PSF se identifican por primera vez en una imagen filtrada de paso de banda se utiliza un kernel gaussiana con 7 pixels de diámetro (Figura 5A). Posiciones de los candidatos corresponden a PSF con intensidades pico de píxeles por encima de 4,5 veces la desviación estándar de la señal de fondo (Figura 5B). El píxel más brillante localmente por PSF candidato sirve como aproximación inicial para el ajuste de una función gaussiana elíptica (Figura 5C). Los parámetros de ajuste libres son: posición x, la posición Y, X-anchura, y-ancho, ángulo de rotación, la amplitud y desplazamiento de fondo. La máscara de Gauss elíptica representa molécula durante el tiempo de exposición, lo que desdibuja y deforma el PSF. </li><li> Trace los (x, y) localizaciones resultantes de todos los fotogramas de la película PALMA la imagen de microscopía de luz transmitida del mismo FOV en. Localizaciones de Pol1-PAmCherry deben aparecer dentro de la zona central de la E. coli células (Figura 6A). Si muchas localizaciones aparecen fuera de las células, el umbral de la localización era demasiado bajo o la muestra contenía partículas fluorescentes de fondo. </li><li> Para el análisis automatizado de seguimiento, la aplicación MATLAB del algoritmo descrito en Crocker et al. 12 puede ser utilizado (ver &quot;Análisis de difusión&quot; en la sección de discusión). Posiciones que aparecen en los fotogramas siguientes dentro de una ventana de seguimiento definido por el usuario se conectan para formar una trayectoria. En el caso de que múltiples localizaciones se producen en la misma ventana, pistas son asignadas al minimizar la suma de las longitudes de paso. Para una discusión detallada de las distintas consideraciones a la hora de calcular los coeficientes de difusión de los datos de seguimiento de partículas individuales, ver Wieser et al. 15 <ol><li> El algoritmo utiliza un parámetro de memoria para dar cuenta de parpadeo transitoria o localizaciones perdidas durante una pista. Aquí, nos fijamos el parámetro de memoria de 1 marco, los valores más altos se pueden utilizar para el seguimiento de fluoróforos con los estados oscuros de larga vida. </li><li> Elija una ventana de seguimiento adecuado en base a los siguientes pasos de calibración. Para Pol1, utilizamos 0,57 m (5 píxeles).</li><li> Ejecutar el algoritmo de seguimiento para el seguimiento de una serie de parámetros de la ventana. Calcular el número de pistas medido por célula como una función de la ventana de seguimiento para identificar la ventana de seguimiento más pequeño posible que no lo hace pistas (Figura 6B) se dividió. </li><li> Trazar las pistas resultantes sobre la imagen de microscopía de luz transmitida de la misma FOV para visualizar la distribución espacial de la molécula de movimiento dentro de las células. Pistas POL1 deben mostrar difusión confinado dentro de las células individuales (figuras 6C-D). </li><li> Si una fracción de pistas parece cruzar entre las células esto sugiere que las moléculas separadas fueron erróneamente vinculados porque la ventana de seguimiento fue elegido demasiado grande y / o la tasa de fotoactivación era demasiado alto (Figura 6E). </li><li> Trazar la distribución acumulada de las longitudes de paso entre localizaciones consecutivas (Figura 6F). La curva se eleva y satura sin problemas para suficientemente grandes ventanas de seguimientopero muestra un borde de corte si la ventana fue elegido demasiado pequeño. </li></ol></li><li> Analizar las características de difusión de Pol1, calcule el desplazamiento cuadrático medio (MSD) entre localizaciones consecutivas para cada pista con un total de N pasos): MSD = 1 / (N-1) Σ i = 1 N-1 (X i +1 - x i) 2 + (y i +1 - yi) 2. Incluya sólo las pistas con un mínimo de 4 pasos (N ≥ 5 localizaciones) para reducir la incertidumbre estadística en los valores de TME. </li><li> Trazar una curva de valores de MSD en un rango de tiempos de retardo mediante el cálculo de los desplazamientos a través de múltiples marcos (Figura 6G). La forma de la curva de MSD puede ayudar a clasificar el movimiento molecular observado (Figura 6H). </li><li> Calcular el coeficiente de difusión aparente D * por canción del MSD: D * = MSD / (4 Dt) - σ loc 2 / Dt. El segundo term corrige el error de localización estimada (en este caso, loc σ = 40 nm y Dt = 15.26 ms, ver Wieser et al. 15). </li><li> Trace un histograma de los valores de medición * D de todas las pistas del campo de visión (Figura 7). </li><li> Identificar moléculas POL1 individuales que aparecen unidos al cromosoma basado en el valor medido D * por pista. Separar las poblaciones de la envolvente (distribución agudo centrado en D * ~ 0 m 2 / s) y moléculas que se difunden libremente (amplia distribución centrada en D * ~ 0,9 m 2 / s) mediante el establecimiento de un umbral de D * &lt;0,15 m 2 / s ( barras de color rojo en las figuras 7A y 7D). </li><li> Llevar a cabo la localización, seguimiento y análisis de difusión para Pol1 en células en buen estado (Figuras 7A-C) y en las células que están bajo tratamiento daño de ADN con MMS (Figuras 7D-E). La fracción de pistas consolidados proporciona una medida cuantitativa directa de la DNA la actividad de reparación de Pol1 in vivo. </li></ol>

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	<li>Friedberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Repair and Mutagenesis. , (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+spatial+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer spatial resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy.">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li><li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), (2011).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria.">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (20), 8063-8068 (2013).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells.">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133 (1), 90-102 (2008).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J. Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Holden, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+limits+of+single+molecule+FRET+resolution+in+TIRF+microscopy.">Defining the limits of single molecule FRET resolution in TIRF microscopy.</a> Biophys. J. 99 (9), 3102-3111 (2010).</li><li>Holden, S. J., Uphoff, S., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAOSTORM:+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy.">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 8 (4), 279-280 (2011).</li><li>Wieser, S., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+in+the+live+cell+plasma+membrane-Do's+and+Don't's.">Tracking single molecules in the live cell plasma membrane-Do's and Don't's.</a> Methods. 46 (2), 131-140 (2008).</li><li>Arnauld, S., Nicolas, B., Herv&#233;, R., Didier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protoc. Exch. , (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. (11), 555-565 (2009).</li><li>Elmore, S., M&#252;ller, M., Vischer, N., Odijk, T., Woldringh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+oriC-GFP+fluorescent+spots+during+chromosome+segregation+in+Escherichia+coli.">Single-particle tracking of oriC-GFP fluorescent spots during chromosome segregation in Escherichia coli.</a> J. Struct. Biol. 151 (3), 275-287 (2005).</li><li>Badrinarayanan, A., Reyes-Lamothe, R., Uphoff, S., Leake, M. C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+architecture+and+action+of+bacterial+Structural+Maintenance+of+Chromosome+proteins.">In vivo architecture and action of bacterial Structural Maintenance of Chromosome proteins.</a> Science. 338 (6106), 528-531 (2012).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Discutimos varias consideraciones clave para el éxito del experimento. La elección y la expresión de la proteína de fusión de fluorescencia: Hay una gran gama de colores de las proteínas fluorescentes fotoactivables y photoswitchable 17. La elección concreta depende de las características de microscopio, en particular los láseres y filtros disponibles. La combinación de 405 nm y 561 nm es ideal para las proteínas fluorescentes fotoactivables comunes. Elegimos PAmCherry 6 porque es monomérica y no mostró la agregación de las células. Además, la fotoactivación irreversibles permite contar el número de fluoróforos activados para medir el número de copias de proteína por célula. En lugar de expresar la proteína de fusión a partir de un plásmido, se prefiere la inserción cromosómica del gen que codifica para la proteína de fusión en el locus de tipo salvaje. Esto asegura la sustitución completa de la proteína de interés con el fluorescente versión y mantener el nivel de expresión de tipo salvaje. Tasa Fotoactivación: Es importante ajustar la tasa de fotoactivación de tal manera que, en promedio, menos de una molécula por célula se encuentra en el estado fluorescente en cualquier fotograma de la película. Esto depende de la intensidad de 405 nm y el número de moléculas de izquierda a ser activado. A densidades muy bajas de imagen, sin embargo, no todas las moléculas serán fotografiadas antes del final de la película o películas muy largas tienen que ser adquiridos. El número de fotogramas grabados por película depende del número de copias de proteínas de fusión por célula y la media photobleaching curso de la vida de PAmCherry en las condiciones de excitación utilizadas. El número de copias de Pol1 es ~ 400 moléculas / célula 1 y el valor medio de la distribución de tiempo de vida fotoblanqueo exponencial fue ~ 4 marcos. Mediante el aumento de la intensidad 405 nm gradualmente, la activación se distribuye uniformemente sobre las 10.000 tramas de la película. Por lo tanto, cada celda es occupied por moléculas fluorescentes para un total de ~ 1600 marcos, asegurando poco solapamiento de PSF y complicaciones de seguimiento en una película de 10.000 marcos. Tiempo de exposición y de excitación intensidades: Ante todo, los tiempos de exposición deben ser lo suficientemente corto para observar PSFs nítidas con poco movimiento borrosa. Sin embargo, se debe elegir la velocidad de fotogramas para producir el movimiento molecular observable entre cuadros sucesivos más allá de la incertidumbre de localización, de lo contrario los fotones cruciales se desperdician por sobremuestreo de la pista. El movimiento de las moléculas no unidas deben tomarse muestras a intervalos de tiempo suficientemente largo para ser claramente distinguible del movimiento aparente de moléculas unidas debido a la incertidumbre en la localización. Cuando se ajusta el tiempo de exposición, la intensidad PSF se debe ajustar. La precisión de la localización de un PSF aumenta con el número de fotones detectados durante la duración de una trama. Intensidades de excitación más altos aumentan los bu tasa por emisión de fotónt también la tasa fotoblanqueo y la señal de fondo. Utilice la intensidad de excitación más bajo que le da la precisión de localización deseada. Para Pol1-PAmCherry elegimos 15,26 ms / frame y 3,5 mW 561 nm de excitación (400 W / cm 2). Es importante para confirmar la viabilidad celular de las condiciones de formación de imágenes particulares mediante el control de crecimiento celular y la morfología antes y después de la adquisición de datos (ver Información Suplementaria en Uphoff et al. 7). Pol1 exhibe un tiempo de unión de ~ 2 seg a un sustrato de ADN con huecos in vivo 7; por lo tanto, se espera que la mayoría de las moléculas a ser ya sea en el estado unido o no unido para toda la duración de una pista. Moléculas unidas aparecerá esencialmente inmóvil porque los sitios cromosómicos tienen un coeficiente de difusión de varios órdenes de magnitud inferior (~ 10 -5 m 2 / seg, Elmore et al. 18) de Pol1 difusión en el citoplasma (~ 1 m 2 </sarriba&gt; / seg). Análisis Difusión: El coeficiente de difusión aparente D * se calcula a partir del MSD de pistas individuales, como promedio durante un mínimo de 4 pasos (5 fotogramas) para reducir el error estadístico. Tenga en cuenta que ~ 75% de las moléculas de blanquear en menos de 5 cuadros para las condiciones de formación de imágenes descritos. Tales pistas cortas no proporcionan suficiente certeza estadística de distinguir moléculas dependientes e independientes. Sin embargo, las fracciones relativas de las moléculas dependientes e independientes que informan sobre la actividad de la proteína son independientes del número total de temas analizados. Es útil para tener en cuenta el error de localización fibras discontinuas de poliéster (loc σ) en el cálculo de D *, porque la incertidumbre añade un paso aleatorio evidente para cada localización de una molécula de 15. Para mejorar la clasificación de moléculas enlazadas y se difunden, se recomienda calcular D * both partir de los desplazamientos de un solo paso y los desplazamientos más el tiempo de dos tramas. A continuación, es posible establecer dos umbrales separados D *: D * (15 ms) &lt;0,15 m 2 / s, y D * (30 ms) &lt;0,075 m 2 / s. Tenga en cuenta que D * es un coeficiente de difusión aparente que se ve afectada por el confinamiento celular de las pistas y el movimiento de desenfoque debido a la difusión durante el tiempo de exposición. Para extraer precisos coeficientes de difusión imparciales, que ha demostrado ser útil para comparar el movimiento observado a los datos simulados en función de un modelo estocástico browniano movimiento 5,7. Simulación de datos también pueden ser utilizados para probar los procedimientos de análisis de datos. Las aplicaciones potenciales de este método: Se describen un enfoque general para la visualización y la cuantificación de las interacciones proteína-DNA in vivo por el cambio en la movilidad de una proteína tras la unión al cromosoma. Las actividades de ADN-oProteínas de unión de ARN-implicadas en la reparación, la replicación, la transcripción, y el mantenimiento de cromosomas por lo tanto pueden ser seguidos en tiempo real a nivel de una sola célula con una resolución espacial por debajo del límite de difracción óptica. Fotoactivado seguimiento de una sola molécula se extiende métodos de seguimiento convencionales que están restringidos a unas pocas moléculas marcadas por célula. Un método alternativo que mide la difusión molecular in vivo es la fluorescencia de recuperación después de photobleaching (FRAP). Mientras FRAP es muy útil para medir las características globales de difusión en células grandes, que se limita en su capacidad para resolver varias especies moleculares con diferentes movilidades en un entorno espacialmente heterogénea, especialmente para las pequeñas células bacterianas. Hemos aplicado fotoactivado sola molécula de seguimiento para medir las actividades de unión al ADN y localizaciones subcelulares de una gama de diferentes proteínas en E. coli incluyendo Pol1, ADN ligasa, proteína Fis, DNApolimerasa III 7, así como el mantenimiento estructural de proteínas Cromosomas MukB, E, y F 19. Anticipamos que el método también se puede adaptar a otros tipos de células.

Este protocolo describe la medición directa de la proteína-DNA en células de Escherichia coli que viven. La técnica utiliza el cambio en el coeficiente de difusión de una sola proteína marcada con fluorescencia ya que se une el cromosoma (Figura 1). Para demostrar el método que utilizamos ADN polimerasa, una proteína de unión al ADN prototípico I (Pol1) que llena las lagunas de ADN en la replicación del filamento de revestimiento y las vías de reparación por escisión de 1. El advenimiento de la microscopía de fluorescencia de super-resolución permite la visualización de estructuras moleculares en las células con resolución nanométrica. Fotoactivado Localización Microscopía (PALM) emplea las proteínas fluorescentes que se pueden activar desde un estado oscuro inicial a un estado fluorescente (Figura 2). Sólo un subconjunto de todas las moléculas marcadas se activa en cualquier momento para determinar sus posiciones de una manera secuencial, de forma independiente de Tque suman concentración de moléculas marcadas en la muestra 2. La precisión de localización por molécula depende principalmente del tamaño de la Función Point Spread fluorescente (PSF), el número de fotones recogidos, y la señal de fondo 3. Muchas aplicaciones de este método se centran en la mejora de la visualización de las estructuras celulares. La realización que Palm se puede combinar con una sola molécula de seguimiento de 4 abierto nuevas vías para seguir directamente el movimiento de un número arbitrario de proteínas marcadas en las células vivas. Aumento de la sensibilidad y la resolución temporal de los microscopios de fluorescencia ahora permiten el seguimiento de las proteínas fluorescentes difunden individuales en el citoplasma bacteriano 5. Aquí, utilizamos PAmCherry, una proteína fluorescente ingeniería que convierte irreversiblemente desde un estado inicial no fluorescente a un estado fluorescente tras la irradiación con 405 nm de luz 6. Fluoróforos PAmCherry activados pueden ser imagend por excitación a 561 nm y un seguimiento durante varias tramas hasta photobleaching. Se demuestra la capacidad del método para identificar eventos de unión al ADN transitorias de proteínas individuales utilizando una fusión de Pol1 y PAmCherry. El tratamiento de células con metil metanosulfonato (MMS) causa daño metilación del ADN que se convirtió en sustratos de ADN con huecos por las enzimas de reparación de base-escisión. Nuestro método muestra la unión de moléculas individuales POL1 claro en respuesta al daño MMS 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1444">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:477px;"></td>
			<td style="width:467px;">created by Lambda-Red recombination</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM amino acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM vitamins</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11120-052</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-3100</td>
			<td>certified molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>BB024060SC</td>
			<td style="width:467px;">remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl methanesulfonate (MMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>129925</td>
			<td>CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PALM setup</td>
			<td>home-built</td>
			<td></td>
			<td>described in Uphoff et al. 2013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>for data analysis and visualization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Localization software</td>
			<td style="width:187px;">custom-written, available online</td>
			<td>http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html</td>
			<td style="width:467px;">MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tracking software</td>
			<td>available online</td>
			<td><a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a></td>
			<td style="width:467px;">MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker &#38; Grier 1996 if used in publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein-dna interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking

Proteína-DNA están en el corazón de muchos procesos celulares fundamentales. Por ejemplo, la replicación del ADN, transcripción, reparación y organización de los cromosomas se rigen por las proteínas de unión al ADN que reconocen estructuras o secuencias específicas de ADN. Experimentos in vitro han ayudado a generar modelos detallados para la función de muchos tipos de proteínas de unión al ADN, sin embargo, , los mecanismos exactos de estos procesos y su organización en el complejo entorno de la célula viva siguen siendo mucho menos comprendidos. Recientemente hemos introducido un método para cuantificar las actividades de reparación del ADN en células de Escherichia coli en vivo usando fotoactivado Localización Microscopía (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula. Nuestro enfoque general identifica los eventos de unión al ADN individuales por el cambio en la movilidad de una sola proteína en asociación con el cromosoma. La fracción de moléculas ligadas proporciona una medida cuantitativa directa para el acto de proteínasividad y abundancia de sustratos o sitios de unión a nivel de una sola célula. A continuación, describimos el concepto del método y demostrar la preparación de muestras, adquisición de datos, y los procedimientos de análisis de datos.

El concepto de fotoactivado sola molécula de seguimiento para estudiar las interacciones proteína-DNA in vivo se ilustra en la Figura 1. Proteínas de fusión PAmCherry se detectan en E. directo células de E. coli en una manera secuencial por la fotoactivación de las moléculas individuales estocásticamente con 405 nm de luz a una frecuencia de menos de una molécula por célula a la vez. Moléculas activadas se crean imágenes de bajo continua 561 nm de excitación. Movimiento molecular en la célula se puede seguir mediante la conexión de localizaciones cercanas en una serie de tramas hasta photobleaching irreversible. Debido a que la difusión de las proteínas de unión al ADN es más lento después de la unión del cromosoma, el coeficiente de difusión aparente D * obtenido por pista depende directamente de las interacciones proteína-ADN individuales. La Figura 2 demuestra la fotoactivación de proteínas de fusión Pol1-PAmCherry en E. vivo células de E. coli. La influencia de la intensidad de 405 nm ON la densidad de las moléculas fluorescentes se puede ver en la Figura 4. Tenga en cuenta que la densidad no está determinado únicamente por la intensidad de 405 nm, pero, además, por el número de moléculas que están disponibles para la activación; la piscina de moléculas restantes se agota en el transcurso de una película de palma. Localización análisis se realiza para cada fotograma de una película de palma como se ilustra en la Figura 5. Se midió la precisión de localización utilizando moléculas inmóviles en células fijadas o moléculas unidas en células vivas. Nuestros ajustes de adquisición dieron una precisión de localización de σ loc = 40 nm, de acuerdo con la predicción teórica 3. Las localizaciones POL1 resultantes ocupan la zona central de la célula (Figura 6A), en términos generales la recapitulación de la organización espacial de la E. coli nucleoide 7. La mayoría de los Pol1 pistas en las células no dañadas mostrar difede fusión como se muestra en la Figura 6C. Una célula típica contiene varios cientos de pistas POL1 (Figura 6D), en consonancia con el número de copias de aproximadamente 400 moléculas POL1 por E. . coli celular 1 Figuras 6B y 6E-F proporciona orientación sobre la elección de un parámetro de la ventana de seguimiento adecuado - si la ventana de seguimiento es demasiado grande, las diferentes moléculas son más propensos a convertirse erróneamente vinculado a una pista, si la ventana de seguimiento es demasiado pequeño, pistas con pasos más largos se dividirá. La curva de MSD para Pol1 aumenta linealmente durante cortos tiempos de retardo y se satura en los tiempos de retardo más largos debido al confinamiento celular (Figura 6G). Diferentes tipos de movimiento molecular se pueden identificar por análisis de MSD. Movimiento dirigido da una curva parabólica; movimiento browniano se caracteriza por una línea recta, la curva de difusión confinado alcanza una meseta; un desplazamiento de la curva de MSD para partículas inmóviles representa el Lincertidumbre ocalization (Figura 6H). Información adicional sobre una sola partícula de seguimiento y sugerencias para solucionar problemas puede encontrarse en Arnauld et al. 16 Hemos aplicado previamente el método para medir la actividad de reparación del ADN de Pol1 en respuesta al daño del ADN exógeno alquilación 7. El D * histograma de Pol1 pistas en células en buen estado muestra una población dominante de difundir moléculas (Figuras 7A-C). Una pequeña fracción de 2,7% de moléculas POL1 encuadernados es probable que participan en la replicación del filamento de revestimiento y reparación de daños en el ADN endógeno. Bajo continuo daño 100 mM MMS, la población de las pistas con D * ~ 0 2 micras / s aumenta a 13,8% (Figura 7D). Estas pistas representan moléculas POL1 personas físicas que realicen la síntesis de reparación de ADN para llenar los vacíos de un solo nucleótido, como parte de la ruta de base de reparación por escisión. Las posiciones de pistas unidas muestran la ubicación de los individuoDaño del ADN y la reparación de sitios (Figura 7E-F). <img alt="Figura 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" width="300" /> Figura 1. Representación gráfica del método. (A) El PAmCherry proteína fluorescente puede fotoactivado desde un estado inicial no fluorescente tras la irradiación con luz 405 nm. El estado brillante está entusiasmado en 561 nm y emite fluorescencia en torno a 600 nm hasta los blanqueadores fluoróforo irreversible. (B) El control de la velocidad de la fotoactivación permite imágenes solamente una sola proteína de fusión PAmCherry estocásticamente activado por célula en cualquier momento mientras el arbitrariamente grande conjunto de moléculas que aún no han sido activados o que ya han sido blanqueados restos en un estado oscuro. (C) La posición de la molécula fluorescente se determina desde el centro de la PSF y TR aisladoacked para varios marcos de hasta photobleaching. (D) Pistas de muchas moléculas se registran de una manera secuencial. (EF) La interacción de una proteína de unión a ADN con una secuencia diana cromosómica o estructura detiene el movimiento difusivo al azar. Moléculas unidas y no unidas se distinguen por el coeficiente de difusión aparente D * extrae de pistas individuales. La fracción resultante de moléculas ligadas da una medida cuantitativa de la actividad de una proteína de unión al ADN in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2. La fotoactivación de Pol1-PAmCherry en E. directo células de E. coli. Las barras de escala: 1 m. Esquemas se muestran debajo de cada panel. (<html> A) Imagen de microscopía óptica de las células inmovilizadas sobre una almohadilla de agarosa transmitida. (B) Phototactivating un solo fluoróforo PAmCherry en una célula. (C) Una mayor tasa de fotoactivación aumenta el número de moléculas fluorescentes. (D) Integrated PAmCherry fluorescencia de una película PALMA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig3highres.jpg" width="400" /> Figura 3. Esquema de una configuración mínima de palma para las proteínas de fusión y fotoactivadora PAmCherry imágenes D1:. Espejo dicroico (por ejemplo, 550 nm de paso largo). D2: espejo dicroico (por ejemplo, 570 nm de paso largo). L1: Lente colimadora. L2: lente TIR. L3: Lente Tube.1177/51177fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Imágenes representativas de una película de palma con 15,26 ms / frame barras de escala:. 1 micra. (A) de transmisión de imagen a la luz de las células inmovilizadas sobre una almohadilla de agarosa. (B) Imagen de fondo oscuro medido en la cámara EMCCD con el láser apagado. (C) Excitación imagen de fondo bajo continua de excitación 561 nm antes de fotoactivación. (DF) Aumento de la intensidad de 405 nm conduce a mayores tasas de fotoactivación de PAmCherry, fotografiados bajo continuo 561 nm de excitación. Las áreas encuadradas se muestran ampliada a continuación. (D) de baja intensidad de 405 nm (&lt;1 mW) activos muy pocas moléculas fluorescentes por FOV. (E) Medio 405Resultados de intensidad nm (~ 2 mW) fotoactivación en una buena densidad de fibras discontinuas de poliéster para la localización y análisis de seguimiento. (F) Mayor intensidad de 405 nm (~ 10 mW) activa más de una molécula fluorescente en algunas células, que oscurece la localización y análisis de seguimiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Ilustración del análisis de localización. Las barras de escala: 1 m (A) de filtrado de paso de banda elimina el ruido de píxeles espuria y aplana gradientes de intensidad en todo el campo de visión.. (B) PSFs candidatos se identifican en la imagen filtrada en base a un umbral definido por el usuario que se elige para minimizar falsas detecciones positivos y falsos negativos. El threshoLD corresponde a la intensidad mínima de un píxel candidato dividido por el fondo desviación estándar (relación señal-ruido, SNR). (C) El píxel localmente más brillante que pasa el umbral sirve como estimación de localización inicial (cruz de naranja) para un ajuste gaussiano elíptica de dos dimensiones. Las barras de escala: 0,5 m. La localización de super-resolución resultante (Blue Cross) tiene una precisión media de loc σ = 40 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" width="500" /> .. Figura 6 Ejemplo de análisis de seguimiento de barras de escala: 1 m. (A) Todas las localizaciones detectadas de Pol1-PAmCherry en un ejemplo de células. (B) Número de pistas detectared en el ejemplo de células como una función de la ventana de seguimiento. Las pequeñas ventanas de seguimiento dividen trayectorias moleculares, lo que conduce a un artefacto de alto número de pistas. La línea discontinua indica nuestra elección para el parámetro ventana de seguimiento (0.57 m, 5 píxeles) - esto le da un buen compromiso entre la detección de la distribución total de pasos y mantener las trayectorias de diferentes moléculas intactas. (C) Ejemplo pista de una sola molécula de Pol1-PAmCherry. (D) Todas las pistas medidos se muestran en colores al azar. (E) los artefactos de seguimiento si se elige la ventana de seguimiento demasiado grande (aquí 0,8 m, 7 píxeles) o la densidad de PSF por trama es demasiado alta. (F) las distribuciones acumuladas de las longitudes de paso para las ventanas de seguimiento: 0,34 m (3 píxeles, línea roja), 0,57 m (5 píxeles, línea azul) y 0,80 m (7 píxeles, línea verde). Tenga en cuenta que la ventana de seguimiento 0,34 micras corta pasos de más de 0,34 m, que claramentetrunca la distribución total de pasos. La ventana de seguimiento de 0,57 micras detecta casi la misma distribución de pasos como lo hace la ventana de seguimiento 0,80 micras. Curva (G) MSD muestra difusión confinada de Pol1. Curvas (H) Esquema de MSD para el movimiento dirigido, el movimiento browniano, la difusión confinado, y las partículas inmóviles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. La medición directa de la actividad de reparación del ADN de Pol1 en E. directo . coli células barras de escala: 1 m. (A) Histograma del coeficiente de difusión aparente D * para todas las pistas de 4 o más pasos en un campo de visión de las células no dañadas (N = 4.162 pistas). La población de moléculas clasificadas como b<html> ound se resalta en rojo. (BC) Pistas de Pol1-PAmCherry se muestran en una imagen de microscopía de luz transmitida. Pistas clasificados como presos en función de su coeficiente de difusión se muestran en rojo. (D) D * histograma para las pistas POL1 medidos en células inmovilizadas sobre una almohadilla de agarosa con mM MMS 100 y se incubaron durante 20 min antes de la proyección de imagen (N = 2.128 pistas). La población de moléculas unidas que participan en la reparación del ADN se muestra en rojo. (EF) Pol1-PAmCherry pistas transmitido imagen de microscopio óptico que muestra las huellas de los eventos individuales de reparación del ADN Pol1 en rojo en. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Video 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/video.jpg" width="400" /> Película 1. La construcción de una instalación PALMA medida.&quot;Target =&quot; _blank JoVE_Uphoff_Movie1.avi &quot;&gt; Haga clic aquí para ver el video.

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Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Microscopía de localización fotoactivado (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula permite la observación directa y la cuantificación de la proteína-DNA en células de E. coli vivas de Escherichia.

Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

visualizing-protein-dna-interactions-live-bacterial-cells-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.6K vistas.  University of Oxford.  Microscopía de localización fotoactivado (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula permite la observación directa y la cuantificación de la proteína-DNA en células de E. coli vivas de Escherichia. 

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Investigación

Inmunología e Infección

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Evaluación de la respuesta estomática de las células bacterianas en vivo utilizando imágenes de Hoja Entera

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualización de virus del dengue a través de Alexa Fluor etiquetado

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

La visualización de las respuestas inducidas por toxinas bacterianas mediante microscopía de fluorescencia de células en vivo

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC secreción de investigar la infección celular por el patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Multiplexado de alta resolución de imágenes de células T utilizando madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...