This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.

1. ADN biotinilación <ol><li> La biotinilación de ADN de extremos romos usando transferasa terminal (TdT) Nota: El uso de ADN T4 (166 kpb), que es un ADN de extremos romos. <ol><li> Añadir 5 l de 2,5 mM CoCl 2, 5 l de 10 x tampón de reacción, 0,5 l de 10 mM de biotina-11-dUTP, 0,5 l de transferasa terminal (10 unidades), y 0,5 l de ADN T4 (0,5 g / l) a la mezcla de reacción. Hacer a un volumen final de 50 l mediante la adición de 38,5 l de agua. </li><li> Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 1 hr. Nota: el tiempo de reacción extendido puede producir ADN de doble atado, es decir, es posible que biotinas etiquetados en ambos extremos. </li><li> Detener la reacción mediante la adición de 5 l de 0,5 M EDTA, pH 8. </li><li> Mantenga el tubo a 4 ° C. </li></ol></li><li> La biotinilación de DNA de composición pegajosa Uso de ADN ligasa Nota: El uso λ DNA (48,5 kpb), que es un ADN de extremo cohesivo. &lt;ol&gt; <li> Añadir 1 l de ADN ligasa de T4, 5 l de 10 x tampón de ligación, 1 l de 25 ng / l de ADN de fago λ, y añadir 43 l de agua para hacer un volumen final de 50 l. </li><li> Mantenga el tubo a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. La derivación de superficie funcionalizado Nota:. Con el fin de atar un extremo de una molécula de ADN en la superficie de vidrio, un grupo amina primaria se silanizada en un cubreobjetos, seguido de recubrimiento con biotina PEG como se muestra en la Figura 1 Este proceso PEGilación es importante para la formación de imágenes de ADN de una sola molécula porque puede reducir significativamente el ruido aleatorio creado por la unión de moléculas no deseadas en la superficie. <ol><li> Piranha limpieza Nota: Las soluciones Piranha reaccionan violentamente con materiales orgánicos, por lo que debe ser manejado con cuidado, siguiendo las directrices de seguridad adecuadas. <ol><li> Lugar cubreobjetos sobre una rejilla de politetrafluoroetileno (PTFE), y los mantienen by cinta de PTFE sello de rosca a lo largo, la mitad en el borde de las superficies y la otra mitad en el estante. Después de envolver, deje una pieza larga (~ 5 cm) de cinta para el manejo del soporte durante el procedimiento de limpieza. </li><li> Llenar un vaso de vidrio de 1 litro con 350 ml de H 2 SO 4 y 150 ml de H 2 O 2 para hacer la solución piraña en una campana de humos. Coloque la parrilla en solución Piranha durante 2 horas. </li><li> solución vacío piraña del vaso de precipitados, y cubreobjetos de enjuague a fondo con agua desionizada hasta que el pH del agua en el vaso alcanza neutro. Utilice tiras de papel de pH. </li><li> Sonicar los bastidores de cubierta se desliza en el agua vaso de precipitados que contiene, por 30 min. Vaciar el agua del vaso justo antes de amino silanización. Utilice 75 W de potencia de ultrasonidos para limpiar y derivar los sustratos de vidrio. </li></ol></li><li> Aminosilanization sobre la superficie de cristal <ol><li> Añadir 2 ml de N - [3- (trimetoxisilil) propil] etilendiamina y 10 ml de ácido acético glacial a 200 mlde alcohol metílico en un recipiente de polipropileno limpio para la preparación de la solución aminosilanization. </li><li> Colocar cubreobjetos limpios en el recipiente de polipropileno. Agitar ellos en 100 rpm y la temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Someter a ultrasonidos el vaso con cubreobjetos derivatizados durante 15 min a 75 W. los agita a 100 rpm y la temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. </li><li> Vaciar la solución del vaso de precipitados, y enjuague cubreobjetos con cuidado, una vez con alcohol metílico, y dos veces con alcohol etílico. cubreobjetos de las tiendas en alcohol etílico y los utilizan dentro de dos semanas. </li></ol></li><li> PEGilación del cubreobjetos <ol><li> Hacer 10 ml de bicarbonato de sodio 0,1 M (NaHCO 3). Se filtra la solución con un filtro de jeringa de 0,22-micras. </li><li> Disolver 2 mg de carbonato de biotina-PEG-succinimidilo (biotina-PEG-SC) y 80 mg de valerato de PEG-succinimidilo (mPEG-SVG) en 350 l de NaHCO3. Use un tubo de protección de la luz. </li><li> Vortex el tubo vigorosamente durante 10 seg, y se centrifuga al 10.000 × g durante 1 min para eliminar las burbujas. </li><li> Enjuague un portaobjetos de vidrio con acetona, seguido de un enjuague con alcohol etílico. Deje que el portaobjetos se seque al aire completamente. </li><li> Coloque una gota (50 l) de la solución de PEG en el portaobjetos de vidrio limpio. Cubrir la gotita suavemente con una hoja de la cubierta amino silanizada, sin generar burbujas. </li><li> Colocar los portaobjetos durante 3 horas hasta toda la noche en un lugar oscuro, bien nivelados cámara húmeda a temperatura ambiente. Utilice un soporte de la punta de la pipeta vacía como la cámara, con agua en la parte inferior. Sellar solución de PEG residual en el tubo y se mantiene a 4 ° C. </li><li> Enjuague el portaobjetos pegilado a fondo con agua desionizada. Almacenarlo en un lugar oscuro y seco hasta su uso. </li></ol></li></ol> 3. Montaje de una cámara de flujo <ol><li> Fabricar un soporte acrílico perforado, como en la Figura 2. Asegúrese de que el diámetro de la inserción de la tubería es 0,762 mm, y designar un agujero es una entrada y el otro esuna salida (Figura 2). </li><li> Coloque tiras adhesivas de doble cara de cinta (ancho 5-6 mm) en un soporte de acrílico (Figura 2), alineando perpendicularmente a un orificio de entrada y salida, no perturbar cualquier orificio del canal. Utilice estas tiras de cinta como las paredes de varios canales para hacer cámaras. Frote la cinta utilizando una punta de pipeta. </li><li> Colocar un cubreobjetos pegilado en la parte superior para hacer cámaras de flujo, con la cara hacia abajo pegilado. </li><li> Para evitar cualquier solución se produzcan fugas, presione la parte superior de un cubreobjetos sobre el área donde se colocan cintas de doble cara. Añadir pegamento de secado rápido epoxi para cerrar los bordes de la cámara en la parte superior y en la parte inferior (color amarillo en la Figura 2). </li><li> Conectar una pieza corta (2,5 cm) de tubo (diámetro externo, OD, 0,042 &quot;) a una jeringa hermética a los gases y sellar la unión con pegamento de epoxi. </li><li> Conectar un tubo largo y flexible (OD: 0,03 &quot;) a la tubería vinculada a la jeringa y sellar la unión con pegamento epoxi. </li><li> Llene el Tubing vinculada a la jeringa con agua DI. Asegúrese de que no hay burbujas de aire. </li><li> Introduzca el tubo en el orificio de la cámara de flujo sellado con pegamento de epoxi. </li><li> Coloque una punta amarilla (200 punta l) en el otro orificio como reservorio. </li></ol> 4. Carga de la muestra en la cámara de flujo Nota: Neutravidina se puede sustituir con otras proteínas avidina como la estreptavidina. Todas las reacciones pueden realizarse a temperatura ambiente, a menos que se menciona. Tome la solución de la muestra en una punta amarilla, e instalar la punta con la solución sobre el agujero del soporte de acrílico (Figura 2b). <ol><li> Ajuste el caudal de la bomba de jeringa a 50 l / min. Carga de 20 l de proteína de avidina (25 mg / ml en solución T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), y mantenerla durante 10 minutos. </li><li> Carga de 20 l de oligodesoxinucleótidos con biotina (100 micras en 1 x TE), y mantenerla durante 10 minutos. Si se utiliza transferasa terminal, no realice la cargade oligodesoxinucleótidos. </li><li> Carga de 20 l de solución de ADN a partir del paso 1 en la cámara de flujo a un caudal de 10 l / min, y mantenerla durante 30 minutos. </li><li> Se lava la cámara de flujo con 1 x TE, y la carga de 40 l de FP-PAD 10 (~ 80 nm). </li><li> Observe ADN bajo un microscopio de fluorescencia con flujo continuo de moléculas de tinción en 1 x TE en una lente de objetivo 60X. Utilice 488 nm láser de estado sólido para la excitación de FP -DBP (EGFP). Para estiramiento completo de moléculas de ADN, aplicar diferentes velocidades de flujo de acuerdo con las longitudes de ADN utilizados. Por ejemplo, se aplican 50 l / min durante 48,5 kpb de ADN λ, y 100 l / min durante 166 kpb de ADN T4. <ol><li> Para el reciclaje del soporte de acrílico, remojo cámaras de flujo montados en una solución de detergente doméstico 12. Retire las cintas y epoxi con una hoja de afeitar y frotar con las manos para tomar completamente apagado. Destapar los agujeros con agujas de jeringas. Mantener a los titulares en agua desionizada hasta su uso posterior. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Aquí presentamos una plataforma para la visualización de moléculas largas de ADN con biotina para el anclaje en las superficies. Hemos informado un enfoque para moléculas de ADN atados en una superficie recubierta de proteína de avidina con albúmina de suero bovino biotinilada. 6 En el enfoque anterior, se encontró una cuestión crucial de ADN foto-escisión causado por colorantes bis-de intercalación que manchan moléculas de ADN atado en el superficie. A medida que estos fluoróforos excitados continuamente tienen una alta probabilidad de atacar a un esqueleto de fosfato del ADN, 9 la potencia de luz de excitación se tuvo que reducir al mínimo para evitar la foto-escisión. A fin de superar este inconveniente, se desarrolló por ingeniería genética proteínas fluorescentes de unión al ADN con capacidad (FP-DBP) para el ADN de tinción sin foto-escisión. 10 Se observó tinción de ADN fiable sobre superficies de las proteínas recubiertas de avidina. No obstante, esta plataforma tenía otro problema de la agregación indeseable de las proteínas fluorescentes en elsuperficie de la proteína, lo que resulta en un aumento del ruido de fondo. Es esencial para reducir al mínimo este ruido aleatorio para análisis de ADN de una sola molécula para mejorar el contraste de ADN y las proteínas del fondo. El uso de FP-DBP por lo tanto requiere pasivación de la superficie para evitar que la proteína fluorescente de ser adsorbido en la superficie. PEG podría ser un potente candidato para este propósito. 12 Por lo tanto, hemos utilizado biotinilado-PEG, que mejora considerablemente la relación señal-ruido para las moléculas de ADN de imágenes FP-DBP teñidas atados en la superficie. Hay varios pasos críticos y notas de este método para rendimientos más altos. Con el fin de atar un extremo de una molécula de ADN en una superficie de vidrio, un grupo amina primaria se silanizada en un cubreobjetos, seguido de recubrimiento con biotina PEG como se muestra en la Figura 1. Este proceso de pasivación de la superficie es crítica para la formación de imágenes de ADN de una sola molécula porque puede reducir significativamente la adsorción al azar de generación de ruido en las superficies.Por lo tanto, se recomienda encarecidamente aminosilanization durante la noche y la PEGilación. Además, la limpieza de la lámina de vidrio, así como la cubierta de vidrio con solución Piranha puede reducir aún más el ruido de fondo. Un oligonucleótido biotinilado debe tener un grupo fosfato en el extremo 5 &#39;con el fin de vincularlo a 3&#39; grupo hidroxilo de una molécula de ADN grande. La secuencia de oligonucleótido biotinilado es 5&#39;-p-GGGCGGCGACCT-TEG-biotina-3 &#39;para la inmovilización de ADN λ. La solución de DNA λ tiene que ser cargado poco después de la preparación de solución de ADN λ (descrito en 1.1), porque λ DNA a menudo se forma concatemers con el almacenamiento de largo plazo. Para el ADN de extremos romos tal como ADN T4, transferasa terminal puede añadir dUTPs biotinilados en ambos extremos de ADN sin ninguna especificidad. Por lo tanto, el tiempo de reacción transferasa terminal tiene que ser ajustado con cuidado alrededor de una hora, de lo contrario la reacción extendido puede producir ADN de doble marcado (es decir, ambos extremos se marcan con biotina). en complementoition al ADN viral tal como λ y T4, cualquier tipo de ADN puede ser utilizado en esta plataforma. Sin embargo, se recomienda el uso de fragmentos de ADN genómico gigantesca después de la digestión por enzimas de restricción raros-cortador como SwaI o NotI. Diferentes velocidades de flujo se aplican para las diferentes longitudes de ADN. Por lo general, las moléculas de ADN más largas requieren velocidades de flujo más rápidas para estirar completamente las moléculas de ADN, para que coincida con la longitud exacta del contorno. Por ejemplo, λ DNA puede estirar hasta 16,5 micras, lo que corresponde al valor calculado de 0,34 nm x 48.502 pb. Es muy importante preparar recién todos los materiales, en particular todas las proteínas y PEG. Por ejemplo, Neutravidina pierde fácilmente su función de biotinas unión si se almacena como una solución diluida. Para las soluciones de PEG, el pH es crítico para conjugar grupos funcionales de una amina primaria y n-hidroxisuccinimida. Por lo tanto, se recomienda para preparar recién todos los materiales al menos cada semana. La visualización de grandes moléculas de ADN atados en la superficie es una plataforma versátil para ser aplicado para una variedad de aplicaciones tales como la genómica, epigenomics, estudios bioquímicos de ADN y la interacción de proteínas, y los estudios de la física de polímeros. Sin embargo, este enfoque está limitado sólo para modelar sistemas que utilizan moléculas de ADN relativamente simples y bien conocidos, tales como el genoma viral. Para ser ampliado con el genoma humano y el epigenoma, es muy importante establecer una plataforma robusta, fiable y sencilla para el uso práctico. Mediante la superación de la luz inducida por ADN foto-escote y evitar la adsorción de la proteína fluorescente al azar en la superficie, por lo tanto, esta plataforma proporciona imágenes claras y de alto contraste de ADN alargado con flujos de cizalla.

La visualización de grandes moléculas de ADN atados en superficies de vidrio o de talón se ha utilizado para la investigación de las interacciones ADN-proteína, la dinámica de proteínas sobre un sustrato de ADN, 1,2 y física de polímeros. 3,4 Una plataforma para grandes moléculas de ADN de una sola atados tiene unos pocos distinta ventajas en comparación con otros métodos de inmovilización de ADN. 5 en primer lugar, una molécula de ADN grande atado en la superficie tiene una conformación aleatoria bobina natural sin un flujo de cizallamiento, que es de importancia crítica para una proteína de unión a ADN de reconocer su sitio de unión. En segundo lugar, es muy fácil cambiar el entorno químico alrededor de moléculas de ADN para una serie de reacciones enzimáticas en una cámara de flujo. En tercer lugar, un flujo de cizallamiento de microfluidos induce ADN molecular de estiramiento hasta 100% de la longitud del contorno completo, lo cual es muy difícil de lograr con la elongación del ADN enfoques alternativos como la inmovilización superficie 6 y el confinamiento nanochannel. 7 A completamente stretched molécula de ADN también proporciona información de posición que puede ser útil para el seguimiento de los movimientos enzimáticas en el mapa genómico. Sin embargo, el procedimiento de anclaje del ADN tiene un defecto crítico en que el colorante de intercalación tales como el YOYO-1 por lo general hace que las moléculas de ADN atados a ser fácilmente rotas por la luz de excitación de fluorescencia. En general, las grandes moléculas de ADN tienen que ser teñido con un tinte fluorescente para la visualización en un microscopio fluorescente. Para este fin, otros colorantes de la serie TOTO YOYO-1 o son principalmente usados ​​debido a que estos tintes son fluorescentes solamente cuando se intercalan DNA de doble cadena. 8 Sin embargo, es bien sabido que los bis-intercalantes colorante hace DNA inducida por la luz de foto-escisión porque de la intercalación de fluoróforos. 9 Además, las moléculas de ADN fluorescente manchadas atados en la superficie son más frágiles puesto que los flujos de cizallamiento pueden ejercer fuerzas de rotura en mover libremente moléculas de ADN. Por lo tanto, hemos desarrollado FP-PAD como una novela DNA-tinción de colorante de proteínas para obtener imágenes de grandes moléculas de ADN atados en la superficie. La ventaja de usar FP-DBP es que no causa foto-escisión de las moléculas de ADN al que se une. 10 Además, FP-DBP no aumenta la longitud de contorno de ADN, mientras que los colorantes bis-intercalantes aumentan la longitud de contorno en aproximadamente 33%. Este método de vídeo introduce el enfoque experimental para la inmovilización de grandes moléculas de ADN a una superficie de PEG-biotina. La figura 1 ilustra los diferentes enfoques de la inmovilización de ADN con extremos romos y extremos pegajosos. Por lo tanto, este método de tinción se puede aplicar a cualquier tipo de molécula de ADN. La figura 2 muestra una representación esquemática del conjunto de cámara de flujo que puede ser controlado por una bomba de jeringa para generar flujos de cizallamiento para estirar las moléculas de ADN, así como para carga química y enzimática soluciones. la Figura 3 muestra micrografías de las moléculas de ADN completamente estirada atados en el PEGylated superficie 11 y se tiñeron con FP-PAD.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1. DNA Biotinylation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP is also available</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Provided with 10x reaction buffer</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Also available at New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2. Functionalized Surface Derivatization&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.1) Piranha Cleaning&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness</td></tr><tr><td>Teflon rack</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>PTFE Thread Seal Tape</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon&amp;trade; tape</td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 95% Purity</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 35% in water</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Table-top Ultrasonic Cleaner</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.2) Aminosilanization on Glass Surface&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]&lt;br/&gt; ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Methyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>M300318</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td>Polypropylene Container</td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300202</td><td>99.9% Purity</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.3) PEGylation of the coverslip&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300129</td><td>99% Purity</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;3. Assembling a Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Acrylic Support</td><td></td><td></td><td>Custom Fabrication</td></tr><tr><td>Double-sided Tape</td><td>3M</td><td></td><td>Transparent type</td></tr><tr><td>Quick-dry Epoxy</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Gas Tight 250 &amp;micro;l Syringe</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;4. Sample Loading into Flow Chamber&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Trizma base</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state Laser (488&amp;nbsp;nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of surface-tethered large dna molecules with a fluorescent protein dna binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

La figura 1 muestra dos métodos de inmovilización de ADN diferentes en función de las estructuras terminales de la molécula de ADN. La Figura 1a ilustra cómo las moléculas de ADN de extremos pegajosos se hibridan con oligonucleótidos biotinilados complementarios, que están inmovilizados en la superficie PEG avidina-revestido. La Figura 1B muestra la adición de biotinilado ddNTP o dNTP para el grupo hidroxilo 3 &#39;de un ADN de extremos romos por transferasa terminal. Añadimos enlazadores flexibles entre moléculas de ADN y la biotina. Esto aumentó la eficacia de la unión de ligación y avidina-biotina para proporcionar espacio suficiente para las reacciones. La Figura 1C muestra la representación esquemática general para la inmovilización de ADN en la superficie PEG avidina-revestido. La figura 2 representa el conjunto de la cámara de flujo a lo largo con un soporte de acrílico. En comparación con glass / gafas de diapositivas de cuarzo, un soporte acrílico hecho a medida simplifica la preparación de la cámara de flujo para la microscopía de epi-fluorescencia. 12 La cámara de flujo permite el cambio instantáneo de las condiciones del tampón para reacciones enzimáticas, 6 y estiramiento de moléculas de ADN. La Figura 3 muestra de ADN-atado sola y T4 λDNA teñido con FP-PAD. cizalla de microfluidos flujos de moléculas individuales de ADN alargadas hasta longitudes de contorno completos, que incluyen 16,5 m (48,5 kb de ADN λ x 0,34 nm) y 56,4 micras (166 kb de ADN T4 x 0,34 nm). Hemos sido capaces de repetir ADN de estiramiento y relajación varias veces durante un período prolongado (por ejemplo, media hora), ya que hemos utilizado FP-PAD que no causa foto-escote. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54141/54141fig1.jpg" /> Figura 1. Representación esquemática de la inmovilización del ADN. a) sADN de punta ticky se hibrida con un oligonucleótido complementario biotinilado. Trietilenglicol es un enlazador flexible entre el oligonucleótido y biotinilado dNTP se añade a un extremo romo de ADN de doble cadena, por transferasa terminal biotina. B). Spacer Policarbono (11 átomos) es un enlazador flexible entre dNTP y biotina. C) ADN biotinilado está anclada a una proteína avidina, que está vinculada a un PEG biotinilado unido covalentemente a la superficie de vidrio. La proporción de PEG con biotina con PEG normal fue de 0,025 (1:40). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54141/54141fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54141/54141fig2.jpg" /> Figura 2. Cámara de flujo. a) Cámara de flujo consiste en un soporte de resina de ácido acrílico, tiras de cintas de doble cara y una hoja de cubierta pegilado. El titular de acrílico de dimensiones de 76 mm x 26 mm x 5 mm (L x W x H), se fabricó con corte por láser b) Vista lateral de la cámara de flujo:. Orificios perforados son un orificio de entrada en la que se instala una punta amarilla por un depósito de regulación, y un orificio de salida que está conectado a un tubo controlado por una jeringa de la bomba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54141/54141fig2large.jpg" target="_blank">por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54141/54141fig3.jpg" /> Figura 3. Imágenes microscópicas fluorescentes de moléculas de ADN estirados teñidas con FP-PAD. a) el ADN del bacteriófago λ (48,5 kbp), atado en la superficie después de la ligación con los oligonucleótidos complementarios biotinilados. b) DNA del bacteriófago T4 (166 kpb) atado en la superficie después de la adición de biotina con transferasa terminal. flechas indicadas muestran molecul ADNes estiran hasta sus longitudes de contorno completo tal como 16,5 micras para DNA λ y 56,4 micras para el ADN T4. Las barras de escala:. 10 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54141/54141fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

visualization-surface-tethered-large-dna-molecules-with-fluorescent

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K vistas.  Sogang University. We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows. 

Video: Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Investigación

Bioquímica

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genética

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Inmunología e Infección

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Biología

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

Superficie-Inmovilización funcional de Genes utilizando litografía de desplazamiento de varias fases de la cadena

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Bioingeniería

<meta charset="utf8"></head><body>Reconstitución de nucleosomas in situ para estudios de moléculas individuales

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Reconstitución eficiente de nucleosomas para técnicas de molécula única

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

<meta charset="utf8"></head><body>Desenrollamiento del ADN mediado por CMG observado por el crecimiento del tracto ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Desentrañando la dinámica de la replicación del ADN eucariota a través de la visualización de una sola molécula

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

La visualización de atado-gran superficie moléculas de ADN con un ADN Fluorescent Protein unión del péptido

Resumen

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Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada

Superficie-Inmovilización funcional de Genes utilizando litografía de desplazamiento de varias fases de la cadena

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase