نحن نعترف جوستين بينكني ويوهانس Hohlbein للمساعدة في بناء المجهر مفصل وشيموس هولدن لتوطين البرمجيات. رودريغو رييس-اموث والشكر لتوفير E. سلالة القولونية. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل الأوروبي الإطاري السابع جنة برنامج المنح FP7/2007-2013 HEALTH-F4-2008-201418، UK التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث غرانت BB/H01795X/1، ومنحة مجلس البحوث الأوروبي 261227 لANK. وقد تم تمويل DJS بواسطة منحة WT083469 برنامج يلكوم ترست. وأيد SU بواسطة زمالة الدكتوراه ماثووركس.

<ol>
	<li>Friedberg, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Repair and Mutagenesis. , (2006).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+spatial+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer spatial resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy.">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li><li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), (2011).</li><li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li><li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria.">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (20), 8063-8068 (2013).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells.">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133 (1), 90-102 (2008).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J. Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li><li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies.">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 179 (1), 298-310 (1996).</li><li>Holden, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+limits+of+single+molecule+FRET+resolution+in+TIRF+microscopy.">Defining the limits of single molecule FRET resolution in TIRF microscopy.</a> Biophys. J. 99 (9), 3102-3111 (2010).</li><li>Holden, S. J., Uphoff, S., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAOSTORM:+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy.">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 8 (4), 279-280 (2011).</li><li>Wieser, S., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+in+the+live+cell+plasma+membrane-Do's+and+Don't's.">Tracking single molecules in the live cell plasma membrane-Do's and Don't's.</a> Methods. 46 (2), 131-140 (2008).</li><li>Arnauld, S., Nicolas, B., Herv&#233;, R., Didier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protoc. Exch. , (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. (11), 555-565 (2009).</li><li>Elmore, S., M&#252;ller, M., Vischer, N., Odijk, T., Woldringh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking+of+oriC-GFP+fluorescent+spots+during+chromosome+segregation+in+Escherichia+coli.">Single-particle tracking of oriC-GFP fluorescent spots during chromosome segregation in Escherichia coli.</a> J. Struct. Biol. 151 (3), 275-287 (2005).</li><li>Badrinarayanan, A., Reyes-Lamothe, R., Uphoff, S., Leake, M. C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+architecture+and+action+of+bacterial+Structural+Maintenance+of+Chromosome+proteins.">In vivo architecture and action of bacterial Structural Maintenance of Chromosome proteins.</a> Science. 338 (6106), 528-531 (2012).</li></ol>

يعلن الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

نناقش العديد من الاعتبارات الرئيسية لنجاح التجربة. الاختيار والتعبير عن بروتين فلوري الانصهار: هناك لوحة كبيرة من البروتينات الفلورية photoactivatable وphotoswitchable 17. الخيار محدد يعتمد على خصائص المجهر، وخاصة أجهزة الليزر والفلاتر المتاحة. الجمع بين 405 نانومتر و 561 نانومتر هو المثل الأعلى للالبروتينات الفلورية photoactivatable المشتركة. اخترنا PAmCherry 6 لأنه لم تظهر أي أحادى والتجميع في الخلايا. علاوة على ذلك، لا رجعة فيه تنشيط ضوئي يسمح إحصاء عدد fluorophores تفعيلها لقياس أعداد نسخة البروتين في الخلية. بدلا من التعبير عن البروتين الانصهار من البلازميد، ونحن نفضل الإدراج الكروموسومات من ترميز الجين للبروتين الانصهار في البرية من نوع مكان. وهذا يضمن استبدال كامل للبروتين في المصالح مع الفلورسنت هاءrsion والحفاظ على النوع البري مستوى التعبير. معدل تنشيط ضوئي: من المهم لضبط معدل تنشيط ضوئي بحيث جزيء في المتوسط ​​أقل من واحد لكل خلية في حالة الفلورسنت في أي إطار من الفيلم. هذا يعتمد على كثافة 405 نانومتر، وغادر عدد من الجزيئات ليتم تفعيلها. بكثافات التصوير منخفضة جدا، ومع ذلك، سيتم تصويرها ليس كل جزيئات قبل نهاية الفيلم أو الأفلام الطويلة جدا لا بد من الحصول عليها. عدد الإطارات المسجلة في الفيلم يعتمد على عدد نسخة من البروتينات الانصهار لكل خلية ومتوسط ​​photobleaching من عمر PAmCherry في ظروف الإثارة المستخدمة. عدد نسخة من Pol1 هو ~ كان 400 الجزيئات / خلية 1 والقيمة المتوسطة للتوزيع الأسي photobleaching من العمر ~ 4 إطارات. عن طريق زيادة كثافة تدريجيا 405 نانومتر، وتوزع بالتساوي على تفعيل الأطر 10،000 من الفيلم. لذلك، كل خلية هو OCCUPالعبوات الناسفة بواسطة جزيئات الفلورسنت لما مجموعه 1،600 ~ الإطارات، وضمان تداخل قليلا من PSFS ومضاعفات تتبع في فيلم من 10،000 الإطارات. وقت التعرض والإثارة شدة: قبل كل شيء، وأوقات التعرض بحاجة إلى أن تكون قصيرة بما فيه الكفاية لمراقبة PSFS حادة مع الحركة قليلا وضوح. ومع ذلك، ينبغي اختيار معدل الإطار لانتاج الحركة الجزيئية يمكن ملاحظتها بين الإطارات المتعاقبة وراء عدم اليقين التعريب، وإلا تضيع الفوتونات حاسمة من قبل الإفراط المسار. يجب أخذ عينات من حركة الجزيئات غير منضم في فترات زمنية طويلة بما فيه الكفاية لتكون مميزة بوضوح من الحركة واضح من جزيئات ملزمة نظرا لعدم اليقين التعريب. عندما يتم تعيين وقت التعرض، ويجب أن تعدل شدة قوات الأمن الفلسطينية. دقة الترجمة من قوات الأمن الفلسطينية يزيد مع عدد من الفوتونات الكشف خلال مدة إطار. شدة الإثارة أعلى زيادة معدل بو الفوتونر أيضا معدل photobleaching من وإشارة الخلفية. استخدام أقل شدة الإثارة التي تعطي دقة التعريب المطلوب. لPol1-PAmCherry اخترنا 15.26 مللي ثانية / الإطار و 3.5 ميغاواط 561 نانومتر الإثارة (400 واط / سم 2). من المهم لتأكيد بقاء الخلية لظروف التصوير خاصة من خلال رصد نمو الخلايا والتشكل قبل وبعد الحصول على البيانات (انظر معلومات تكميلية في أبهوف وآخرون. 7). Pol1 يسلك وقت ملزم لل~ 2 ثانية إلى ركيزة الحمض النووي في الجسم الحي شق 7، وبالتالي فإننا نتوقع أن غالبية الجزيئات إما أن يكون في الدولة منضم أو غير منضم لمدة كاملة من مسار. جزيئات ملزمة تظهر متحركة أساسا لمواقع كروموسوم لها معامل الانتشار عدة أوامر من حجم أقل (~ 10 -5 2 ميكرون / ثانية، إلمور وآخرون 18) من Pol1 نشرها في السيتوبلازم (~ 1 ميكرون 2 </sتصل&gt; / ثانية). تحليل نشر: يتم حساب معامل الانتشار D واضح * من MSD من المسارات الفردية، بمعدل متوسط ​​أعلى من الحد الأدنى من 4 خطوات (5 إطارات) لتقليل الخطأ الإحصائي. نلاحظ أن ~ 75٪ من جزيئات التبييض في غضون اقل من 5 إطارات لظروف التصوير وصفها. هذه المسارات القصيرة لا توفر اليقين إحصائية كافية لتمييز جزيئات منضم وغير منضم. ومع ذلك، فإن الكسور النسبية للجزيئات منضم وغير منضم أن يقدم تقريرا عن نشاط البروتين تكون مستقلة عن عدد من المسارات تحليلها. ومن المفيد لحساب الخطأ PSF التعريب (σ الموضع) في حساب D * لأن عدم اليقين يضيف خطوة عشوائية واضحة لتوطين كل جزيء 15. لتحسين تصنيف الجزيئات مقيدة ونشرها، نوصي حساب D * بوتح من التشريد خطوة واحدة وتشريد أكثر من مرة من إطارين. فمن الممكن بعد ذلك إلى تعيين اثنين منفصلة D عتبات *: D * (15 ميللي ثانية) &lt;0.15 ميكرومتر 2 / ثانية وD * (30 ميللي ثانية) &lt;0.075 ميكرون 2 / ثانية. لاحظ أن D * هو معامل الانتشار الواضح أن يتأثر الحبس خلية من المسارات وعدم وضوح الحركة بسبب نشرها خلال فترة التعرض. لاستخراج دقيق معاملات نشر متحيز، وقد ثبت أنه من المفيد أن نقارن الحركة لاحظ أن البيانات محاكاة بناء على مؤشر ستوكاستيك البراونية نموذج الحركة 5،7. ويمكن أيضا أن تستخدم البيانات محاكاة لاختبار إجراءات تحليل البيانات. التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة: نحن وصف نهج عام لتصور وقياس التفاعلات الحمض النووي البروتين في الجسم الحي بواسطة التغيير في التنقل من البروتين على ملزما للكروموسوم. أنشطة الحمض النووي أوالبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي المشاركة في إصلاح، والنسخ، والنسخ، وصيانة كروموسوم بالتالي يمكن اتباعها في الوقت الحقيقي على مستوى خلية واحدة مع دقة مكانية أقل من الحد الحيود الضوئية. Photoactivated تتبع جزيء واحد يمتد أساليب تتبع التقليدية التي تقتصر على عدد قليل من الجزيئات المسماة لكل خلية. طريقة بديلة الذي يقيس الانتشار الجزيئي في الجسم الحي هو الإسفار الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP). في حين FRAP مفيد جدا لقياس خصائص الانتشار العالمي في الخلايا الكبيرة، هي محدودة في قدرتها على حل العديد من الأنواع الجزيئية مع التنقلات المختلفة في بيئة غير متجانسة مكانيا، وخاصة بالنسبة للخلايا البكتيرية الصغيرة. لقد طبقنا photoactivated واحدة جزيء تتبع لقياس أنشطة الحمض النووي ملزم وتعريب التحت خلوية من مجموعة من البروتينات المختلفة في E. القولونية بما في ذلك Pol1، يغاز DNA والبروتين الجبهة الاسلامية للانقاذ، والحمض النوويالبلمرة الثالث 7، وكذلك الصيانة الهيكلية للبروتينات الكروموسومات MukB، E، F و19. نحن نتوقع ويمكن أيضا طريقة أن تتكيف مع أنواع الخلايا الأخرى.

يصف هذا البروتوكول في القياس المباشر للتفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا الحية القولونية. تقنية تستخدم التغيير في معامل الانتشار من بروتين واحد fluorescently المسمى لأنه يربط كروموسوم (الشكل 1). للتدليل على أسلوب ونحن نستخدم الحمض النووي بوليميريز الأول (Pol1)، وهو بروتين الحمض النووي ملزم تنميط الذي يملأ الفجوات في النسخ المتماثل الحمض النووي حبلا متخلفة ومسارات إصلاح الختان 1. ظهور فائقة الدقة مضان المجهري تمكن التصور من الهياكل الجزيئية في الخلايا مع قرار نانومتر. Photoactivated توطين مجهرية (النخيل) توظف البروتينات الفلورية التي يمكن تفعيلها من حالة الظلام الأولية إلى حالة الفلورسنت (الشكل 2). فقط يتم تنشيط مجموعة فرعية من جميع الجزيئات المسمى في أي وقت لتحديد مواقفهم بطريقة متسلسلة، بصرف النظر عن ركان مجموع تركيز الجزيئات المسمى في العينة 2. الدقة في الترجمة جزيء يعتمد بشكل رئيسي على حجم الفلورسنت وظيفة نقطة انتشار (قوات الأمن الفلسطينية)، وعدد من الفوتونات التي تم جمعها، وإشارة الخلفية 3. تركز العديد من التطبيقات لهذه الطريقة على تحسين التصور من الهياكل الخلوية. إدراك أن النخيل يمكن دمجها مع واحدة جزيء تتبع 4 فتحت آفاقا جديدة لمتابعة مباشرة لحركة الأرقام التعسفي من البروتينات وصفت في الخلايا الحية. زيادة الحساسية والقرار الزماني من المجاهر مضان الآن تسمح تتبع واحد نشرها البروتينات الفلورية في السيتوبلازم البكتيري 5. هنا، ونحن توظيف PAmCherry، وهو بروتين فلوري هندسيا الذي يحول بشكل لا رجعة فيه من حالة nonfluorescent الأولية إلى حالة الفلورية على التشعيع مع 405 نانومتر ضوء 6. يمكن fluorophores PAmCherry تفعيلها تكون الصورةد بواسطة الإثارة في 561 نانومتر، وتعقب لعدة إطارات حتى photobleaching من. علينا أن نظهر قدرة طريقة لتحديد الأحداث الحمض النووي ملزم عابرة للبروتينات واحدة باستخدام مزيج من Pol1 وPAmCherry. علاج الخلايا مع methanesulfonate الميثيل (MMS) يسبب الضرر DNA مثيلة التي تحولت إلى ركائز الحمض النووي شق من الانزيمات إصلاح قاعدة الختان. يظهر لدينا وسيلة واضحة ملزمة للجزيئات Pol1 واحد ردا على الضرر MMS 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1444">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">E.coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:477px;"></td>
			<td style="width:467px;">created by Lambda-Red recombination</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM amino acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM vitamins</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11120-052</td>
			<td>minimal medium supplement</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-3100</td>
			<td>certified molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>BB024060SC</td>
			<td style="width:467px;">remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methyl methanesulfonate (MMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>129925</td>
			<td>CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PALM setup</td>
			<td>home-built</td>
			<td></td>
			<td>described in Uphoff et al. 2013</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>for data analysis and visualization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Localization software</td>
			<td style="width:187px;">custom-written, available online</td>
			<td>http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html</td>
			<td style="width:467px;">MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al. 2010 if used in publication.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tracking software</td>
			<td>available online</td>
			<td><a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a></td>
			<td style="width:467px;">MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker &#38; Grier 1996 if used in publication.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein-dna interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking

تفاعلات الحمض النووي البروتين هي في قلب العديد من العمليات الخلوية الأساسية. على سبيل المثال، تخضع تكرار الحمض النووي، والنسخ، والإصلاح، وتنظيم كروموسوم من البروتينات الحمض النووي ملزم بأن تعترف هياكل الحمض النووي محددة أو تسلسل. ساعدت في المختبر تجارب لتوليد نماذج مفصلة عن وظيفة العديد من أنواع البروتينات الحمض النووي ملزم، ولكن ، والآليات الدقيقة لهذه العمليات وتنظيمها في بيئة معقدة من الخلايا الحية تظل أقل بكثير من المفهوم. قدمنا ​​مؤخرا طريقة لقياس أنشطة إصلاح الحمض النووي في الخلايا القولونية الحية باستخدام Photoactivated توطين مجهرية (النخيل) جنبا إلى جنب مع تتبع جزيء واحد. ويحدد لنا النهج العام الأحداث الحمض النووي ملزم الفردية عن طريق التغيير في التنقل من بروتين واحد على ارتباط مع الصبغي. جزء من جزيئات منضم يوفر مقياس كمي المباشر للفعل البروتينivity وفرة من ركائز أو مواقع الربط على مستوى خلية واحدة. هنا، نحن تصف مفهوم الأسلوب وإظهار إعداد العينات، والحصول على البيانات، وإجراءات تحليل البيانات.

ويتضح مفهوم photoactivated واحدة جزيء تتبع لدراسة التفاعلات الحمض النووي البروتين في الجسم الحي في الشكل 1. تم الكشف عن PAmCherry البروتينات الانصهار في حي E. الخلايا القولونية بطريقة متسلسلة حسب photoactivating الجزيئات واحدة عشوائيا مع 405 نانومتر ضوء على تردد جزيء أقل من واحد لكل خلية في كل مرة. يتم تصوير جزيئات المنشط تحت المستمر 561 نانومتر الإثارة. يمكن تتبع حركة الجزيئية في الخلية من خلال ربط تعريب قريب في سلسلة من الإطارات حتى photobleaching من لا رجعة فيه. لأنه تباطأ انتشار البروتينات الحمض النووي ملزم ملزم على الكروموسوم، ومعامل الانتشار الواضح D * تم الحصول عليها لكل مسار تقارير مباشرة على الفرد التفاعلات الحمض النووي البروتين. يوضح الشكل 2 تنشيط ضوئي من Pol1-PAmCherry البروتينات الانصهار في حي E. الخلايا القولونية. تأثير كثافة 405 نانومتر سن يمكن أن ينظر إلى كثافة جزيئات الفلورسنت في الشكل 4. لاحظ أنه لا يتم تحديد كثافة فقط من كثافة 405 نانومتر ولكن بالإضافة إلى ذلك من قبل عدد من الجزيئات التي تتوفر لتفعيل؛ يتم استنفاد تجمع من جزيئات المتبقية على مدار فيلم النخيل. يتم إجراء تحليل التعريب لكل إطار من الفيلم النخيل كما هو موضح في الشكل 5. قمنا بقياس دقة الترجمة باستخدام جزيئات قادرة على الحركة في الخلايا أو الجزيئات ثابتة ملزمة في الخلايا الحية. أعطى إعدادات تملكنا دقة توطين σ الموضع = 40 نانومتر، وذلك بالاتفاق مع التنبؤ النظري 3. مما أدى إلى تعريب Pol1 تحتل المنطقة الوسطى من الخلية (الشكل 6A)، تلخص على نطاق واسع في التنظيم المكاني للE. القولونية نوواني 7. غالبية Pol1 المسارات في الخلايا التالفة عرض المتنوعةالانصهار كما هو مبين في الشكل 6C. خلية نموذجي يحتوي على عدة مئات من المسارات Pol1 (الشكل 6D)، بما يتفق مع عدد نسخة من حوالي 400 جزيئات في Pol1 E. القولونية الخلية 1 أرقام 6B و 6E-F توفير التوجيه بشأن اختيار مناسبة المعلمة نافذة تتبع - إذا كان إطار تتبع كبير جدا، هم أكثر عرضة لتصبح مرتبطة بشكل خاطئ إلى مسار جزيئات مختلفة، وإذا كان إطار تتبع صغير جدا، والمسارات مع الخطوات تعد وسيتم تقسيم. منحنى MSD لPol1 يرتفع خطيا للمرة تأخر قصيرة والتشبع في بعض الأحيان تأخر وقتا أطول بسبب زنزانة حبس (الشكل 6G). يمكن التعرف على أنواع مختلفة من الحركة الجزيئية عن طريق تحليل MSD. الحركة الموجهة يعطي منحنى مكافئ؛ يتميز الحركة البراونية من خلال خط مستقيم، ومنحنى الانتشار يقتصر تصل إلى الهضبة؛ إزاحة منحنى MSD للجسيمات قادرة على الحركة يمثل لترعدم اليقين ocalization (الشكل 6H). معلومات إضافية عن واحد الجسيمات تتبع واستكشاف الأخطاء وإصلاحها نصائح يمكن العثور عليها في أرنولد وآخرون 16 طبقنا سابقا طريقة لقياس النشاط الحمض النووي إصلاح Pol1 ردا على الخارجية الضرر ألكلة الحمض النووي 7. وD * الرسم البياني للPol1 المسارات في الخلايا التالفة يظهر السكان المهيمن نشرها جزيئات (أرقام 7A-C). جزء صغير من 2.7٪ جزيئات Pol1 المربوطة المرجح تشارك في النسخ المتماثل حبلا المتخلفة وإصلاح الحمض النووي من التلف الذاتية. تحت المستمر الضرر 100 ملي MMS، سكان المسارات مع D * ~ 0 ميكرون الزيادات 2 / ثانية إلى 13.8٪ (الشكل 7D). وتمثل هذه المسارات جزيئات Pol1 الأفراد الذين يؤدون إصلاح الحمض النووي التوليف لملء الفجوات واحد النوكليوتيدات كجزء من مسار إصلاح قاعدة الختان. مواقف المسارات المربوطة تظهر مواقع الفرديةالحمض النووي من التلف ومواقع الإصلاح (الشكل 7E-F). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" width="300" /> الشكل 1. تمثيل رسومي للأسلوب. (A) والبروتين PAmCherry الفلورسنت يمكن photoactivated من دولة nonfluorescent الأولي عند التعرض للضوء 405 نانومتر. الدولة مشرق هو متحمس في 561 نانومتر، وتنبعث مضان حوالي 600 نانومتر حتى التبييض fluorophore لا رجعة فيه. (ب) التحكم في معدل تنشيط ضوئي يسمح التصوير فقط واحدة عشوائيا تنشيط البروتين PAmCherry الانصهار لكل خلية في أي وقت في حين أن مجموعة كبيرة تعسفا من الجزيئات التي لم يتم تفعيلها أو تم بالفعل ابيض بقايا في حالة الظلام. (C) يتم تحديد الموقف من جزيء نيون من مركز قوات الأمن الفلسطينية المعزولة و TRacked لعدة إطارات حتى photobleaching من. وتسجل (D) المسارات من العديد من الجزيئات بطريقة متسلسلة. (EF) تفاعل بروتين ملزمة الحمض النووي مع تسلسل الهدف الكروموسومات أو هيكل توقف حركة ناشر عشوائي. تتميز جزيئات منضم وغير منضم من قبل معامل الانتشار الواضح D * المستخرجة من المسارات واحد. الكسر الناتج عن الجزيئات المربوطة يعطي مقياس كمي لنشاط بروتين ملزمة الحمض النووي في الجسم الحي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" width="600" /> الشكل 2. تنشيط ضوئي من Pol1-PAmCherry في حي E. الخلايا القولونية. أشرطة النطاق: 1 ميكرون. يتم عرض الخطط تحت كل لوحة. (<html> أ) المنقولة صورة المجهر الضوئي من الخلايا ثبتوا على وسادة الاغاروز. (B) Phototactivating على fluorophore PAmCherry واحد في خلية واحدة. (C) وارتفاع معدل تنشيط ضوئي يزيد من عدد الجزيئات الفلورسنت. (D) PAmCherry المتكاملة مضان من فيلم النخيل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig3highres.jpg" width="400" /> الرقم 3. التخطيطي من الحد الأدنى من الإعداد لPALM photoactivating وPAmCherry التصوير الانصهار البروتينات D1: مرآة مزدوج اللون (على سبيل المثال 550 نانومتر تمريرة طويلة). D2: مرآة مزدوج اللون (على سبيل المثال 570 نانومتر تمريرة طويلة). L1: عدسة الموازاة. L2: عدسة النقل البري الدولي. L3: عدسة أنبوب.1177/51177fig3highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" width="500" /> الشكل 4. صور ممثل عن فيلم النخيل مع 15.26 مللي ثانية / الإطار أشرطة النطاق: 1 ميكرون. (A) الصورة المنقولة ضوء الخلايا يجمد على وسادة الاغاروز. (ب) صورة خلفية الظلام يقاس على الكاميرا EMCCD مع الليزر مغلقا. (C) صورة خلفية الإثارة في ظل استمرار الإثارة 561 نانومتر قبل تنشيط ضوئي. (DF) زيادة كثافة 405 نانومتر يؤدي إلى ارتفاع معدلات تنشيط ضوئي من PAmCherry، تصوير تحت المستمر 561 نانومتر الإثارة. وتظهر المناطق محاصر تضخيم أدناه. (D) قليلة 405 نانومتر شدة (&lt;1 μW) نشاطا عدد قليل جدا من جزيئات الفلورسنت في مجال الرؤية. (E) متوسطة 405النتائج كثافة نانومتر (~ 2 μW) تنشيط ضوئي في كثافة PSF جيدة لتوطين وتحليل تتبع. (F) العالي الكثافة 405 نانومتر (~ 10 μW) ينشط أكثر من جزيء نيون في بعض الخلايا، مما يحجب التعريب وتحليل تتبع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" width="500" /> الرقم 5. التوضيح التحليل التعريب. أشرطة النطاق: 1 ميكرومتر (A) الفرقة تمرير تصفية يزيل الضوضاء بكسل زائفة ويسطح التدرجات كثافة عبر مجال الرؤية. (ب) يتم تحديد PSFS المرشح في الصورة التي تمت تصفيتها استنادا إلى عتبة المعرفة من قبل المستخدم التي يتم اختيارها لتقليل المكتشفة الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة. وthreshoدينار يتوافق مع الحد الأدنى للكثافة بكسل مرشح مقسوما على خلفية انحراف معياري (نسبة الإشارة إلى الضوضاء، SNR). (C) ومحليا ألمع بكسل الذي يمر يخدم عتبة كما تخمين توطين الأولية (عبر البرتقال) لصالح جاوس بيضاوي الشكل ثنائي الأبعاد. أشرطة النطاق: 0.5 ميكرون. فائقة الدقة الناتجة التعريب (الصليب الأزرق) يبلغ متوسط ​​دقة σ الموضع = 40 نانومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" width="500" /> . الرقم 6 توضيحات من التحليل تتبع أشرطة النطاق: 1 ميكرون. (أ) جميع تعريب الكشف من Pol1-PAmCherry في زنزانة سبيل المثال. (ب) عدد من المسارات كشفإد في الخلية سبيل المثال بوصفها وظيفة من النافذة تتبع. نوافذ صغيرة تتبع مسارات تقسيم الجزيء، الأمر الذي يؤدي إلى مصطنعة عدد كبير من المسارات. خط متقطع يدل خيارنا للمعلمة نافذة تتبع (0.57 ميكرون، 5 بكسل) - وهذا يعطي حلا وسطا جيدا بين الكشف عن التوزيع الكامل من الخطوات والحفاظ على مسارات مختلفة من الجزيئات سليمة. (C) المسار مثال واحد جزيء Pol1-PAmCherry. (D) جميع المسارات قياس هو مبين في ألوان عشوائية. (E) التحف تتبع إذا ما تم اختيار إطار تتبع كبيرة جدا (0.8 ميكرومتر هنا، 7 بكسل) أو كثافة PSFS في الإطار مرتفع جدا. (F) توزيعات تراكمية من أطوال خطوة للنوافذ تتبع: 0.34 ميكرومتر (3 بكسل، خط أحمر)، 0.57 ميكرون (5 بكسل، الخط الأزرق)، و 0.80 ميكرون (7 بكسل، الخط الأخضر). لاحظ أن الإطار تتبع 0.34 ميكرون يقطع خطوات أطول من 0.34 ميكرون التي من الواضحباقتطاع التوزيع الكامل من الخطوات. بالكشف عن إطار تتبع 0.57 ميكرون تقريبا نفس التوزيع من الخطوات كما يفعل نافذة تتبع 0.80 ميكرون. منحنى (G) MSD يظهر نشر تقتصر من Pol1. منحنيات (H) تخطيطي للMSD الحركة الموجهة والحركة البراونية، نشر المحصورة، والجزيئات قادرة على الحركة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" width="500" /> الرقم 7. القياس المباشر للنشاط إصلاح الحمض النووي من Pol1 في حي E. القولونية الخلايا أشرطة النطاق: 1 ميكرون. (A) من الرسم البياني الظاهر معامل الانتشار D * لجميع المسارات من 4 أو أكثر من الخطوات في مجال الرؤية من الخلايا التالفة (N = 4،162 المسارات). سكان الجزيئات المصنفة ب<html> س اوند يتم تمييز باللون الأحمر. وترد (BC) من المسارات Pol1-PAmCherry على صورة المجهر الضوئي المنقولة. يتم عرض المسارات تصنف على أنها ملزمة وفقا لمعامل الانتشار في الحمراء. (D) D * الرسم البياني للقياس المسارات Pol1 في الخلايا ثبتوا على وسادة الاغاروز مع 100 ملي MMS والمحتضنة لمدة 20 دقيقة قبل التصوير (N = 2،128 المسارات). ويرد السكان من جزيئات ملزمة تشارك في إصلاح الحمض النووي في الحمراء. (EF) Pol1-PAmCherry المسارات على الصورة المنقولة المجهر الضوئي تظهر مسارات الأحداث واحدة Pol1 إصلاح الحمض النووي في الحمراء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الفيديو 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/video.jpg" width="400" /> الفيلم 1. بناء الإعداد PALM مفصل.JoVE_Uphoff_Movie1.avi &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking at JoVE.com

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Photoactivated المجهر التعريب (النخيل) جنبا إلى جنب مع تتبع جزيء واحد يسمح الملاحظة المباشرة والكمي للتفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا القولونية الحية.

تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

visualizing-protein-dna-interactions-live-bacterial-cells-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Views.  University of Oxford.  Photoactivated المجهر التعريب (النخيل) جنبا إلى جنب مع تتبع جزيء واحد يسمح الملاحظة المباشرة والكمي للتفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا القولونية الحية. 

Video: Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

تصور الخلية إلى خلية نقل فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام النسخ نيون فيروس نقص المناعة البشرية ومتحد البؤر المجهري لايف

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

تقييم الاستجابة للعيش فوهي الخلايا البكتيرية باستخدام التصوير الجامعة ليف

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

عالية متعددة، والتصوير فائقة الدقة من الخلايا T باستخدام مادستورم

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...