Damos las gracias a E. Massicotte y J. señor de asistencia técnica de expertos durante la citometría de flujo y experimentos con células de clasificación. Además, nos gustaría dar las gracias al personal de la clínica IRCM y todos los donantes para proporcionar muestras de sangre. Muestras de sangre periférica se obtuvieron de donantes adultos sanos que dieron su consentimiento informado por escrito de conformidad con la Declaración de Helsinki bajo protocolos de investigación aprobados por la junta de revisión del Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM) ética de la investigación. Los siguientes reactivos se obtuvieron a través del Programa de reactivos NIH SIDA, División de SIDA, NIAID, NIH: células MT4 del Dr. Douglas Richman; y RIL-2 humana del Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. El Dr. Cohen es el destinatario de la Cátedra de Investigación de Canadá en Retrovirología humana. Este trabajo fue apoyado por becas de CIHR (CIHR 111.226) con el Dr. Cohen y del Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) de la red del SIDA al Dr. Bego y el Dr. Cohen.

Notas generales Es importante mantener las células en cultivo sin ningún antibiótico, ya que las infecciones bacterianas incluso controlada puede ser detectada por PBMCs. Tal detección de componentes bacterianos inducirá un fondo producción de interferón que no se puede distinguirse de la provocada por el VIH-1 específica de detección. Además, todas las células tienen que ser probados rutinariamente para la ausencia de contaminación por micoplasma. Siempre use soluciones de endotoxina libre siempre que sea posible. Flow caracterización de citometría de las diferentes células que se utilizará en los co-cultivos (PBMCs, PDC, MT4 y las células T CD4 +) es un paso opcional, pero muy recomendable, ya que puede proporcionar información valiosa necesaria para la correcta interpretación de un experimento dado. 1. Preparación de las células diana infectadas <ol><li> Mantener humano línea de células T CD4 + MT4 en RPMI 1640 mediun suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), que se refiere de ahora en adelante como medio RPMI-1640 completo. </li><li> Aislamiento de células primarias T CD4 +. <ol><li> Aislar las células mononucleares de sangre periférica humana mediante centrifugación en gradiente de densidad. </li><li> Aislar los linfocitos T CD4 + utilizando un kit de selección negativa células T CD4 +, siguiendo las recomendaciones del fabricante. </li><li> Activar los linfocitos T CD4 + con PHA-L (5 mg / ml) durante 48 horas y después mantener las células en medio RPMI-1640 completo suplementado con IL-2 recombinante (100 U / ml). Infectar las células T 5 días después de aislamiento primario. </li></ol></li><li> La infección de las células diana (línea celular MT4 T o células primarias heterólogos T CD4 +). <ol><li> Dos días antes de la co-cultivo, infectar las células T con virus VIH-1. En el ejemplo específico descrito aquí se utilizaron-GFP_ires_Nef pNL4.3 tipo salvaje (WT) o pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu) virus. Estas cepas virales representan green proteína fluorescente (GFP) -marcado clones moleculares infecciosos isogénicas que difieren únicamente en su capacidad para expresar Vpu. </li><li> Utilice diferentes multiplicidades de infección (MOI) y seleccione culturas con niveles similares de infección para los compañeros de las culturas. El día del co-cultivo, determinar el porcentaje de células GFP + por citometría de flujo como un marcador de la infección. Utilice sólo las culturas con un rango de 20 a 50% de células infectadas para co-cultivos. </li></ol></li></ol> Pasos opcionales: Realizar tinción de citometría de flujo en este momento para evaluar la expresión superficial de moléculas / ligandos de interés como BST2, y CD4. Para la tinción de la superficie celular, resuspender 0,5 x 10 6 células T en 100 l de solución de lavado, añadir 1 l de anti-CD4_PerCP / Cy5.5 y 1 l de anti-BST2_A660. Incubar los tubos durante 45 min a 4 ° C, antes de lavar con citometría de flujo solución de lavado. Si los estudios están dirigidos a evaluar el papel de la mediada Vpu antagonismo BST2, realice una partícula de VIH-1ensayo de liberación en este momento como se ha descrito previamente 15. 2. El aislamiento y enriquecimiento de Sintiendo células (PBMCs enteros o enriquecidos PDC) Nota: Cuando se utilizan PBMC para la detección, se inicia el aislamiento dentro de media hora después de la extracción de sangre y llevar a cabo de una manera oportuna. Utilice PBMCs de inmediato para los compañeros de culturas o de enriquecimiento PDC. <ol><li> Aislar las células mononucleares de sangre periférica humana mediante centrifugación en gradiente de densidad. Paso opcional: Realizar la tinción de citometría de flujo multiparamétrica para confirmar que los PBMCs recién aisladas contienen los diferentes linajes de células en proporciones fisiológicas. Para la tinción de superficie celular, resuspender 10 6 PBMCs en 100 l de solución de bloqueo Fc, y se incuba durante 15 min a 4 ° C. Después del bloqueo, añadir 1 l de anti-CD3_Pacific azul (para las células T), 1 l de anti-CD14-PE_Texas Rojo (por células mieloides), 4 l de anti-BDCA2_APC y 1 l de anti-ILT7_PE (por PDC). Incubartubos durante 45 min a 4 ° C, antes de lavar con citometría de flujo solución de lavado. </li><li> Enriquecer PDC utilizando un kit de selección negativa pDC, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se recomienda trabajar con rapidez, mantener las células en frío, y el uso de soluciones pre-enfriado. Esto evitará que la nivelación de anticuerpos en la superficie celular y el etiquetado de células no específico, así como asegurar la actividad pDC máxima. <ol><li> Realizar multi-paramétrico de análisis de citometría de flujo de las PDC recién aisladas para confirmar la pureza, el porcentaje de enriquecimiento, y cantidades relativas de pDC- marcadores de superficie específica (tales como ILT7 y BDCA2). Para la tinción de superficie celular, resuspender 10 4 PDC en 100 l de solución de bloqueo Fc, y se incuba durante 15 min a 4 ° C. Después del bloqueo, añadir 1 l de anti-CD3_Pacific Azul, 1 l de anti-CD14_PE_Texas Rojo, 4 l de anti-BDCA2_APC y 1 l de anti-ILT7_PE. Incubar los tubos durante 45 min a 4 ° C, antes de lavar con citometría de flujo solución de lavado (PBS, 5EDTA mM, 5% de FBS). Se recomienda un mínimo de 40% de pureza pDC (si el material de partida tiene 0,4% pDC, esto sería equivalente a un enriquecimiento de 100 veces). </li></ol></li></ol> 3. Co-cultivo de células infectadas T CD4 + y células de detección (PBMCs enteros o enriquecidos PDC) <ol><li> Mezclar 220 l de PBMCs (diluido a 850.000 células / ml) o 220 l de PDC (a una concentración que varía de 100.000 a 500.000 células / ml) con 30 l de células T infectadas (diluido en 10 6 células / ml) por pocillo en una placa de fondo en U 96. <ol><li> Como solo los controles, PBMCs placa o PDC y células T. Ajustar el volumen en el pozo a 250 l con medio RPMI 1640 completo. </li><li> Evaluar las respuestas celulares a conocido agonista de las vías TLR7 y TLR9. Con este fin, la placa 220 l de PBMCs (diluido a 850.000 células / ml) o 200 l de PDC (a una concentración que varía de 100.000 a 500.000 células / ml) por pocillo en una placa de fondo en U de 96 pocillos y añadir TLR7 agonista ( Imiquimod, concentración final: 2,5 mg / ml) o TLR9 agonista (ODN CpG-A 2,216, concentración final: 5 mM). Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 18-22 hr y procesarlos en una manera similar a los co-cultivos se describen a continuación. </li></ol></li><li> Incubar co-cultivos a 37 ° C y 5% de CO2 durante 18 a 22 horas, y luego transferir a una placa de 96 pocillos-V inferior. Centrifugar durante 5 min a 400 x g. <ol><li> Traslado sobrenadantes a una placa de fondo plano de 96 pocillos. Los sobrenadantes pueden ser almacenadas a -80 ° C o se utilizan para la detección de IFN de tipo I inmediatamente. </li><li> Resuspender las células co-cultivaron en 2% de paraformaldehído y analizarlos usando citometría de flujo. Debido a diferencias en el tamaño y la granulación, las células MT4 se distinguen fácilmente de PBMCs o PDC en función de su dispersión lateral (SS) frente a la dispersión frontal (FS) perfiles. Si las células T primarias se utilizan como células diana infectadas, estos pueden ser teñidas con un colorante de rastreador celular, tal como CSFE, para co-cultivo antes. </li></ol></li><li> Medición de bioactivo tipo I IFN utilizando células reportero beta HEK-Blue IFN-a /. Nota: Estas células fueron generados por transfección estable de células HEK293 con los genes STAT2 y irf9 humanos para obtener un tipo completamente activo I IFN vía de señalización. También contienen la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) gen informador bajo el control de la IFN-α / ß promotor inducible ISG54. La estimulación de estas células con IFN de tipo I activa el JAK / STAT / ISGF3 vía e induce la producción de SEAP. <ol><li> Mantener las células HEK-Blue IFN-α / ß en DMEM suplementado con 10% FBS. Placa de ellos a una densidad de 50.000 células por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos, en un volumen final de 180 microlitros. </li><li> Añadir 20 l de co-cultivo sobrenadante a cada pocillo por duplicado. Cada placa también requiere un conjunto de controles estándar interno (IFN humano, concentración final de 100 U / ml a 2.500 U / ml). Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO2 durante 18H -22. </li><li> Determinar los niveles de actividad de la fosfatasa alcalina utilizando solución de QUANTI azul, que cambia de rosa a púrpura / azul en presencia de la enzima. Preparar QUANTI-Blue siguiendo las recomendaciones del fabricante. Añadir 180 l de esta solución a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. A cada pocillo también añadir 20 l de los sobrenadantes de células HEK-Blue IFN-α / ß inducidas, y se incuba la placa en una incubadora a 37 ° C hasta que el color se desarrolla en los pocillos de control estándar de IFN. </li><li> Evaluar los niveles de SEAP utilizando un espectrofotómetro a 620 a 655 nm y determinar la concentración de IFN de tipo I por extrapolación de la parte lineal de la curva estándar de IFN. </li></ol></li></ol>

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Los protocolos descritos aquí miden la detección de las células T infectadas con el virus VIH-1 GFP-etiquetados que difieren únicamente en su capacidad para expresar Vpu, como se describe en nuestro informe reciente 18. Sin embargo, estos métodos podrían ser fácilmente modificados para estudiar la detección de los virus sin etiquetar, así como virus que carecen de otros genes virales que potencialmente podrían modular de detección innata. Si los virus utilizados no expresan GFP, el porcentaje de células diana infectadas deben ser determinados por otros medios antes de co-cultivo, tales como p24 (cápsida) tinción intracelular y citometría de o por p24 ELISA fluir. Además, estos protocolos se pueden utilizar con diferentes células T diana, incluyendo una variedad de líneas celulares y células primarias disponibles. Los métodos descritos en este manuscrito tienen una serie de ventajas en comparación con los primeros metodologías utilizadas para estudiar el VIH-1 de detección. En primer lugar se ha establecido por un número de grupos que libre de células VIH-1 partículos son inductores pobres de tipo I IFN 2,13,14. Además, los primeros estudios se basaban en métodos más antiguos basados ​​en ELISA IFNa para cuantificar la cantidad de IFN de tipo I producido. Una limitación de esta técnica de detección es que la mayoría de los kits ELISA IFN antiguos sólo miden un tipo de IFN, mientras que con vistas a los otros tipos de IFN y IFNß. El uso de las líneas de células reportero descritas supera esta limitación como la concentración de todas las formas bioactivas de IFNs humanos de tipo I se puede medir a la vez. La técnica es muy sensible, menos costoso que la nueva generación de kit ELISA IFN y para muchos donantes grandes cantidades de tipo I IFN se pueden detectar fácilmente. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar fácilmente para su uso con otros-yo tipo IFN métodos de lectura de tales como ELISA. Los pasos críticos: Es importante que la calidad de todos los componentes celulares (ambos objetivos y efectores) ser estrechamente controlada. Contaminación potencial, incluso cuando asymptomatic, necesita ser monitoreado y controlado. Como mencionamos anteriormente, los antibióticos controla la contaminación bacteriana asintomática, y potencialmente otros patógenos intracelulares, tales como micoplasmas, puede generar respuestas inmunes similares a los observados después de la infección por VIH-1, a saber, la producción de IFN de tipo I. Por otra parte, todos los reactivos deben estar libres de LPS o de otras endotoxinas potenciales. Del mismo modo, el seguimiento de PBMCs y PDC también es importante ya que las muestras humanos a menudo pueden ser preparados por infecciones en curso subyacentes, que pueden afectar de detección normal. Recomendamos siempre incluyendo las propuestas de controles negativos, como la ausencia de las células diana, así como co-cultivos con células infectadas. Viabilidad de las células infectadas también es importante para la detección pDC adecuada ya que el tipo-I IFN no se produce después de co-cultivo con células apoptóticas 2,14. Una limitación importante de la técnica es la necesidad de que las células primarias recién aisladas. Este procedimiento no eraprobado utilizando PBMCs o PDC que fueron ya sea previamente congelados o en cultivo. El aislamiento de PBMCs es mano de obra intensiva y estas células tienen una vida útil muy limitada. Además, los protocolos estándar para la protección contra patógenos de transmisión sanguínea deben usarse mientras se trabaja con sangre humana. A menudo hay varias fuentes de variabilidad asociados con el trabajo que implican las células humanas recién aisladas. Entre ellos se encuentran los diferentes procedimientos implementados para aislar estas células y la variabilidad hereditaria encontradas de los donantes a los donantes. Si bien es imposible evitar la variabilidad entre los donantes, el uso de las sugeridas controles positivos, como la medición de la respuesta a los agonistas conocidos de TLR7 y TLR9 vías, proporcionaría un importante control interno para estos experimentos. Hemos observado que una respuesta robusta a los agonistas de la vía TLR9 podría correlacionarse con una respuesta pDC sano, mientras que se requiere una vía de TLR7 de respuesta para una respuesta adecuada contra el VIH-1 3. 2, a menudo no se necesita enriquecimiento de PDC de PBMCs. Sin embargo, si el diseño experimental lo requiere (por ejemplo, en el contexto donde se necesita el agotamiento de los marcadores específicos de la superficie PDC) selección negativa es preferible a la selección positiva, como las células permanecen libres de anticuerpo después del proceso de selección. PDC aisladas sufren apoptosis rápida en la cultura. Para los experimentos que requieren estas células para ser cultivadas durante un período prolongado de tiempo, medios de cultivo se pueden complementar con IL-3. Esta citoquina induce la proliferación pDC e inhibe su apoptosis 16. Sin embargo, el uso de IL-3 necesita ser estrictamente controlada ya que puede dar lugar a la maduración PDC o la diferenciación. El método descrito aquí combina diana del VIH-1 en las células infectadas con PBMCs o PDC recién aisladas con el fin de recrear los pasos iniciales que participan durante la detección innata. Este método, sin duda, será útil para explorcorreos primeros eventos inmunes innatas asociadas con la infección por el VIH. Aunque los protocolos asociados están dirigidos a medir tipo I IFN, que fácilmente podrían ser modificados para medir otras moléculas bioactivas liberadas de PDC en el reconocimiento de las células infectadas. Estos podrían incluir: Tipo III-IFN (IFN-λ), citoquinas pro-inflamatorias (tales como TNF-α e IL-6) y el CXCL10 quimiocinas, CCL4, CCL5 y 17.

Tipo I IFN-producción de PDC representan la primera línea de defensa contra las infecciones virales, y como tal, sirven como un vínculo vital entre la inmunidad innata y adaptativa 1. Si bien el VIH-1 partículas libres de células están mal detectados por el sistema inmune innato, las células T CD4 + infectados por el VIH-1 se detectan efectivamente por PDC 2. El mecanismo de detección requiere un contacto inicial entre la glicoproteína de la envoltura viral (gp120) en la superficie de la célula T infectada y moléculas CD4 en el PDC, que es seguido por la captura de virus y la internalización por la PDC. Reconocimiento subsiguiente del transferida ARN VIH-1 por TLR7 desencadena la activación de la Myd88 / vía IRF7 y en última instancia conduce a la de tipo I la producción de IFN 3. Es importante destacar que la segunda vía presente en PDC de detección, que está mediada por TLR9, se inhibe por la interacción de la glicoproteína viral, gp120, con el BDCA2 marcador de superficie específico PDC-4. <p class="jove_content"&gt; Los TLR7 y TLR9 vías de detección de pDC potencialmente puede ser modulada negativamente por la participación de BST2 (también designado teterina o CD317) con otro receptor pDC específica inhibidora superficie llamada ILT7 5. BST2 se expresa en altos niveles en la superficie de PDC y algunas células cancerosas, pero a niveles relativamente inferiores en otros tipos de células, tales como células B, macrófagos, y células T. Es importante destacar que, BST2 puede ser inducida por IFN de tipo I en un número de líneas celulares transformadas así como en cultivos celulares primarios de los orígenes humanos y murinos 6. Aparte de su función inmuno-reguladora, BST2 se ha descubierto recientemente para inhibir la liberación de VIH-1 y otra envuelta partículas virales por partículas virales nacientes de reticulación sobre la superficie de células infectadas 7. En el caso del VIH-1, la proteína accesoria codificada por el virus U (Vpu) fue mostrado para actuar como un antagonista BST2. Se cree que regula a la baja Vpu BST2 de la superficie celular de las células infectadas por VIH-1, el sitio de su ataduraing actividad y como resultado aumenta la liberación viral y la propagación 7, aunque esta noción ha sido cuestionada 8,9. En ausencia de Vpu, un gran número de completamente formadas y la progenie madura VIH-1 partículas son retenidas en la superficie celular. Si estas partículas atados podrían representar objetivos eficaces para la detección inmunológica sigue siendo una cuestión abierta. Además, no está claro si Vpu podría dysregulate producción de IFN-I Tipo de PDC por la superficie modulación BST2 niveles. Los primeros estudios diseñados para evaluar el VIH-1 se realizaron utilizando detección de VIH-1 partículas libres de células, que generalmente se consideran inductores pobres de tipo I IFN 3,10-12. Dado que los estudios recientes sugieren que PBMCs y PDC detectan de manera eficiente T infectadas por el VIH CD4 + linfocitos 2,13,14, como se describe aquí un método simple para medir las respuestas innatas desencadenados por PDC sobre el reconocimiento de las células infectadas por VIH-1 in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="652">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">MT4 cells</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">120</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-Blu IFN-&#945;/&#946; reporter cells </td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">HKB-IFNAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">RPMI</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DMEM</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">FBS</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Ficoll-P&#226;que Plus</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CD4+ T cell isolation kit II</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-091-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II </td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-097-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">PHA-L</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">O2769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">Human rIL-2</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">136</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Imiquimod</td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">TLRL-IMQS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ODN 2216 CpG-A</td>
			<td style="width:87px;">Hycult Biotec</td>
			<td style="width:103px;">HC4037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">Human IFN&#945;</td>
			<td style="width:87px;">PBL Interferon source</td>
			<td style="width:103px;">11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QUANTI-Blue </td>
			<td style="width:87px;">Cedarlane</td>
			<td style="width:103px;">REP-QB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Flow cytometry (Antibodies/reagents)</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Fc blocking solution (composition below):</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td style="width:260px;">Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Goat serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">G 9023</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Rabbit serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">R 9133</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Mouse serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M 5909</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">2.5 mg/ml human IgG</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">I 4506</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD3_Pacific Blue</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">300417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">anti-CD14_PE-TxRed</td>
			<td style="width:87px;">Life Technologie</td>
			<td style="width:103px;">MHCD1417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BDCA2_APC</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-090-905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-ILT7_PE</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">326408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD4_PerCP/Cy5.5</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">317427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BST2_Alexa 660</td>
			<td style="width:87px;">eBioscience</td>
			<td style="width:103px;">50-3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Paraformaldehyde </td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">P 6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:87px;">BD Falcon </td>
			<td style="width:103px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyan ADP instrument </td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:103px;">CY20030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the innate sensing of hiv-1 infected cd4+ t cells by plasmacytoid dendritic cells using an ex vivo co-culture system.

VIH-1 de detección innata requiere el contacto directo de las células T CD4 + infectadas con células dendríticas plasmacitoides (PDC). Con el fin de estudiar este proceso, los protocolos descritos aquí utilizan recién aisladas células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o células dendríticas plasmacitoides (PDC) para detectar infecciones en cualquiera de las líneas de células T (MT4) o células primarias heterólogos T CD4 +. A fin de garantizar una detección adecuada, es esencial que PBMC se aíslan inmediatamente después de la recogida de sangre y que porcentaje óptimo de las células T infectadas se utilizan. Además, la tinción de citometría de flujo multiparamétrica se puede utilizar para confirmar que contienen muestras de PBMC los diferentes linajes de células en proporciones fisiológicas. Una serie de controles también puede ser incluido para evaluar la viabilidad y la funcionalidad de PDC. Estos incluyen, la presencia de marcadores de superficie específicos, la evaluación de las respuestas celulares a agonista conocido de receptores toll-like (TLR) vías, y confirmando la falta de Spontáneo interferón de tipo I (IFN) de producción. En este sistema, las PBMC recién aisladas o PDC son co-cultivadas con VIH-1 en las células infectadas en placas de 96 pocillos durante 18-22 h. Los sobrenadantes de estos co-cultivos se utilizan entonces para determinar los niveles de IFN de tipo I bioactivos mediante el control de la activación de la vía ISGF3 en IFN-alfa células / beta HEK-Blue. Antes y durante las condiciones de co-cultivo, las células diana pueden ser sometidos a análisis de citometría de flujo para determinar una serie de parámetros, incluyendo el porcentaje de células infectadas, los niveles de marcadores de superficie específicos, y diferenciado muerte de las células infectadas. Aunque, estos protocolos se desarrollaron inicialmente para seguir la producción de IFN de tipo I, que podrían ser utilizadas para estudiar otras moléculas Imuno-modulador liberados de PDC y para obtener una mayor comprensión de los mecanismos moleculares que regulan el VIH-1 de detección innata.

El sistema de co-cultivo descrito en la figura 1 permite un estudio controlado del VIH-1 de detección innata. Debido a la naturaleza variable de las células primarias, es importante que se respeten las proporciones normales de células mieloides y T (CD14 + y CD3 +, respectivamente), como en el ejemplo mostrado en la Figura 2A. Además, sólo un bajo número de células T activadas (FS más altos y niveles CD3 superiores en comparación con las células no activadas T) son deseables en los cultivos de PBMC recién aisladas. PBMCs con relaciones anormales entre los diversos tipos de células son a menudo incapaces de montar una respuesta inmune innata adecuada in vitro, probablemente debido a un fenotipo ya activado como consecuencia de una infección en curso. Lo más importante, el porcentaje relativo de PDC necesita ser evaluado como se muestra en la Figura 2B. Aunque este porcentaje puede variar de 0,2 a 1,2%, un fenotipo de detección anormal también se observa con ambos extremes de este rango. Enriquecimiento de PDC utilizando selección negativa a menudo produce el 50-95% pDC pureza, como se ve en los dos ejemplos de en la Figura 2B (92% y 72%). Un ejemplo prototípico para el experimento global se muestra en las figuras 3 y 4. En este ejemplo, las células MT4 se infectaron con pNL4.3-GFP_ires_Nef WT o delta Vpu para lograr la infección 30% en el momento de co-cultivo (Figura 3A). Como se describió anteriormente, sólo la infecciones con el virus WT dieron como resultado una regulación a la baja significativa de BST2 superficie (Figura 3B). Debido a sus diferencias en tamaño y granularidad, células MT4 pueden distinguirse fácilmente de las PBMC por citometría de flujo (Figura 4A). Después de la incubación de co-cultivo, sólo los PBMCs en contacto con conocido TLR7 o TLR9 agonista y PBMCs en contacto con el VIH-1 en las células infectadas liberados cantidades significativas de IFN de tipo I (Figura 4B). No se detectó IFN en PBMCs solo, en PBMCs co-cultured con células MT4 falsamente infectadas o en células MT4 infectadas por sí solos (Figura 4B). En el ejemplo que aquí se presenta, se encontró detección innata de las células MT4 infectadas por VIH-1 por PBMCs que se reduzca significativamente en la presencia de Vpu. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1:. Visión esquemática del diseño experimental SUP: sobrenadante <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2: Caracterización fenotípica de PBMCs y enr recién aisladasPDC iched. (A) La distribución normal de las células mieloides y las células T observadas en PBMCs aisladas de un donante sano (Porcentaje de células mieloides deberían oscilar entre 10-20% y las células T entre el 55-65%). Muestra de PBMC se tiñeron utilizando anticuerpos conjugado con fluoróforo que reconocen CD14 de superficie (marcador de linaje mieloide) y CD3 (marcador de células T). (B) la caracterización fenotípica de PDC. Antes de PDC de enriquecimiento representan entre 0,2 a 1,2% del número total de células dentro de los PBMCs (0,99% en el ejemplo mostrado). Estas células pueden ser identificados basado en la expresión de marcadores específicos, tales como BDCA2 y ILT7, presentes en la superficie celular. La selección negativa se puede utilizar para enriquecer significativamente el número de PDC y eliminar contaminaciones potencialmente perjudiciales, tales como CD14 + células mieloides (enriquecimiento que alcanzan 92% y 72% en los dos ejemplos se muestra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" target="_blank">Cli</a>ck aquí para ver la imagen más grande. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3:. Caracterización de células MT4 diana infectadas por el VIH-1 (A) Porcentaje de células infectadas dentro de las culturas MT4 infectadas con pNL4.3-GFP_ires_Nef WT o dVpu según lo determinado por el porcentaje de células positivas para GFP. Expresión en la superficie (B) de células BST2 en las células infectadas se evaluó después de tinción de la superficie. Los histogramas grises lleno representan células falsamente infectadas teñidos con el suero de conejo pre-inmune (control sin teñir); los histogramas restantes representan células teñidas con anti-suero de conejo policlonal BST2. Los histogramas con líneas continuas representan las células negativas GFP control (neg); mientras histogramas con líneas de puntos corresponden a las células infectadas GFP positivas (POS). La media de la gripeintensidad orescence valores (IMF) se indican para cada muestra. La citometría de flujo se realizó y se analizaron como se describe en la figura 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4:. La cultura Co de PBMC recién aisladas y células MT4 T infectadas (A) Comparación de la citometría de flujo perfiles FS / SS observados para células MT4 T solamente, PBMC solas o compañeros de culturas entre PBMCs y células MT4 T. Debido a las diferencias de tamaño y granularidad, las células MT4 T ​​pueden distinguirse fácilmente de PBMCs en co-cultivos utilizando citometría de flujo. (B) Ejemplo representativo de la cantidad de tipo I IFN liberado después de la estimulación de PBMC con TLR7 o TLR9 agonista (hace), o después de co-cultivos con fingida o las células MT4 indicados infectadas con pNL4.3-GFP_ires_Nef WT o dVpu. Los datos brutos muestran como OD 650 valores y su correspondiente converseion tipo I a la concentración de IFN expresados ​​en U / ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande.</a>

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Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

A diferencia del VIH-1 partículas libres de células, las células T CD4 + infectados son detectados con eficacia por las células dendríticas plasmocitoides (PDC). Este manuscrito describe un método donde las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o PDC aisladas son co-cultivadas con VIH-1 en las células T infectadas para evaluar detección innata por PDC según la evaluación de liberación de IFN de tipo I.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

assessing-innate-sensing-hiv-1-infected-cd4-t-cells-plasmacytoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

8.6K vistas.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM).  A diferencia del VIH-1 partículas libres de células, las células T CD4 + infectados son detectados con eficacia por las células dendríticas plasmocitoides (PDC). Este manuscrito describe un método donde las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o PDC aisladas son co-cultivadas con VIH-1 en las células T infectadas para evaluar detección innata por PDC según la evaluación de liberación de IFN de tipo I. 

Video: Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Investigación

Inmunología e Infección

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Nuevas herramientas para expandir células T reguladoras de las personas VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Células T Captura bacterias por transinfection de células dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Aislamiento y<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células γδ T, una célula αβT Progenitor Extrathymic

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Clasificación de células activadas por fluorescencia para la purificación de células dendríticas plasmocitoide de la médula ósea de ratones

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

SILAC basada en proteómica Caracterización de exosomas del VIH-1 en células infectadas

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Desarrollo y validación de una sola molécula ultrasensible matriz Digital análisis de enzima-ligado del inmunosorbente para interferón-α humano

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...