우리는 유동 세포 계측법 및 세포 분류 실험을하는 동안 전문가의 기술 지원을 E. Massicotte 및 J. 주님 감사합니다. 또한, 우리는 혈액 샘플을 제공하기위한 IRCM 클리닉 직원과 모든 기부자들에게 감사의 말씀을 전합니다. 말초 혈액 샘플을 연구소 드 Recherches Cliniques 몬트리올 (IRCM)의 연구 윤리 심의위원회의 승인을 연구 프로토콜에서 헬싱키 선언에 따라 동의서를 작성 준 건강한 성인 기증자로부터 얻었다. 다음 시약은 NIH 에이즈 시약 프로그램, 에이즈, NIAID, NIH의 분할을 통해 얻을 수 있었다 박사 더글러스 리치맨에서 MT4 세포; 인적 RIL-2 박사 모리스 Gately, 호프만에서 - 라 로슈 주식 코헨 박사는 인간 Retrovirology에서 캐나다 연구 의장의받는 사람입니다. 이 작품은 코헨 박사에 CIHR (CIHR 111226)에서와 퐁 드 공들인 퀘벡 - 상테 (FRQ-S) 박사 BEGO와 코헨 박사에 에이즈 네트워크에서 보조금에 의해 지원되었다.

일반 공지 사항 심지어 제어 된 세균 감염은 PBMC를 감지 할 수 있으므로, 어떤 항생제없이 배양에서 세포를 유지하는 것이 중요하다. 세균 등의 센싱 요소는 특정 HIV-1 촬상 트리거 그 구별 될 수없는 배경 인터페론 생산을 유도 할 것이다. 또한, 모든 셀들은 통상적으로 마이코 플라스마 오염의 부재에 대해 시험 할 수있다. 가능하면 항상 독소가없는 솔루션을 사용합니다. 상이한 세포의 유세포 특성화 공동 배양에 사용되는 (PBMC를는 올라가고, MT4 및 CD4 + T 세포)는 선택적 단계이지만, 주어진 실험의 적절한 해석에 필요한 유용한 정보를 제공 할 수 있기 때문에 추천. 감염된 표적 세포의 제조 (1) <ol><li> RPMI 1640 메디칼 인간의 CD4 + T 세포 라인 MT4 유지RPMI-1640은 완전 배지이라 함, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. </li><li> 주요 CD4 + T 세포의 분리. <ol><li> 밀도 구배 원심 분리하여 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리. </li><li> 제조자의 권고 다음의 CD4 + T 세포를 음성 선별 키트를 사용하여 CD4 + T 림프구를 분리. </li><li> RPMI-1640 완전 배지에서 48 시간 동안 PHA-L (5 μg의 / ㎖)와 CD4 + T 림프구를 활성화하고 유지하는 세포는 재조합 IL-2 (100 U / ml)로 보충. 차 T 세포 오일 게시물 격리를 감염. </li></ol></li><li> 표적 세포 (MT4 T 세포주 또는 일차 이종 CD4 + T 세포)에 감염. <ol><li> HIV-1 바이러스 T 세포를, 문화를 공동 감염 이틀 전에. 여기에 기술 된 특정 실시 예에서 pNL4.3-GFP_ires_Nef 야생형 (WT) 또는 pNL4.3 GFP_ires_Nef 델타 - VPU (dVpu) 바이러스를 사용 하였다. 이 바이러스 균주는 GRE를 나타냅니다형광 단백질 (GFP)는 VPU를 표현하는 능력 만 다른 동종 전염성 분자 클론을 -marked 갖추고 있습니다. </li><li> 감염 (MOIs)의 다른 다중도를 사용하여 공동 문화에 대한 감염의 비슷한 수준의 문화를 선택합니다. 공동 배양 하루 계측법 감염의 마커로서 유동에 의해 GFP + 세포의 비율을 결정한다. 공동 문화에 대한 20-50% 감염된 세포의 범위 만 문화를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 옵션 단계 : 같은 BST2, 그리고 CD4 같은 관심의 분자 / 리간드의 표면 발현을 평가하는이 시점에서 유세포 염색을 수행합니다. 세포 표면 염색을 위해, 항 CD4_PerCP / Cy5.5 1 μL 및 안티 BST2_A660 1 μL를 추가 세척 용액 100 ㎕에 0.5 × 106 T 세포를 재현 탁. 세척 용액 유동 세포 계측법로 세척하기 전에, 4 ° C에서 45 분 동안 튜브를 품어. 연구가 VPU 매개 BST2 길항 작용의 역할을 평가 대상으로하는 경우, HIV-1 입자를 수행이때 방출 분석은 앞서 설명한 15. 세포 (PBMC를 전체 또는 농축 올라가고)를 감지 2. 분리 및 농축 주 : PBMC를 사용이 감지되면, 채혈 후 반 시간 내에 분리를 시작하고 적시에 그것을 수행. 공동 문화 또는 PDC 농축 즉시 PBMC를 사용합니다. <ol><li> 밀도 구배 원심 분리하여 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리. 선택적 단계 : 그 갓 격리 PBMC를 생리 비율로 다른 세포 계통을 포함 확인하는 다중 매개 변수 흐름 세포 계측법 염색을 수행합니다. 세포 표면 염색을 위해, 차단 된 Fc 용액 100 ㎕에 10 6 된 PBMC를 재현 탁하고, 4 ℃에서 15 분 동안 배양한다. 차단 한 후, 안티 CD3_Pacific 블루, (골수 세포) 항 CD14-PE_Texas 레드 1 μL, 안티 BDCA2_APC 4 μL와 (PDC의) 반 ILT7_PE 1 μL (T 세포)의 1 μl를 추가합니다. 품다세척 용액 유동 세포 계측법 세척 전에 4 ° C에서 45 분 동안 튜브,. </li><li> 제조업체의 권장 사항은 다음 PDC 부정적인 선택 키트를 사용하여 올라가고을 풍부. 그것은, 빠른 작동 차가운 세포를 유지하고, 미리 냉각 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다. 이는 PDC 최대 활성을 보장뿐만 아니라 세포 표면과 비특이적 세포 표지 항체에 캐핑을 방지 할 것이다. <ol><li> 순도, 농축 비율 (예 : ILT7과 BDCA2 등) pDC- 특정 표면 마커의 상대적인 양을 확인하기 위해 갓 격리 올라가고의 다중 매개 변수 유세포 분석을 수행합니다. 세포 표면 염색을 위해, 차단 된 Fc 용액 100 μL에 104 PDCS을 재현 탁하고, 4 ℃에서 15 분 동안 배양한다. 차단 한 후, 안티 CD3_Pacific 블루의 1 μL, 안티 CD14_PE_Texas 레드 1 μL, 안티 BDCA2_APC 4 μL 및 안티 ILT7_PE 1 μl를 추가합니다. (PBS, 5 세척 용액 유동 세포 계측법로 세척하기 전에, 4 ° C에서 45 분 동안 튜브를 품어mM의 EDTA, 5 % FBS). 40 % 순도의 PDC 최소 (출발 물질이 0.4 % PDC가있는 경우, 이는 100 배 농축 동등한 것)를 권장합니다. </li></ol></li></ol> 감염된 CD4 + T 세포와 감지 세포 (PBMC를 전체 또는 농축 올라가고) 3. 공동 문화 <ol><li> 웰당 (106 세포 / ml로 희석) 감염된 T 세포의 30 μL로하여 PBMC를 220 μL 또는 PDCS 220 μL (850,000 세포 / ml로 희석) (100,000 내지 500,000 세포 농도 범위 / ㎖)을 혼합 U-바닥 96 웰 플레이트. <ol><li> 혼자 컨트롤, 판 PBMC를 또는 올라가고 및 T 세포로. RPMI 1640 완전 배지 잘 250 μL의 볼륨을 조절합니다. </li><li> TLR7 및 TLR9 경로의 알려진 효능에 대한 세포 반응을 평가합니다. 이를 위해, PBMC를 접시 220 μL은 U 바닥 96 웰 플레이트에 웰 당 또는 (100,000 내지 500,000 세포 / ml 범위의 농도에서) PDCS 200 μL (850,000 세포 / ㎖로 희석) 및 (TLR7 작용제를 추가 IMIquimod, 최종 농도 2.5 μg의 / ㎖) 또는 TLR9 작용제 (2,216의 CpG ODN-A, 최종 농도 5 μM). 37 ° C에서 배양 한 세포 및 5 % CO 2, 18 ~ 22 시간 동안 후술 공동 배양 유사한 방식으로이를 처리한다. </li></ol></li><li> 37 ℃에서 동시 배양 물을 인큐베이션하고, 5 % CO 2, 18 ~ 22 시간 동안, 다음 V 바닥 96 웰 플레이트로 옮긴다. 400 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. <ol><li> 평면 바닥 96 웰 플레이트에 상층 액을 전송합니다. 상청액을 -80 ℃에서 보관하거나 즉시 타입 I IFN 검출을 위해 사용될 수있다. </li><li> 2 % 파라 포름 알데히드의 공 배양 세포를 재현 탁하고 유세포 분석기를 사용하여 분석한다. 크기 및 과립의 차이로 인해, MT4 세포는 앞으로 산란 (FS) 프로파일 대 그들의 측면 산란 (SS)를 기반으로 한 PBMC 또는 올라가고 쉽게 구별된다. 프라이 머리 T 세포를 표적으로 감염된 세포를 사용하는 경우, 이들은 같은 CSFE 같은 임의의 셀 추적 염료 종래의 공동 배양을 염색 할 수있다. </li></ol></li><li> HEK-블루 IFN-α / β 리포터 세포를 사용하여 생체 활성 타입 I IFN의 측정. 주 : 이러한 세포 I은 신호 전달 경로를 완전히 IFN 활성 형을 얻기 위해 인간 및 STAT2 IRF9 유전자 HEK293 세포의 안정한 형질 감염에 의해 생성되었다. 또한 유도 ISG54 프로모터를 β / IFN-α의 제어하에 분비 알칼리 포스 파타 아제 (SEAP) 리포터 유전자를 포함한다. 유형 I IFN 이러한 세포의 자극은 JAK / STAT / ISGF3 경로를 활성화하고 SEAP의 생산을 유도한다. <ol><li> 10 % FBS 보충 된 DMEM에서 HEK-블루 IFN-α / β 세포를 유지한다. 180 μL의 최종 부피, 평평한 바닥 96 웰 플레이트에서 웰 당 50,000 세포의 밀도로 그들을 접시. </li><li> 중복에 각 웰에 공동 배양 상층 액의 20 μl를 추가합니다. 각 판은 내부 표준 컨트롤 세트 (인간 IFNα, 2500 U / ml의 100 U /에서 최종 농도)가 필요합니다. 18 일 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 인큐베이션 플레이트-22의 시간. </li><li> 효소의 존재 퍼플 / 블루에 핑크에서 변경 정량화 - 블루 용액을 이용하여 알칼리 포스 파타 아제 활성의 수준을 결정합니다. 제조업체의 권장 사항은 다음 정량화 - 블루를 준비합니다. 평면 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에이 용액 180 μl를 추가합니다. 각 웰 또한 유도 HEK-블루 IFN-α / β 세포 상층 액 20 μL를 추가 한 색상 표준 IFN의 대조군 웰에 개발 될 때까지 37 ° C의 배양기에서 배양 플레이트. </li><li> 620-655 nm에서 분광 광도계를 사용하여 SEAP의 수준을 평가하고 IFN 표준 곡선의 선형 부분에서 외삽 법에 의해 형-I IFN의 농도를 결정한다. </li></ol></li></ol>

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여기에 설명 된 프로토콜은 최근의 보고서 (18)에 기술 된 바와 같이, VPU를 표현하는 능력 만 다를 GFP 표지 된 HIV-1 바이러스 감염된 T 세포의 검출을 측정한다. 그러나, 이들 방법은 쉽게 잠재적 타고난 센싱을 변조 할 수있는 다른 바이러스 유전자 결여 태그없는 바이러스뿐만 아니라, 바이러스의 검출을 연구하기 위해 수정 될 수있다. GFP를 발현하지 않는 사용 바이러스가 감염된 표적 세포의 백분율은 P24 (캡시드)로서, 세포 염색 공동 - 배양 세포 계측법 및 ELISA 또는 P24에 의해 흐르기 전에 다른 수단에 의해 결정되어야하는 경우. 더욱이, 이러한 프로토콜은 가능한 세포주 및 일차 전지를 포함하는 다양한 상이한 타겟 T 세포와 함께 사용될 수있다. HIV-1 센싱을 연구하는 데 이른 방법과 비교할 때,이 논문에서 설명하는 방법은 여러 가지 이점이있다. 무엇보다도 이것은 다수의 그룹 무 세포 HIV-1 (P)에 의해 확립 된기사 유형-I IFN 2,13,14의 가난한 유도한다. 또한, 초기 연구는 생산 타입 I IFN의 양을 정량화하기 이전 IFNα ELISA 기반 방법에 의존했다. 이러한 검출 기술의 한계는 IFNβ와 IFNα의 다른 유형을 바라보며 이전 IFNα ELISA 키트 대부분은 단지 한 종류의 IFNα를 측정한다는 것이다. 설명 리포터 세포주의 사용은 한 번에 측정 할 수있는 인간의 타입 I IFNs의 모든 형태의 생체 활성 농도 등이 제한을 극복한다. 기술은 IFN EL​​ISA 키트의보다 새로운 세대 및 타입 I IFN 다량 쉽게 검출 할 수있는 많은 도너 덜 비싼 매우 민감하다. 그럼에도 불구하고,이 프로토콜은 쉽게 ELISA를 다른 타입 I IFN 판독 방법에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 중요한 단계 : 모든 세포의 구성 요소 (목표와 이펙터 모두)의 품질을 엄격하게 제어하는​​ 것이 중요하다. 잠재적 인 오염에도 asymptomatic은 모니터링하고 제어 할 필요가있다. 우리는 앞서 언급 한 바와 같이, 무증상 세균 오염을 항생제 제어, 및 마이코 플라스마와 같은 잠재적으로 다른 세포 내 병원균은 HIV-1 감염, 유형 I IFN, 즉 생산 후 관찰 된 것과 유사한 면역 반응을 생성 할 수 있습니다. 또한, 모든 시약은 LPS 또는 다른 잠재적 독소가 없어야합니다. 인간 샘플은 종종 정상 감지에 영향을 미칠 수있는 기본 지속적인 감염에 의해 프라이밍 될 수 있으므로 마찬가지로 한 PBMC 및 PDCS의 모니터링은 또한 중요하다. 우리는 항상 제안 된 음성 대조군, 모의 감염된 세포와 같은 표적 세포의 유무뿐만 아니라 공동의 문화를 포함하는 것이 좋습니다. 감염된 세포의 생존도 유형-I IFN가 사멸 세포 2,14와 공동 배양 다음 생성되지 않기 때문에 적절한 PDC 감지 중요하다. 기술의 하나의 중요한 한계는 갓 절연 일차 전지에 대한 요구이다. 이 절차는 없었다중 이전에 냉동 또는 문화에 보관 된 PBMC를 또는 올라가고를 사용하여 테스트. PBMC를의 분리는 노동 집약적이며,이 세포는 매우 제한된 수명을 가지고있다. 인간의 피와 함께 작업하는 동안 또한, 혈액 매개 병원체에 대한 보호를위한 표준 프로토콜이 사용되어야한다. 갓 고립 된 인간 세포를 포함하는 작업과 관련된 변화의 여러 소스가 종종있다. 이들 중에서 도너 간에서 발생한 도너 이들 세포를 분리하도록 구현 상이한 절차 및 상속 가변성이다. 이 도너 간의 변동을 방지하는 것이 불가능하지만, 이러한 TLR7 및 TLR9 경로의 공지 된 효능에 대한 응답을 측정하는 등의 제안 양성 대조군의 사용은이 실험을위한 중요한 내부 제어를 제공 할 것이다. 우리는 반응 TLR7 경로는 HIV-1 (3)에 대해 적절한 응답을 요구하면서 TLR9 경로의 효능을 강력 응답, 건강 PDC 응답과 상관 될 수 있다는 것을 관찰했다. 2를 기반으로 SS = &quot;jove_content&quot;&gt;. 실험 설계에 필요한 경우 셀 선택 과정 후 항체의 자유 유지하지만, 음성 선별 (PDC 특정 표면 마커의 고갈이 필요한 상황에서 예를 들면), 양성 선별 이상이 바람직하다. 고립 된 올라가고 문화의 급속한 세포 사멸을받을. 이 세포를 필요로 실험은 오랜 기간 동안 배양하기 위해서는, 문화 미디어는 IL-3로 보충 할 수있다. 이러한 사이토 카인은 PDC 증식을 유도하고 이들 세포 사멸을 억제한다 (16). 이 PDC 성숙 또는 분화로 이어질 수 있기 때문에, IL-3 사용은 엄격하게 제어 할 필요가있다. 여기에 설명 된 방법은 타고난 감지시 관련된 초기 단계를 재현하기 위해 갓 격리 PBMC를 또는 올라가고와 목표 HIV-1에 감염된 세포를 결합합니다. 이 방법은 의심 할 여지없이 EXPLOR에 도움이 될 것입니다HIV 감염과 관련된 전자 초기 선천성 면역 이벤트. 연관된 프로토콜 타입 I IFN 측정 목적이기는하지만 쉽게 감염된 세포의 인식에 PDCS로부터 방출 다른 생체 활성 분자를 측정하기 위해 수정 될 수있다. 다음은 포함 할 수있다 : 유형 III 인터페론 (IFN-λ) 및 케모카인의 CXCL10, 사염화탄소, 및 CCL5 (17) (예 : TNF-α와 IL-6 등) 염증성 사이토 카인.

입력-I ​​IFN 생산 올라가고는 바이러스 감염에 대한 방어의 첫 번째 라인을 표현하고, 같은 선천성 및 후천성 면역 1 사이의 중요한 연결 역할을합니다. 무 세포 HIV-1의 입자가 어두울 선천 면역에 의해 검출되는 반면, HIV-1 감염된 CD4 + T 세포를 효과적으로 PDCS (2)에 의해 감지된다. 감지기구는 PDC에 의한 바이러스 포집 및 내재화 뒤에 PDC에 감염된 T 세포 및 CD4 분자의 표면에서 바이러스 외피 당 단백질 (gp120의) 사이의 초기 접촉을 필요로한다. TLR7에 의해 전송 된 HIV-1 RNA의 후속 인식에서 MyD88 / IRF7 경로의 활성화를 유발하고 궁극적으로 IFN 생산 3-I를 입력 연결됩니다. 중요한 것은, TLR9에 의해 매개된다 PDCS에서 본 제 2 센싱 경로는, PDC 특정 표면 마커 BDCA2 4, 바이러스 성 당 단백질 gp120의 상호 작용의 저해된다. 5라는 또 다른 PDC 특정 표면 억제 수용체와 (또한 Tetherin 또는 CD317 지정) BST2의 결합에 의해 조절 될 수있다. BST2은 PDCS 및 일부 암 세포의 표면에서 높은 수준으로 발현하지만, 이러한 B 세포, 대 식세포 및 T 세포와 같은 다른 세포 유형에서 상대적으로 낮은 수준이다. 중요한 BST2은 형질 전환 된 세포주의 수뿐만 아니라 인간 및 뮤린 기원 (6)의 일차 세포 배양 물에서 타입 I IFN에 의해 유도 될 수있다. 그 외에도 면역 조절 기능에서, BST2 최근에 HIV-1의 방출을 억제하는 것으로 발견되었고, 다른 하나는 감염된 세포 표면 (7) 상에 가교 미성숙 바이러스 입자로 바이러스 입자를 포위. HIV-1의 경우에, 인코딩 된 부속 바이러스 단백질 U (VPU)의 BST2 길항제로서 작용하는 것으로 하였다. 그것은 VPU는, HIV-1 감염 세포의 세포 표면에서의 테더의 사이트를 BST2 downregulates 것으로 여겨진다활성을 보내고,이 개념은 8,9 도전 하였지만, 결과적으로 바이러스의 분리를 강화하고 7 퍼졌다. VPU, 다수의 부재하에 완전한 형태 및 성숙한 자손 HIV-1의 입자가 세포 표면에서 유지된다. 이 닿는 입자가 면역 감지 효과적인 목표를 나타낼 수 있는지 여전히 의문으로 남아있다. 또한,이 표면은 VPU에게 BST2 수준을 변조함으로써 PDCS에서 타입 I IFN 생산 dysregulate 수 있는지 불명확하다. HIV-1 센싱을 평가하기위한 초기 연구는 일반적으로 타입 I IFN의 불량한 3,10-12 유도제 간주되는 무 세포 HIV-1 입자를 사용하여 수행 하였다. 최근의 연구는 PBMC를하고 올라가고 효율적으로 HIV에 감염된 CD4 + T 림프구 2,13,14를 감지하는 것이 좋습니다 감안할 때, 우리는 여기에 체외에서 HIV-1에 감염된 세포의 인식에 따라 올라가고에 의해 트리거 타고난 반응을 측정하는 간단한 방법을 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="652">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">MT4 cells</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">120</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-Blu IFN-&#945;/&#946; reporter cells </td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">HKB-IFNAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">RPMI</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DMEM</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">FBS</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Ficoll-P&#226;que Plus</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CD4+ T cell isolation kit II</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-091-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II </td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-097-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">PHA-L</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">O2769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">Human rIL-2</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">136</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Imiquimod</td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">TLRL-IMQS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ODN 2216 CpG-A</td>
			<td style="width:87px;">Hycult Biotec</td>
			<td style="width:103px;">HC4037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">Human IFN&#945;</td>
			<td style="width:87px;">PBL Interferon source</td>
			<td style="width:103px;">11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QUANTI-Blue </td>
			<td style="width:87px;">Cedarlane</td>
			<td style="width:103px;">REP-QB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Flow cytometry (Antibodies/reagents)</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Fc blocking solution (composition below):</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td style="width:260px;">Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Goat serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">G 9023</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Rabbit serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">R 9133</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Mouse serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M 5909</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">2.5 mg/ml human IgG</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">I 4506</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD3_Pacific Blue</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">300417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">anti-CD14_PE-TxRed</td>
			<td style="width:87px;">Life Technologie</td>
			<td style="width:103px;">MHCD1417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BDCA2_APC</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-090-905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-ILT7_PE</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">326408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD4_PerCP/Cy5.5</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">317427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BST2_Alexa 660</td>
			<td style="width:87px;">eBioscience</td>
			<td style="width:103px;">50-3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Paraformaldehyde </td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">P 6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:87px;">BD Falcon </td>
			<td style="width:103px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyan ADP instrument </td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:103px;">CY20030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the innate sensing of hiv-1 infected cd4+ t cells by plasmacytoid dendritic cells using an ex vivo co-culture system.

HIV-1 타고난 감지 형질 수지상 세포 (올라가고)에 감염된 CD4 + T 세포의 직접 접촉을 필요로한다. 이 과정을 연구하기 위해, 여기에 설명 된 프로토콜 T 세포주 (MT4) 또는 이종 주요 CD4 + T 세포 중의 감염을 감지하기 위해 신선하게 절연 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 형질 수지상 세포 (PDCS)를 사용한다. 적절한 감지를 보장하기 위해, PBMC는 혈액 수집 및 사용 감염된 T 세포의 최적 비율 직후 격리되어 필수적이다. 또한, 다중 파라미터 유세포 염색 PBMC 시료 생리 비율로 다른 세포 계통을 포함하는지 확인하기 위해 사용될 수있다. 컨트롤의 개수는 생존 및 PDCS의 기능을 평가하기 위해 포함될 수있다. 이들은 수신자 같은 수용체의 공지 된 작용제 (TLR) 경로로 세포 반응을 평가하고 spon의 부족을 확인, 특정 표면 마커의 존재를 포함taneous 타입 I 인터페론 (IFN) 생산. 이 시스템에서 갓 격리 PBMC를 또는 올라가고은 18 ~ 22 시간 동안 96 웰 플레이트에서 HIV-1에 감염된 세포와 공동 배양. 이러한 공 배양 후 상청액으로부터 HEK-블루 IFN-α / β 세포에서 ISGF3 경로의 활성화를 모니터링함으로써 생리 활성의 타입 I IFNs의 수준을 결정하기 위해 사용된다. 종래와 공 배양 조건에서, 표적 세포는 감염된 세포의 백분율, 특정 표면 마커의 수준 및 감염된 세포의 차동 사멸을 포함한 다수의 파라미터를 측정하기 위해 유세포 분석을 흐르도록 실시 할 수있다. 이러한 프로토콜은 초기 타입 I IFN 생산을 수행하기 위하여 개발되었다하더라도, 이들은 잠재적 PDCS로부터 방출 다른 imuno - 조절 성 분자를 연구 및 HIV-1 타고난 센싱을 규제 분자 메커니즘에 추가 통찰력을 얻기 위해 사용될 수있다.

도 1에 기술 된 공 배양 시스템은 HIV-1의 감지 타고난 대조 시험을 허용한다. 때문에 일차 세포의 가변 특성으로 인해, 이는 골수와 T 세포 (각각 CD14 + 및 CD3 +)의 정상 비율은도 2a에 도시 된 예에서와 같이, 관찰하는 것이 중요하다. 또한, (비 - 활성화 T 세포에 비해 더 높은 FS CD3 레벨) 활성화 T 세포의 낮은 숫자는 갓 격리 된 PBMC 배양 물에서 바람직하다. 여러 세포 유형 사이의 비율이 비정상적인 PBMC를 인해 지속적인 감염의 결과로서 이미 활성화 된 표현형 종종 시험관 가능성에 적절한 선천성 면역 반응을 마운팅 불가능하다. 가장 중요하게는, PDCS의 상대적인 비율은도 2b에 도시 된 바와 같이 평가 될 필요가있다. 이 비율이 0.2 ~ 1.2 %에 따라 다를 수 있지만, 이상 감지 표현형은 extre 모두 관찰된다이 범위의 행. 그림 2B (92 %, 72 %)에서에서 두 가지 예에서 볼 수 있듯이 부정적인 선택을 사용하는 PDC의 농축은 종종 50~95% PDC의 순도를 얻을 수 있습니다. 전체 실험의 전형적인 예는도 3 및도 4에 도시된다. 이 예에서, MT4 세포를 공 배양 (도 3a)의 시간에 30 %의 감염을 달성 pNL4.3-GFP_ires_Nef WT 또는 델타 VPU에 감염되었다. 전술 한 바와 같이, 오직 WT 바이러스 감염 표면 BST2의 상당한 하향 조절 (도 3b)였다. 때문에 크기와 입도 (granularity)에서의 차이로, MT4 세포는 유동 세포 계측법 (그림 4A)에 의해 PBMC를 쉽게 구별 할 수 있습니다. 공동 문화 배양 한 후, 타입 I IFN (그림 4B)의 HIV-1에 감염된 세포 출시 상당한 양의 접촉 알려진 TLR7이나 TLR9 작용제와 PBMC를 접촉 만 PBMC를. 어떤 IFN는 PBMC를 공동 CU에서, 혼자 PBMC를 검출되지 않았다모의에 감염된 MT4 세포와 ltured, 또는 단독으로 감염된 MT4 세포 (그림 4B)에서. 여기에 제시된 실시 예에서, 한 PBMC에 의한 HIV-1 감염 MT4 세포의 타고난 감지 크게 VPU의 존재 하에서 감소되는 것으로 밝혀졌다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1.jpg" width="500px" /> 그림 1 :. 실험 설계의 개요도 SUP : 상층 액을 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2.jpg" width="500px" /> 그림 2 : 갓 격리 된 PBMC와 ENR의 표현형 특성iched PDCS. (A) 골수 세포와 건강한 공여자로부터 단리 된 PBMC에서 관찰 된 T 세포의 정규 분포 (골수 세포의 백분율은 55~65% 사이 % 및 T 세포 사이의 범위 10-20한다). PBMC를 시료 표면의 CD14 (골수 계통 마커) 및 CD3 (T 세포 마커)를 인식 형광 - 복합 항체를 사용하여 염색 하였다. (B) 올라가고의 표현형 특성. 농축 PDCS에 앞서 PBMC를 내의 셀들의 총 수 (도시 예에서는 0.99 %)의 % 0.2에서 1.2 사이 사이에 나타낸다. 이들 세포를 세포 표면에 존재하는 이러한 BDCA2 ILT7 및 특정 마커의 발현에 기초하여 식별 될 수있다. 음성 선별 크게 PDCS 수가 풍부 및 CD14 + 골수 세포 (보충 보인 두 예에서 92 % 및 72 %에 도달하는)와 같은 잠재적으로 해로운 오염을 제거하는데 사용될 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" target="_blank">CLI</a>큰 이미지를 보려면 여기를 CK. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3.jpg" width="500px" /> 도 3 :. pNL4.3-GFP_ires_Nef WT 또는 dVpu 감염 MT4 감염된 배양 물 내의 세포의 HIV-1 감염 대상 MT4 세포의 특성 (A) 백분율 GFP 양성 세포의 백분율에 의해 측정. 감염된 세포에서 (B) BST2의 세포 표면 발현은 표면 염색 후에 평가 하였다. 회색 가득 히스토그램 미리 면역 된 토끼 혈청 (흠 제어)로 염색 모의 - 감염된 세포를 나타내고; 나머지 히스토그램은 항 -Bst2 클론 토끼 혈청으로 염색 된 세포를 나타냅니다. 실선과 히스토그램 제어 GFP 네거티브 (NEG) 세포를 나타냅니다; 점선 히스토그램 감염된 GFP 양성 (POS) 셀들에 대응한다. 독감 평균orescence 강도 (MFI) 값을 각 샘플에 대해 표시된다. 유동 세포 계측법 그림 2에 설명 된대로 수행하고 분석 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4.jpg" width="500px" /> 도 4 :. 갓 격리 된 PBMC 감염된 MT4 T 세포의 공동 배양 된 PBMC와 MT4 T 세포 사이의 단독 MT4 T 세포 관찰 FS / SS 프로필, 단독으로 한 PBMC 또는 공동 배양 유세포의 (A)와 비교. 때문에 크기와 입도 차이에 따라, MT4 T​​ 세포는 유세포 분석기를 이용하여 공동 배양 물에서 PBMCs를 쉽게 구별 할 수있다. (B) TLR와 PBMC를 자극 후에 릴리스 타입 I IFN의 양의 대표적인7 TLR9 작용제 (전), 또는 모의 또는 pNL4.3-GFP_ires_Nef (WT) 또는 dVpu에 감염 표시된 MT4 세포와 공동 배양 후. 원시 데이터는 OD 650 값을 표시하고 해당 converseion는. / ㎖ U로 표시 IFN 농도-I를 입력 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

무 세포 HIV-1 입자와는 달리, 감염된 CD4 + T 세포를 형질 효과적으로 수지상 세포 (PDCS)에 의해 감지된다. 이 원고는 타입 I IFN의 방출에 의해 평가로서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 격리 PDCS는 PDCS 의해 선천성 센싱을 평가하는 HIV-1 감염 T 세포와 공동 배양 방법을 설명한다.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

8.6K 조회수.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM).  무 세포 HIV-1 입자와는 달리, 감염된 CD4 + T 세포를 형질 효과적으로 수지상 세포 (PDCS)에 의해 감지된다. 이 원고는 타입 I IFN의 방출에 의해 평가로서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 격리 PDCS는 PDCS 의해 선천성 센싱을 평가하는 HIV-1 감염 T 세포와 공동 배양 방법을 설명한다. 

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Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

연구

면역학 및 감염병학

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T 세포는 수지상 세포에서 Transinfection에 의해 박테리아를 캡처

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

분리 및<em&gt; 전의 VIVO</emVδ1의&gt; 문화<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T 세포, Extrathymic αβT 세포 선조

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

HIV-1에 감염된 세포에서 엑소 좀의 SILAC 기반 단백체 특성

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

TGF-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4 + T 세포에서 인간의 CD4 + Foxp3의 + 유도 규제 T 세포 (iTregs)의 체외 분화

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...