אנו מודים E. Massicotte וג &#39;ה&#39; לקבלת סיוע טכני מומחה בcytometry זרימה וניסויי מיון תא. כמו כן, ברצוננו להודות לצוות המרפאה IRCM וכל התורמים למתן דגימות דם. דגימות דם היקפיים התקבלו מתורמים מבוגרים בריאים שנתנו בכתב הסכמה מדעת בהתאם להצהרת הלסינקי תחת פרוטוקולי מחקר שאושרו על ידי המועצה לביקורת האתיקה מחקר של מכון דה Recherches Cliniques מונטריאול (IRCM). התקבלו ריאגנטים הבאים באמצעות התכנית מגיב NIH האיידס, החטיבה של האיידס, NIAID, NIH: תאי MT4 מד&quot;ר דאגלס ריצ&#39;מן; וRIL-2 אדם מד&quot;ר מוריס גייטלי, הופמן - לה רוש בע&quot;מ ד&quot;ר כהן הוא הנמען של מחקר קתדרת קנדה בRetrovirology האדם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מCIHR (CIHR 111,226) לד&quot;ר כהן ומהחטיבות דה משוכלל ונדיר du קוויבק-סנטה (FRQ-S) רשת איידס לד&quot;ר Bego וד&quot;ר כהן.

הערות כלליות חשוב לשמור על תאים בתרבית ללא כל אנטיביוטיקה, מאז ניתן חש זיהומים חיידקיים אפילו נשלטים על ידי PBMCs. חישה כגון רכיבי חיידקים תגרום לייצור אינטרפרון רקע שלא ניתן להבחין בין שמופעל על ידי חישת HIV-1 ספציפית. יתר על כן, כל התאים צריכים להיבדק באופן שגרתי על היעדריו של זיהום mycoplasma. תמיד להשתמש בפתרונות ללא רעלן פנימי בכל ההזדמנות אפשרית. אפיון cytometric זרימה של התאים השונים כדי לשמש בשיתוף התרבויות (PBMCs, pDCs, MT4 ותאי CD4 + T) הוא צעד אופציונאלי, אך מומלץ מאוד שכן הוא יכול לספק מידע רב ערך הנדרש לפרשנות נכונה של ניסוי נתון. 1. הכנת תאי יעד נגוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על קו של תאי CD4 + אדם MT4 בRPMI 1640 Mediבתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), המכונה מעתה ואילך כRPMI-1640 בינוניים מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של תאים מסוג CD4 + T העיקריות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי mononuclear מהדם היקפי אדם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד ימפוציטים מסוג CD4 + T באמצעות ערכת סלקציה שלילית תאי CD4 + T, בעקבות ההמלצות של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לימפוציטים מסוג CD4 + הפעל T עם PHA-L (5 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 48 שעות ולאחר מכן לשמור בRPMI-1640 בינוניים מלא בתוספת IL-2 רקומביננטי (100 U / ml). להדביק תאי T שלאחר בידוד 5 ימים ראשוניים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום של תאי מטרה (קו תא MT4 T או תאי CD4 + T Heterologous העיקריים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני תרבות משותפת, להדביק תאי T עם נגיף ה- HIV-1. בדוגמא הספציפית המתוארת כאן pNL4.3-GFP_ires_Nef סוג בר (WT) או וירוסי pNL4.3-GFP_ires_Nef דלתא Vpu (dVpu) היה בשימוש. זני נגיפים אלה מייצגים GREen חלבון ניאון (GFP) -marked שיבוטים מולקולריים זיהומיות isogenic שונה רק ביכולתם להביע את פעולת ה- Vpu. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש multiplicities שונה של זיהום (MOIs) ובחר תרבויות עם רמות דומות של זיהום לשיתוף תרבויות. היום של התרבות המשותפת, לקבוע את האחוז של ה- GFP + תאים על ידי cytometry זרימה כסמן לזיהום. השתמש בתרבויות רק עם טווח של תאים נגועים 20-50% לשיתוף תרבויות. </li></ol></li></ol> צעדים אופציונליים: בצעו צביעת cytometric זרימה בשלב זה להעריך את ביטוי פני השטח של מולקולות / ligands של עניין, כגון BST2, וCD4. עבור מכתים שטח פני תא, resuspend 0.5 x 10 6 תאי T בפתרון לשטוף 100 μl, להוסיף 1 μl של אנטי-CD4_PerCP / Cy5.5 וμl 1 של אנטי-BST2_A660. דגירה צינורות במשך 45 דקות ב 4 ° C, לפני הכביסה עם cytometry זרימת פתרון לשטוף. אם המחקרים שמטרתם להעריך את התפקיד של אנטגוניזם BST2 תיווך Vpu, לבצע חלקיקים HIV-1assay שחרור בשלב זה כפי שתואר לעיל 15. 2. בידוד והעשרה של תאי חישה (PBMCs כולו או pDCs מועשר) הערה: כאשר PBMCs משמש לחישה, להתחיל בידוד בתוך חצי שעה לאחר איסוף דם ולנהל אותו במועד. השתמש PBMCs מייד לשיתוף תרבויות או העשרת PDC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי mononuclear מהדם היקפי אדם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. שלב אופציונאלי: בצע צביעת cytometry זרימה רב-פרמטרית כדי לאשר שPBMCs מבודד טרי מכיל את שושלות תאים השונות ביחסים פיסיולוגיים. עבור מכתים שטח פני תא, resuspend 10 6 PBMCs בפתרון של חסימת Fc 100 μl, דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר החסימה, להוסיף μl 1 של אנטי-CD3_Pacific כחול (לתאי T), 1 μl של אנטי-CD14-PE_Texas אדום (לתאי מיאלואידית), 4 μl של אנטי-BDCA2_APC וμl 1 של אנטי-ILT7_PE (לPDC). דגירהצינורות במשך 45 דקות ב 4 ° C, לפני הכביסה עם cytometry זרימת פתרון לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעשיר pDCs באמצעות ערכת סלקציה שלילית PDC, בעקבות ההמלצות של היצרן. מומלץ לעבוד מהר, לשמור על תאים קרים, ולהשתמש בפתרונות מקוררים מראש. זה ימנע את מכסת של נוגדנים על פני התא ותיוג תא שאינו ספציפי, כמו גם להבטיח את פעילות PDC מקסימלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח התזרים cytometric רב פרמטרית של pDCs המבודדים הטרי כדי לאשר טוהר, אחוז ההעשרה, וכמויות יחסי של סמני משטח ספציפי pDC- (כגון ILT7 וBDCA2). עבור מכתים שטח פני תא, resuspend 10 4 pDCs בפתרון של חסימת Fc 100 μl, דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר החסימה, להוסיף μl 1 של אנטי-CD3_Pacific כחול, μl 1 של אנטי-CD14_PE_Texas אדום, 4 μl של אנטי-BDCA2_APC וμl 1 של אנטי-ILT7_PE. דגירה צינורות במשך 45 דקות ב 4 ° C, לפני הכביסה עם cytometry זרימת פתרון לשטוף (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS). מינימום של 40% טוהר PDC מומלץ (אם חומר ההתחלה יש 0.4% PDC, זה יהיה שווה ערך להעשרה פי 100). </li></ol></li></ol> 3. משותף תרבות של תאים נגועים מסוג CD4 + T ותאי חישה (PBMCs כולו או pDCs מועשר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 220 μl של PBMCs (/ מיליליטר בריכוז הנע בין 100,000 ל 500,000 תאים) (בדילול ב850,000 תאים / מיליליטר) או 220 μl של pDCs עם 30 μl של תאי T נגועים (בדילול ב 10 6 תאים / מיליליטר) לכל גם ב צלחת גם 96 U-תחתון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפקדים, PBMCs צלחת או pDCs ותאי T לבד. להתאים את עוצמת קול ובל -250 μl עם RPMI 1640 בינוניים מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך תגובות הסלולר אגוניסט הידוע של מסלולי TLR7 וTLR9. לשם כך, 220 μl הצלחת של PBMCs (בדילול ב850,000 תאים / מיליליטר) או 200 μl של pDCs (בריכוז הנע בין 100,000 ל 500,000 תאים / מיליליטר) לכל היטב בצלחת גם U-תחתונה 96 ולהוסיף אגוניסט TLR7 ( אימיquimod, ריכוז סופי: 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) או אגוניסט TLR9 (ODN 2,216 CPG-, ריכוז סופי: 5 מיקרומטר). דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל18-22 שעות ולעבד אותם באופן דומה לשיתוף התרבויות המתוארות להלן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שיתוף תרבויות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל18-22 שעות, ולאחר מכן להעביר אותם לצלחת גם 96 V-תחתון. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x גרם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את supernatants לצלחת גם 96 בעלת תחתית. ניתן לאחסן supernatants ב -80 ° C או המשמש לזיהוי סוג אני IFN מייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי שיתוף תרבותי בparaformaldehyde 2% ולנתח אותם באמצעות cytometry זרימה. בשל הבדלים בגודל ובפרור, תאי MT4 הם להבחין בקלות מPBMCs או pDCs מבוסס על תופעות פיזורם (SS) לעומת קדימה-פיזור פרופילים (FS). אם תאי T עיקריים משמשים כתאי מטרה נגועה, אלה יכולים להיות מוכתמים עם כל צבע גשש תא, כגון CSFE, לשתף תרבות קודמת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדידה ביו-הסוג אני IFN שימוש בתאי כתב β HEK-הכחול IFN-α /. הערה: תאים אלה נוצרו על ידי transfection היציב של תאי HEK293 עם גני STAT2 וIRF9 אדם להשיג סוג פעיל באופן מלא אני IFN מסלול איתות. הם גם מכילים את גן כתב phosphatase אלקליין המופרש (SEAP) תחת שליטתו של IFN-α / β אמרגן ISG54 מושרה. גירוי של תאים אלה עם סוג אני IFN מפעיל את JAK / STAT / ISGF3 מסלול וגורם ייצור של SEAP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי HEK-הכחול IFN-α / β DMEM בתוספת 10% FBS. צלחת אותם בצפיפות של 50,000 תאים לכל גם בצלחת גם 96 בעלת תחתית, בנפח סופי של 180 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של supernatant התרבות המשותפת לכל טוב בשני עותקים. כל צלחת גם דורשת קבוצה של פקדים סטנדרטיים פנימיים (IFNα אדם, ריכוז סופי של 100 U / ml 2500 U / ml). דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 18שעה -22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע רמות של פעילות בסיסית phosphatase באמצעות פתרון Quanti-הכחול, שמשתנה מורוד לסגול / כחול בנוכחות של האנזים. הכן Quanti-כחול בעקבות ההמלצות של היצרן. להוסיף 180 μl של פתרון זה היטב בכל צלחת גם 96 בעלת תחתית. לכל אחד גם להוסיף גם 20 μl של supernatants תאי HEK-הכחול IFN-α / β המושרה, ודגירת הצלחת בחממה 37 ° C עד הצבע מתפתח בבארות שליטת IFN סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך רמות של SEAP באמצעות ספקטרופוטומטר ב620-655 ננומטר ולקבוע את הריכוז של הסוג-אני IFN על ידי ניפוח מהחלק ליניארית של העקומה סטנדרטית IFN. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Colonna, M., Trinchieri, G., Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+immunity.">Plasmacytoid dendritic cells in immunity.</a> Nature immunology. 5, 1219-1226 (2004).</li><li>Lepelley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+sensing+of+HIV-infected+cells.">Innate sensing of HIV-infected cells.</a> PLoS pathogens. 7, e1001284 (2011).</li><li>Beignon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+HIV-1+activates+plasmacytoid+dendritic+cells+via+Toll-like+receptor-viral+RNA+interactions.">Endocytosis of HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Toll-like receptor-viral RNA interactions.</a> The Journal of clinical investigation. 115, 3265-3275 (2005).</li><li>Martinelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+gp120+inhibits+TLR9-mediated+activation+and+IFN-{alpha}+secretion+in+plasmacytoid+dendritic+cells.">HIV-1 gp120 inhibits TLR9-mediated activation and IFN-{alpha} secretion in plasmacytoid dendritic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3396-3401 (2007).</li><li>Cao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+TLR7/9+responses+in+plasmacytoid+dendritic+cells+by+BST2+and+ILT7+receptor+interaction.">Regulation of TLR7/9 responses in plasmacytoid dendritic cells by BST2 and ILT7 receptor interaction.</a> The Journal of experimental medicine. 206, 1603-1614 (2009).</li><li>Bego, M. G., Mercier, J., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-activated+interferon+regulatory+factor+7+upregulates+expression+of+the+interferon-regulated+BST2+gene+independently+of+interferon+signaling.">Virus-activated interferon regulatory factor 7 upregulates expression of the interferon-regulated BST2 gene independently of interferon signaling.</a> Journal of virology. 86, 3513-3527 (2012).</li><li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu.">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li><li>Miyagi, E., Andrew, A. J., Kao, S., Strebel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpu+enhances+HIV-1+virus+release+in+the+absence+of+Bst-2+cell+surface+down-modulation+and+intracellular+depletion.">Vpu enhances HIV-1 virus release in the absence of Bst-2 cell surface down-modulation and intracellular depletion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2868-2873 (2009).</li><li>McNatt, M. W., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpu+binds+directly+to+tetherin+and+displaces+it+from+nascent+virions.">Vpu binds directly to tetherin and displaces it from nascent virions.</a> PLoS pathogens. 9, e1003299 (2013).</li><li>Manel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryptic+sensor+for+HIV-1+activates+antiviral+innate+immunity+in+dendritic+cells.">A cryptic sensor for HIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells.</a> Nature. 467, 214-217 (2010).</li><li>Yan, N., Regalado-Magdos, A. D., Stiggelbout, B., Lee-Kirsch, M. A., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytosolic+exonuclease+TREX1+inhibits+the+innate+immune+response+to+human+immunodeficiency+virus+type+1.">The cytosolic exonuclease TREX1 inhibits the innate immune response to human immunodeficiency virus type 1.</a> Nature immunology. 11, 1005-1013 (2010).</li><li>Fonteneau, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+activates+plasmacytoid+dendritic+cells+and+concomitantly+induces+the+bystander+maturation+of+myeloid+dendritic+cells.">Human immunodeficiency virus type 1 activates plasmacytoid dendritic cells and concomitantly induces the bystander maturation of myeloid dendritic cells.</a> Journal of virology. 78, 5223-5232 (2004).</li><li>Ankel, H., Capobianchi, M. R., Frezza, F., Castilletti, C., Dianzani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+induction+by+HIV-1-infected+cells:+a+possible+role+of+sulfatides+or+related+glycolipids.">Interferon induction by HIV-1-infected cells: a possible role of sulfatides or related glycolipids.</a> Virology. 221, 113-119 (1996).</li><li>Schmidt, B., Ashlock, B. M., Foster, H., Fujimura, S. H., Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-infected+cells+are+major+inducers+of+plasmacytoid+dendritic+cell+interferon+production,+maturation,+and+migration.">HIV-infected cells are major inducers of plasmacytoid dendritic cell interferon production, maturation, and migration.</a> Virology. 343, 256-266 (2005).</li><li>Bego, M. G., Dube, M., Mercier, J., Cohen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+calcium-modulating+cyclophilin+ligand+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+particle+release+and+cell+surface+expression+of+tetherin.">Effect of calcium-modulating cyclophilin ligand on human immunodeficiency virus type 1 particle release and cell surface expression of tetherin.</a> Journal of virology. 83, 13032-13036 (2009).</li><li>Grouard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigmatic+plasmacytoid+T+cells+develop+into+dendritic+cells+with+interleukin+(IL)-3+and+CD40-ligand.">The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand.</a> The Journal of experimental medicine. 185, 1101-1111 (1997).</li><li>Fitzgerald-Bocarsly, P., Jacobs, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+HIV+infection:+striking+a+delicate+balance.">Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection: striking a delicate balance.</a> Journal of leukocyte biology. 87, 609-620 (2010).</li><li>Bego MG, ., C&#244;t&#233;, &. #. 2. 0. 1. ;., Aschman, N., Mercier, J., Weissenhorn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohen+&#201;A.+Exploits+the+Cross-Talk+between+BST2+and+the+ILT7+Receptor+to+Suppress+Anti-HIV-1+Responses+by+Plasmacytoid+Dendritic+Cells.">Cohen &#201;A. Exploits the Cross-Talk between BST2 and the ILT7 Receptor to Suppress Anti-HIV-1 Responses by Plasmacytoid Dendritic Cells.</a> PLoS Pathog. 11 (7), e1005024 (2015).</li></ol>

הפרוטוקולים שתוארו כאן למדוד חישה של תאי T נגועים בוירוסים מתויג GFP HIV-1 שנבדלים רק ביכולתם להביע את פעולת ה- Vpu, כפי שתוארו בדו&quot;ח האחרון שלנו 18. עם זאת, יכולים היו בקלות להיות שונה בשיטות אלה כדי ללמוד חישה של וירוסים לא מתויגים כמו גם וירוסים חסרי גנים נגיפיים אחרים שעלולים לווסת חישה מולדת. אם הווירוסים משמשים לא להביע GFP, אחוז תאי יעד הנגועים צריכים להיקבע על ידי אמצעים אחר לפני תרבות משותפת, כגון p24 (קפסיד) מכתימה תאית וcytometry זרימה או על ידי p24 ELISA. יתר על כן, ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה עם תאי T היעד שונים, כוללים מגוון רחב של שורות תאים זמינות ותאים ראשוניים. יש השיטות שתוארו בכתב היד הזה יש מספר היתרונות בהשוואה לשיטות המוקדמות נהגו ללמוד חישת HIV-1. בראש ובראשונה את זה כבר נקבע על ידי מספר הקבוצות שp HIV-1-תא ללאמאמרים מעוררים עניים מהסוג-אני IFN 2,13,14. יתר על כן, מחקרים מוקדמים הסתמכו על שיטות מבוססות ELISA IFNα מבוגרות לכמת את כמות סוג אני IFN מיוצרת. הגבלה של טכניקת זיהוי זה היא שרוב ערכות IFNα ELISA המבוגרות למדוד רק סוג אחד של IFNα, בעוד שמשקיף סוגי IFNα וIFNβ האחרים. השימוש בשורות תאי הכתב תיארו מתגברת על מגבלה זו כריכוז של כל הצורות ביו של IFNs סוג-אני האנושי ניתן למדוד בפעם אחת. הטכניקה היא רגישה מאוד, יקרה פחות מהדור החדש של ערכת ELISA IFN ולתורמים רבים כמויות גדולות של הסוג-IFN אני יכול בקלות להיות מזוהות. עם זאת, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לשימוש עם סוג אני IFN שיטות אחרות לקריאה החוצה כגון ELISAs. צעדים קריטיים: חשוב שהאיכות של כל המרכיבים התאיים (המטרות והן effectors) להיות מבוקרת היטב. זיהום פוטנציאלי, גם כאשר asymptomatic, צריך להיות במעקב ובשליטה. כפי שהזכרנו קודם לכן, אנטיביוטיקה בשליטת זיהום חיידקים ללא תסמינים, ופתוגנים תאיים פוטנציאלי אחרים כגון mycoplasma, יכולים ליצור תגובה חיסונית דומה לאלה שנצפו לאחר הדבקת HIV-1, כלומר ייצור של הסוג-אני IFN. יתר על כן, כל חומרים כימיים צריכים להיות חופשי של LPS או אנדוטוקסינים פוטנציאליים אחרים. כמו כן, ניטור של PBMCs וpDCs חשוב גם כן לעתים קרובות יכולות להיות דרוכים דגימות אנושיות על ידי זיהומים מתמשכים הבסיסיים, אשר עשוי להשפיע חישה נורמלית. אנחנו תמיד ממליצים כוללים בקרות שליליות המוצעות, כגון העדר תאי יעד, כמו גם שיתוף תרבויות עם תאים נגועים מדומים. כדאיות של תאים נגועים היא גם חשובה לחישה נכונה PDC מאז סוג אני IFN אינו מיוצר הבא תרבות משותפת עם תאים אפופטוטיים 2,14. מגבלה חשובה אחת של הטכניקה היא את הצורך בתאים ראשוניים מבודדים טרי. הליך זה לא היה<html> נבדק באמצעות PBMCs או pDCs שהוקפאו או נשמר בתרבות או בעבר. הבידוד של PBMCs הוא עבודה אינטנסיבית ויש לי תאים אלה אורך חיים מוגבלים מאוד. יתר על כן, יש להשתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים להגנה מפני פתוגנים שמקורן בדם בעת שעבדו עם דם אנושי. לעתים קרובות יש כמה מקורות שונות הקשורים בעבודה הכרוכה בתאים אנושיים מבודדים טרי. ביניהם ההליכים השונים יושמו לבודד תאים אלה, וההשתנות בירושה נתקלו מתורם לתורם הם. בעוד שאי אפשר להימנע משונות בין תורם, השימוש בפקדים חיוביים הציעו, כגון מדידת תגובה לאגוניסטים ידועים של מסלולי TLR7 וTLR9, יספק בקרה פנימית חשובה לניסויים אלה. אנחנו הבחנו שתגובה חזקה לאגוניסטים של מסלול TLR9 יכולה להיות מתואמות עם תגובת PDC בריאה, ואילו נדרש מסלול TLR7 מגיב לתגובה הולמת נגד HIV-1 3. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; בהתבסס על תצפיות שנעשו על ידי אותנו ואחרים 2, העשרת pDCs מPBMCs לעתים קרובות אין צורך. עם זאת, אם עיצוב ניסיוני דורש את זה (למשל בהקשר שבו יש צורך בדלדול של סמני משטח PDC ספציפיים) סלקציה שלילית עדיף על בחירה חיובית, כמו תאים להישאר חופשיים של נוגדן לאחר תהליך הבחירה. pDCs המבודד עובר אפופטוזיס המהיר בתרבות. לניסויים הדורשים תאים אלה להיות מתורבתים לתקופה ארוכה של זמן, יכולה להיות בתוספת תקשורת ותרבות עם IL-3. ציטוקינים זה גורם התפשטות PDC ומעכב אפופטוזיס 16. עם זאת, IL-3 שימוש צריך להיות מבוקר היטב שכן הוא עלול להוביל להתבגרות או בידול PDC. השיטה המתוארת כאן משלבת יעד HIV-1 תאים נגועים בPBMCs או pDCs המבודדים טרי כדי לשחזר מעורבים בחישה מולדת הצעדים הראשוניים. שיטה זו תהיה ללא ספק להיות שימושית לExplorאירועי הדואר מוקדמים מולדים חיסוניים קשורים לזיהום HIV. למרות שהפרוטוקולים הנלווים מכוונים מדידה מסוג אני IFN, הם יכלו בקלות להיות שונה כדי למדוד מולקולות ביו אחרות שוחררו מpDCs בעת ההכרה של תאים נגועים. אלו יכולים לכלול: סוג III-IFN (IFN-λ), ציטוקינים פרו-דלקתיים (כגון TNF-α ו- IL-6) וCXCL10 כמוקינים, CCl4, וCCL5 17.

<html> pDCs IFN-ייצורי-הקלד מייצג את קו הגנה הראשון מפני זיהומים נגיפיים, ובתור שכזו ישמש כקישור חיוני בין חסינות מולד אדפטיבית 1. בעוד חלקיקי HIV-1-תא ללא מזוהים היטב על ידי מערכת החיסון המולדת, תאי CD4 + T נגוע HIV-1 הם חשו ביעילות על ידי pDCs 2. מנגנון החישה דורש קשר ראשוני בין גליקופרוטאין הנגיפי המעטפה (gp120) על פני השטח של התאים הנגועים T מסוג CD4 ומולקולות בPDC, אשר לאחר מכן ואחריו ללכוד וירוס והפנמה על ידי PDC. הכרה עוקבת RNA HIV-1 שהועבר על ידי TLR7 מפעילה את ההפעלה של Myd88 / מסלול IRF7 וסופו של דבר מובילה לסוג-שהייצור IFN 3. חשוב לציין, המסלול השני החישה הנוכחי בpDCs, אשר מתווך על ידי TLR9, הוא מעוכב על ידי האינטראקציה של גליקופרוטאין הנגיפי, gp120, עם BDCA2 סמן משטח PDC הספציפי 4. &gt; מסלולי חישת TLR7 וTLR9 של PDC יכולים להיות מווסת על פוטנציאל שלילי על ידי ההתקשרות של BST2 (גם המיועדת Tetherin או CD317) עם עוד קולט מעכב משטח PDC ספציפי נקרא ILT7 5. BST2 מתבטא ברמות גבוהות על פני השטח של pDCs וכמה תאי סרטן, אך ברמות נמוכות יחסית בסוגי תאים אחרים, כגון תאי B, מקרופאגים, תאי T ו. חשוב לציין, יכול להיגרם על ידי BST2 סוג אני IFN במספר שורות תאים הפכו, כמו גם בתרביות תאים ראשוניות של מקורות אנושיים ועכבריים 6. מלבד תפקוד מערכת חיסון-הרגולציה שלה, BST2 נמצא לאחרונה כדי לעכב את שחרורו של HIV-1 ואחר עטפו חלקיקים נגיפיים על ידי חלקיקי נגיף המתהווים cross-linking על פני השטח של התאים הנגועים 7. במקרה של HIV-1, חלבון אבזר קידוד הווירוס U (Vpu) הוצג לפעול כיריב BST2. הוא האמין כי פעולת ה- Vpu downregulates BST2 מתא השטח של תאים נגועים בנגיף HIV-1, באתר שלה לקשורing פעילות וכתוצאה מכך משפר את השחרור נגיפי ולהפיץ 7, למרות שרעיון זה כבר אתגר 8,9. בהעדר פעולת ה- Vpu, מספר גדול של נוצר באופן מלא וחלקיקי HIV-1 צאצאים בוגרים נשמרים על פני התא. אם חלקיקים קשורים אלה יכולים לייצג מטרות יעילות לחישה חיסונית עדיין נותר פתוח. בנוסף, לא ברור אם פעולת ה- Vpu תוכל dysregulate ייצור IFN-אני סוג מpDCs על ידי ויסות משטח BST2 רמות. מחקרים מוקדמים נועדו להעריך חישת HIV-1 נערכו באמצעות חלקיקים HIV-1 ללא סלולריים, שנחשבים בדרך כלל מעוררים עניים מסוג-אני IFN 3,10-12. בהתחשב בכך שהמחקרים האחרונים מראים כי PBMCs וpDCs יעילות לחוש לימפוציטים מסוג CD4 + T נגוע ב- HIV 2,13,14, אנו מתארים כאן שיטה פשוטה למדידת תגובות מולדת מופעלות על ידי pDCs בעת ההכרה של תאים נגועים בנגיף HIV-1 במבחנה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="652">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">MT4 cells</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">120</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 from Dr. Douglas Richman.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-Blu IFN-&#945;/&#946; reporter cells </td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">HKB-IFNAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">RPMI</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">DMEM</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">FBS</td>
			<td style="width:87px;">Wisent</td>
			<td style="width:103px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Ficoll-P&#226;que Plus</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CD4+ T cell isolation kit II</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-091-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Diamond Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II </td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-097-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">PHA-L</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">O2769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">Human rIL-2</td>
			<td style="width:87px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:103px;">136</td>
			<td style="width:260px;">This reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Imiquimod</td>
			<td style="width:87px;">Invivogen</td>
			<td style="width:103px;">TLRL-IMQS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ODN 2216 CpG-A</td>
			<td style="width:87px;">Hycult Biotec</td>
			<td style="width:103px;">HC4037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">Human IFN&#945;</td>
			<td style="width:87px;">PBL Interferon source</td>
			<td style="width:103px;">11100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QUANTI-Blue </td>
			<td style="width:87px;">Cedarlane</td>
			<td style="width:103px;">REP-QB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Flow cytometry (Antibodies/reagents)</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Fc blocking solution (composition below):</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td style="width:260px;">Note: make in washing solution (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Goat serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">G 9023</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Rabbit serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">R 9133</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">10% Mouse serum</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M 5909</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">2.5 mg/ml human IgG</td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">I 4506</td>
			<td style="width:260px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD3_Pacific Blue</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">300417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">anti-CD14_PE-TxRed</td>
			<td style="width:87px;">Life Technologie</td>
			<td style="width:103px;">MHCD1417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BDCA2_APC</td>
			<td style="width:87px;">Myltenyi</td>
			<td style="width:103px;">130-090-905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-ILT7_PE</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">326408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-CD4_PerCP/Cy5.5</td>
			<td style="width:87px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">317427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-BST2_Alexa 660</td>
			<td style="width:87px;">eBioscience</td>
			<td style="width:103px;">50-3179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">Paraformaldehyde </td>
			<td style="width:87px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">P 6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:87px;">BD Falcon </td>
			<td style="width:103px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;"> </td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td style="width:103px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Cyan ADP instrument </td>
			<td style="width:87px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:103px;">CY20030</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the innate sensing of hiv-1 infected cd4+ t cells by plasmacytoid dendritic cells using an ex vivo co-culture system.

HIV-1 חישה מולדת דורשת מגע ישיר של תאים מסוג CD4 + T נגועות בתאים דנדריטים plasmacytoid (PDC). על מנת ללמוד את התהליך הזה, הפרוטוקולים המתוארים כאן להשתמש בתאים מבודדים טרי אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) או תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC) לחוש זיהומים באו קו T תא (MT4) או תאי CD4 + T Heterologous העיקריים. על מנת להבטיח חישה נכונה, זה חיוני כי PBMC מבודדים מייד לאחר איסוף דם ושהאחוז האופטימלי של תאי T נגועים משמש. יתר על כן, מכתים התזרים cytometric רב פרמטרית ניתן להשתמש כדי לאשר כי דגימות PBMC מכילות את שושלות תאים השונות ביחסים פיסיולוגיים. מספר הפקדים יכול להיכלל גם להעריך את הכדאיות ואת הפונקציונליות של pDCs. אלה כוללים, הנוכחות של סמני משטח ספציפיים, הערכת תגובות הסלולר אגוניסט הידוע של רצפטורים אגרה-כמו (TLR) מסלולים, ומאשר חוסר sponייצור taneous סוג אני אינטרפרון (IFN). במערכת זו, PBMCs או pDCs המבודדים טרי הם שיתוף תרבותי עם HIV-1 תאים נגועים ב 96 צלחות גם ל18-22 שעות. Supernatants משיתוף תרבויות אלה משמשים לאחר מכן כדי לקבוע את הרמות של IFNs סוג אני ביו ידי ניטור ההפעלה של מסלול ISGF3 בתאים / β IFN-α HEK-הכחול. לפני ובמהלך תנאי שיתוף תרבות, יכולים להיות נתונה תאי יעד לניתוח תזרים cytometric לקבוע מספר הפרמטרים, ביניהם אחוז התאים הנגועים, הרמות של סמני משטח ספציפיים, והרג ההפרש של תאים נגועים. אמנם, פרוטוקולים אלה פותחו בתחילה כדי לעקוב ייצור מסוג אני IFN, הם עלולים לשמש כדי לחקור מולקולות imuno-modulatory אחרים שוחררו מpDCs ולהשיג תובנה נוספת לתוך המנגנונים המולקולריים השולטים HIV-1 חישה מולדת.

מערכת שיתוף התרבות המתוארת באיור 1 מאפשרת למחקר מבוקר של HIV-1 חישה מולדת. בשל האופי המשתנה של תאים ראשוניים, חשוב שהיחסים נורמלים של מיאלואידית ותאי T (CD14 + וCD3 + בהתאמה) הם נצפו, כמו בדוגמא המוצגת באיור 2 א. יתר על כן, רק מספר נמוך של תאים מופעלים T (FS גבוה יותר ורמות גבוהות יותר CD3 בהשוואה לתאי T מופעל ללא) רצוי בתרבויות PBMCs המבודדים הטרי. PBMCs עם יחסים נורמליים בין תאים מהסוגים השונים הם לעתים קרובות לא מסוגל הרכבה תגובה חיסונית מולדת נכונה במבחנה, כנראה עקב פנוטיפ כבר הופעל כתוצאה מזיהום מתמשך. והכי חשוב, את האחוז היחסי של pDCs צריך להיות מוערך כפי שמוצג באיור 2. למרות שאחוז זה יכול להשתנות 0.2-1.2%, פנוטיפ חישה נורמלי הוא ציין גם עם שני extreMES של טווח זה. העשרת pDCs באמצעות סלקציה שלילית לעתים קרובות מניבה 50-95% טוהר PDC, כפי שניתן לראות בשתי דוגמאות באיור 2 (92% ו -72%). דוגמא טיפוסית לניסוי הכולל מוצגת באיורים 3 ו -4. בדוגמא זו, תאי MT4 נדבקו pNL4.3-GFP_ires_Nef WT או דלתא Vpu להשיג זיהום 30% בזמן של התרבות המשותפת (איור 3 א). כפי שתואר לעיל, רק הזיהומים בוירוס WT הביאו את תקנה משמעותית של BST2 פני השטח (איור 3). בשל חילוקי הדעות ביניהם בגודל ובגרעיניות, תאי MT4 ניתן להבחין בקלות מPBMCs ידי cytometry זרימה (איור 4 א). לאחר הדגירה התרבות המשותפת, PBMCs רק במגע עם אגוניסט הידוע TLR7 או TLR9 וPBMCs במגע עם HIV-1 כמויות משמעותיות תאים נגועים שוחררו מהסוג-אני IFN (איור 4). אין IFN זוהה בPBMCs לבד, בשיתוף מ&quot;ק PBMCsltured עם תאי MT4 נגועים מדומים, או בתאים נגועים MT4 לבד (איור 4). בדוגמא שהוצגה כאן, חישה מולדת של תאי MT4 נישאים HIV-1 על ידי PBMCs נמצאה להיות מופחת באופן משמעותי בנוכחות Vpu. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1.jpg" width="500px" /> איור 1:. סקירה סכמטי של תכנון ניסוי SUP: supernatant <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2.jpg" width="500px" /> איור 2: אפיון פנוטיפי של PBMCs וenr המבודדים טריpDCs iched. () התפלגות נורמלית של תאי מיאלואידית ותאי T שנצפו בPBMCs מבודד מתורם בריא (אחוז מתאי מיאלואידית צריך לנוע בין 10-20% ותאי T בין 55-65%). מדגם PBMCs היו מוכתם באמצעות נוגדני fluorophore מצומדות שיכירו CD14 פני השטח (סמן שושלת מיאלואידית) וCD3 (סמן תא T). אפיון פנוטיפי של pDCs (B). לפני pDCs העשרה מייצג בין .2-1.2% מהמספר הכולל של תאים בתוך PBMCs (0.99% בדוגמא מוצגים). ניתן לזהות תאים אלה מבוססים על ביטוי של סמנים ספציפיים, כגון BDCA2 וILT7, שנכחו בשטח פני התא. סלקציה שלילית יכולה לשמש כדי להעשיר באופן משמעותי את מספר pDCs ולחסל זיהומים שעלולים להיות מזיקים, כגון תאי CD14 + מיאלואידית (העשרה להגיע 92% ו -72% בשתי דוגמאות מוצגות). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" target="_blank">CLI</a>CK כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3.jpg" width="500px" /> אחוז אפיון של תאי MT4 יעד נישאים HIV-1 (א) של תאים נגועים בתרבויות MT4 הנגועים בpNL4.3-GFP_ires_Nef WT או dVpu כפי שנקבעו על ידי אחוז התאים החיוביים GFP: איור 3.. ביטוי פני תא (ב &#39;) BST2 בתאים הנגועים הוערך לאחר צביעת פני השטח. היסטוגרמות האפורה מילא מייצגת תאים נגועים מדומים מוכתמים בדם לפני חיסון הארנב (שליטה בלא כתם); היסטוגרמות שנותרה לייצג תאים מוכתמים בסרום ארנבת polyclonal אנטי-BST2. היסטוגרמות עם קווים מוצקים מייצגת שלילי שליטת GFP (נג) תאים; בעוד היסטוגרמות עם קווים מקווקווים מתאים לתאים נגועים GFP חיוביים (POS). אומר שפעתעוצמת orescence ערכים (MFI) מצוינים עבור כל דגימה. Cytometry זרימה בוצע ונותח, כמתואר באיור 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4.jpg" width="500px" /> איור 4:. תרבות Co של PBMCs מבודד טרי ותאי T נגועים MT4 () השוואת cytometry זרימת פרופילי FS / SS נצפו לתאי T MT4 לבד, PBMCs לבד, או שיתוף תרבויות בין PBMCs ותאי T MT4. בשל הבדלים בגודל ובגרעיניות, תאי T MT4 ניתן להבחין בקלות מPBMCs בשיתוף תרבויות באמצעות cytometry זרימה. דוגמא מייצגת של כמות סוג אני IFN שוחררה לאחר גירוי של PBMCs עם TLR (ב)7 או אגוניסט TLR9 (לפני), או לאחר שיתוף תרבויות עם מדומה או תאי MT4 המצוין נגועים בpNL4.3-GFP_ires_Nef WT או dVpu. הנתונים גולמיים מוצגים כOD 650 ערכים וconverseion המקביל להקליד-אני ריכוז IFN לידי ביטוי בU / ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System. at JoVE.com

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

בניגוד לחלקיקים HIV-1 ללא סלולריים, תאי CD4 + T נגוע הם חשו ביעילות על ידי תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC). כתב יד זה מתאר שיטה שבה תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) או pDCs המבודד הם שיתוף תרבותיים עם HIV-1 תאי T נגועים כדי להעריך חישה מולדת על ידי pDCs כפי שהוערכו על ידי שחרורו של הסוג-אני IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

assessing-innate-sensing-hiv-1-infected-cd4-t-cells-plasmacytoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

8.6K Views.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM).  בניגוד לחלקיקים HIV-1 ללא סלולריים, תאי CD4 + T נגוע הם חשו ביעילות על ידי תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC). כתב יד זה מתאר שיטה שבה תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) או pDCs המבודד הם שיתוף תרבותיים עם HIV-1 תאי T נגועים כדי להעריך חישה מולדת על ידי pDCs כפי שהוע...

Video: Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

ובידוד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות של Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

אפיון proteomic SILAC מבוסס של Exosomes מ- HIV-1 תאים נגועים

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...