Este protocolo puede capturar cinética en tiempo real a nivel unicelular. Podemos medir parámetros celulares individuales en respuesta a la infección por VIH y asociar eventos de señalización temprana con pasos retrasados del ciclo de vida viral. Esta es una alternativa escalable integrada a los métodos de imagen tradicionales que utilizan una nueva plataforma optofluídica para la clasificación unicelular, el cultivo, la creación de imágenes y la automatización de software.
Este es el primer método establecido para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico, de alto rendimiento y la obtención de imágenes. Esta técnica se puede adoptar ampliamente para estudiar la cinética de señalización celular y las interacciones moleculares dinámicas en una variedad de estados de la enfermedad. La demostración visual de este método es importante para transmitir cómo se configura el experimento, cómo se clasifican ópticamente las células en bolígrafos y cómo configurar infusiones a través del chip.
Para comenzar, prepare la solución de carga fresca Fluo-4 AM agregando 25 microlitros de disolvente detergente concentrado 100X y 2.5 microlitros de 1, 000X Fluo-4 AM a un tubo de 1.5 mililitros, luego vórtice para mezclar. Pipetear 2,5 mililitros de medios de cultivo en la solución de carga e invertir para mezclar. Centrifugar dos millones de células MT-4 a 500 veces G durante tres minutos, luego retire los medios y vuelva a llenar el pellet en dos mililitros de la solución de carga Fluo-4 AM preparada.
Pipeta re-suspendió las células en una placa de Petri de 35 milímetros. Incubar a 37 grados Centígrados durante 15 a 30 minutos, luego incubar durante 15 a 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. Transfiera la suspensión de la célula a un tubo de centrífuga y centrífuga las células a 500 veces G durante tres minutos, luego retire el sobrenadante.
Resuspend el pellet celular pipeteando en un mililitro del medio de cultivo y centrífuga a 500 veces G durante tres minutos para lavar. Resuspend el pellet celular pipeteando en el medio de cultivo a una concentración de dos millones de células por mililitro durante al menos 50 microlitros. Para preparar un chip con la solución humectante, que facilita la fijación de la célula, cargue tubos centrífugos que contengan dos mililitros de solución humectante y 50 mililitros de agua desionizada en el instrumento con un nuevo chip optofluídico y ejecute la función de chip húmedo que inundará el chip con la solución humectante.
Incube el chip a 50 grados Centígrados y enjuague el chip con agua tres veces. Una vez que se realiza el lavado de agua, enjuague el chip con tres ciclos de 250 microlitros de medios de cultivo. Complemente la suspensión celular del paso anterior con una por cada 100 partes de soluto detergente F127 antes de la carga para reducir la probabilidad de que las células se peguen a los canales de la viruta.
Utilice la aguja de exportación del instrumento para importar células de un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros con la operación de carga y la importación de pequeño volumen para un volumen de paquete de celdas de cinco microlitros. Celdas de pluma que utilizan un posicionamiento optoelectrónico optimizado o voltaje OEP de 4.3 voltios y cinco micrómetros por segundo de velocidad de la jaula mediante el uso de la función de lápiz automático, que detectará automáticamente las celdas individuales, las rodeará con una jaula OEP y las moverá a una pluma cercana. Si las celdas de interés permanecen después del esclarecer automático, utilice la función de lápiz manual para seleccionar las celdas de destino y un lápiz de destino.
Una vez que se haya completado el penning, enjuague el chip con tres ciclos de 250 microlitros de medios de cultivo para eliminar cualquier celda restante sin costo del chip. Después de escribir las células, obtenga imágenes fluorescentes de las células en los canales FITC, Texas Red y DAPI para medir la línea de base Fluo-4, mCherry y autofluorescencia. Infundir el VIH-1 en el microchip a una concentración de 13 nanogramos de NLCI vih-1 por cada dos millones de células mediante la canalización lenta de la suspensión en el chip a través de la aguja de exportación.
Inmediatamente después de la adición del VIH-1, obtenga repetidamente imágenes en los canales FITC y DAPI durante un curso de tiempo de 10 minutos. Obtenga imágenes en los canales Texas Red y DAPI a los uno, dos, tres y cuatro días después de la infección. Esta metodología se utilizó para la identificación y agrupación de células infectadas y no infectadas por el VIH a través de la medición de mCherry.
Las células con un cambio en la señal de mCherry mayor o inferior a 40, 000 intensidad fluorescente media se agruparon en la población alta o baja de mCherry, respectivamente. Estos racimos eran analizados para la cinética de la afluencia del calcio midiendo el calcio intracelular usando fluorescencia Fluo-4 en varias ocasiones sobre un curso de nueve minutos del tiempo, que demostró afluencia temprana del calcio en células VIH-infectadas. Una correlación positiva significativa entre la afluencia del calcio y la florescencia del mCherry fue observada.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar comenzar con las células dentro del rango de crecimiento exponencial tanto para la producción de virus como para la infección porque las células cubiertas de vegetación resultarán en una disminución dramática de la señal de este ensayo. Trabajar con el VIH-1 puede ser peligroso. Por lo tanto, las prácticas de BSL-2 como se indica en el Estándar de Patógenos transmitidos por la sangre de OSHA siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.
Esta técnica es emocionante porque nos permitirá estudiar los cambios fenotípicos o transcripcionales unicelulares en condiciones controladas. Esto tiene un amplio potencial para correlacionar el impacto de los estímulos en las vías moleculares en muchos tipos de células.
