Agradecemos al Dr. Soshana Svendsen para la revisión y edición de este informe crítico. Este trabajo ha sido aportada por el NIH / NINDS 1U24NS078370-01 y el CIRM Dr2a-05320.

Los autores no tienen nada que revelar.

<img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Esquema de cortar. Expandiendo las células madre esferoide / progenitoras en la cultura con el método de cortar mecánica. Pasos críticos Una visión general del paradigma de la expansión de picar se muestra en la Figura 6. HNPC tamaño de la esfera es uno de los ...

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Brandon C. Shelley 
to:
Clive Svendsen

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Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Hay una larga historia de la expansión de las células madre neurales de roedores en la cultura, ya sea como una monocapa 1-3 o 4-7 neuroesferas agregados. Además, las células progenitoras neurales humanas (hNPCs) aisladas a partir de diversas regiones del sistema nervioso central en desarrollo 8-17 han sido expandidas in vitro. Estas células son bi-potentes, capaces de diferenciarse en astrocitos y neuronas y han sido una herramienta muy útil en el estudio del desarrollo neural 18,19 y las enfermedades mecanismo de 20,21. hNPCs también se han trasplantado en muchos modelos animales diferentes de enfermedad del sistema nervioso central con diferentes niveles de integración, la supervivencia y efectos funcionales 22-24. Tradicionalmente, roedor o NPC derivadas de fetos humanos están expuestos a factores de crecimiento - factor de frecuencia de crecimiento epidérmico (EGF) y / o factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2) 25-28 - y tanto adherente 29 y tresSistemas de esferoide-dimensionales se pasan típicamente usando disociación enzimática en una suspensión de una sola célula 30-34. El método estándar para expandir las células para la investigación o el uso clínico es como una monocapa adherente debido a la fácil manipulación. Sin embargo, hemos demostrado que los pases en monocapa y de neuroesferas con hNPCs enzimática o soluciones químicas resultaron en la senescencia temprana 35. Además, la disociación enzimática puede dar lugar a mayores niveles de diferenciación y anomalías del cariotipo basados ​​en datos demostrados con células madre embrionarias 36-38. Aunque el método estándar de hNPCs pases ha producido buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) productos de calidad que han pasado a la fase 1 de pruebas clínicas (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), el método permite únicamente un par de rondas de amplificación de células, lo que limita la banca potencial. Está claro que los grandes experimentos de investigación y ensayos clínicos futuros podrían beneficiarse de la capacidad depropagar células en grandes cantidades y con el retraso en la senescencia para permitir el crecimiento a gran escala y de bancos de células. Para satisfacer esta necesidad, hemos desarrollado una forma novedosa y automatizado de neuroesferas intactos mecánicamente pases por &quot;picar&quot; en pequeños grupos para mantener el contacto de célula a célula. Este método aumenta en gran medida su vida útil 39 y suspensión de cultivo permite un uso más eficiente del espacio de la incubadora en comparación con cultivos en monocapa, como se ve con un método de cultivo del biorreactor 3D alternativa 40. El protocolo de cortar proporcionado permite la producción de bancos a gran escala a partir de una muestra fetal mayor que el paso 10, una hazaña poco probable utilizando métodos estándar pases. Si bien este método para hNPCs pases es poco convencional, que está creciendo en popularidad y fue recientemente publicado con otros tipos de células, como las células madre neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas de embriones humanos y, lo que permite la expansión a gran escala para diversas aplicaciones incluyendo en vitro modelado enfermedad 41-46. Es importante destacar que un cGMP grado banco de células hNPC ya se ha producido con el método de cortar, lo que demuestra que la técnica se puede aplicar a futuras aplicaciones clínicas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1230">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beaker, 50 mL</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB-100-50</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bio-Safety Cabinet, class II</td>
			<td style="width:159px;">Baker</td>
			<td style="width:128px;">SG-603A</td>
			<td style="width:464px;">4 ft. or 6 ft. model.&#160; 6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Blades, Double-edge Prep</td>
			<td style="width:159px;">Personna</td>
			<td style="width:128px;">74-0002</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers.&#160; CAUTION: Sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Cell Freezing Media</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">C6295-50ML</td>
			<td style="width:464px;">DMSO, serum-free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:128px;">5810 R</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Conical Tubes, 15 mL</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">S50712</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Conical Tubes, 50 mL</td>
			<td style="width:159px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:128px;">352074</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Controlled Rate Freezer</td>
			<td style="width:159px;">Planer&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Kryo 750</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Cryovials, 2 mL</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:128px;">430488</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Culture Flask, Vented, T12.5</td>
			<td style="width:159px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:128px;">353107</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Culture Flask, Vented, T25</td>
			<td style="width:159px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:128px;">353081</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Culture Flask, Vented, T175</td>
			<td style="width:159px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:128px;">353045</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Culture Flask, Vented, T75&#160;</td>
			<td style="width:159px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:128px;">353110</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Filter, 0.22 &#181;m, attached cup, 1 L</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:128px;">SCGPU11RE</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Filter, 0.22 &#181;m, attached cup, 150 mL</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:128px;">SCGVU01RE</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Filter, 0.22 &#181;m, attached cup, 500 mL</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:128px;">SCGPU05RE</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Filter, 0.22 &#181;m, attached cup, 50 mL</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:128px;">SCGP00525</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Filter Paper, 8.5 cm circles</td>
			<td style="width:159px;">Whatman/GE</td>
			<td style="width:128px;">1001-085</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cm</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:128px;">11001-18</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol</td>
			<td style="width:159px;">Nalgene</td>
			<td style="width:128px;">5100-0001</td>
			<td style="width:464px;">&#34;Mr. Frosty&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Incubator, 37&#176;C/5% CO2</td>
			<td style="width:159px;">Forma</td>
			<td style="width:128px;">370 series</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Hemacytometer, Phase</td>
			<td style="width:159px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:128px;">1475</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td style="width:159px;">Lafayette Instruments</td>
			<td style="width:128px;">TC752-PD</td>
			<td style="width:464px;">&#160;Petri dish modification required.&#160;&#160; CAUTION:&#160; Moving, sharp blade.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Micropipettor, 1 - 10 &#956;L</td>
			<td style="width:159px;">Gilson</td>
			<td style="width:128px;">F144562</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Micropipettor, 100 - 1000 &#956;L (starter kit)</td>
			<td style="width:159px;">Gilson</td>
			<td style="width:128px;">F167700</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Micropipettor, 2 - 20 &#956;L (starter kit)</td>
			<td style="width:159px;">Gilson</td>
			<td style="width:128px;">F167700</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Micropipettor, 20 - 200 &#956;L (starter kit)</td>
			<td style="width:159px;">Gilson</td>
			<td style="width:128px;">F167700</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nutdriver, Autoclavable, 5/16&#34;</td>
			<td style="width:159px;">Steritool</td>
			<td style="width:128px;">10302</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur Pipets, cotton-plugged</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">13-678-8B</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Petri Dish, Glass, Autoclavable</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:128px;">3160-100</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Pipet Aid</td>
			<td style="width:159px;">Drummond</td>
			<td style="width:128px;">4-000-101</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Shim disc</td>
			<td style="width:159px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:128px;">VARIABLE</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Sterile barrier pipet tips, 10 &#956;L</td>
			<td style="width:159px;">AvantGuard</td>
			<td style="width:128px;">AV10R-H</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Sterile barrier pipet tips, 1000 &#956;L</td>
			<td style="width:159px;">AvantGuard</td>
			<td style="width:128px;">AV1000</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Sterile barrier pipet tips, 20 &#956;L</td>
			<td style="width:159px;">AvantGuard</td>
			<td style="width:128px;">AV20-H</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Sterile barrier pipet tips, 200 &#956;L</td>
			<td style="width:159px;">AvantGuard</td>
			<td style="width:128px;">AV200-H</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">13-676-10J</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">13-675-3C</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">13-676-10K</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">13-676-10H</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Sterilization Pouches, 19 x 33 cm</td>
			<td style="width:159px;">Crosstex</td>
			<td style="width:128px;">SCL</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:479px;">Strainer, 40 &#181;m</td>
			<td style="width:159px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:128px;">352340</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Tissue Culture Dishes, 60 mm</td>
			<td style="width:159px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:128px;">351007</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Tube Racks, Interlocking Four-Way</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">03-448-17</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Water Bath</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td>S52602Q</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">S3194-500ML</td>
			<td style="width:464px;">Important to use the Stemline brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:128px;">GF316</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF)</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:128px;">LIF1010</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">Trypan Blue (0.4%)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">T8154-100ML</td>
			<td style="width:464px;">multiple manufacturers/suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:479px;">TrypLE Select (1X)</td>
			<td style="width:159px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">12563-011</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cgmp-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue

Una técnica de expansión de células para acumular grandes cantidades de células a partir de una sola muestra para experimentos de investigación y ensayos clínicos se beneficiaría en gran medida a la comunidad de células madre. Muchos métodos actuales de expansión son laboriosos y costosos, y los que implican la disociación completa pueden causar varios tipos madre y células progenitoras a someterse a la diferenciación o la senescencia temprana. Para superar estos problemas, hemos desarrollado un método de pases mecánica automática que se refiere como &quot;cortar&quot; que es simple y de bajo costo. Esta técnica evita la disociación química o enzimática en células individuales y en su lugar permite la expansión a gran escala de suspensión, cultivos de esferoides que mantienen el contacto célula / célula constante. El método de cortar se ha usado principalmente para células derivadas de cerebro fetal neurales progenitoras o neuroesferas, y recientemente ha sido publicado para su uso con células madre neurales derivadas de células madre pluripotentes embrionarias e inducidos. El procedimiento involvES siembra neuroesferas en un cultivo de tejidos plato de Petri y posteriormente pasa a una, la cuchilla afilada estéril a través de las células de la automatización de manera efectiva el tedioso proceso de manualmente disociar mecánicamente cada esfera. La suspensión de células en cultivo proporciona una relación superficie-área-volumen favorable; como más de 500.000 células pueden ser cultivadas en una sola neuroesfera de menos de 0,5 mm de diámetro. En un matraz T175, más de 50 millones de células pueden crecer en cultivos en suspensión en comparación con sólo 15 millones en cultivos adherentes. Es importante señalar que el procedimiento de cortar ha sido utilizada bajo buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP), que permite la producción de cantidades masivas de productos celulares de grado clínico.

<img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig5highres.jpg" width="500" /> El número de células Figura 5. Los datos representativos. A) proyectados de hNPCs congelados en p19, luego descongelados y se expandieron como una monocapa adherente mediante disociación enzimática en comparación con neuroesferas con pases a través del método de cortar. Día 0 representa cuando las células se descongelaron a p20. B)</s...

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A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Este protocolo describe un nuevo método de cortar mecánico que permite la expansión de la madre y de células progenitoras neurales agregados esféricos sin disociación a una única suspensión de células. Mantener el contacto célula / célula permite un crecimiento rápido y estable durante más de 40 pasajes.

Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

a-cgmp-applicable-expansion-method-for-aggregates-human-neural-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K vistas.  Cedars-Sinai Medical Center.  Este protocolo describe un nuevo método de cortar mecánico que permite la expansión de la madre y de células progenitoras neurales agregados esféricos sin disociación a una única suspensión de células. Mantener el contacto célula / célula permite un crecimiento rápido y estable durante más de 40 pasajes. 

Video: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue