Presentamos por primera vez, un nuevo enfoque para la generación reproducible y escalable, de células IPS derivadas en organoides cerebelosos, y una condición química definida, utilizando biorreactores de un solo uso. Para obtener células para la siembra del biorres reactor, agregue un mililitro de medio de desprendimiento celular, a cada pozo de una placa de seis pozos de iPSC humano. Incubar la placa a 37 grados Celsius durante siete minutos, hasta que el suave temblor separe fácilmente las células del pozo.
Usando una micropipeta P 1000, pipetee el medio de desprendimiento de celdas, hacia arriba y hacia abajo, hasta que las células se disociquen en células individuales. A continuación añadir dos mililitros, de medio de cultivo celular completo a cada pozo, esto inactivará la digestión enzimática. A continuación, utilice la pipeta para transferir suavemente las células a un tubo cónico estéril.
Centrifugar el tubo a 210 veces la gravedad durante tres minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cultivo. Cuente las células usando un hemocicómetro y tripa de colorante azul.
Vea el recipiente del biorreactor con el iPSC, a una densidad de 250.000 células por mililitro. Inserte el recipiente del biorreactor, en la Unidad Base Universal, en una incubadora a 37 grados Celsius, 95% de humedad y 5% dióxido de carbono. Para promover la agregación iPSC, establezca la tasa de agitación de la unidad de control base en 27 RPM.
En el primer día, siendo el día cero de la siembra del biorreactor, coloque el biorreactor y la unidad base en una campana de flujo estéril, luego use una pipeta serológica, para recoger una muestra de un mililitro, de la suspensión celular. Placa la suspensión celular en un accesorio ultra bajo, placa de 24 pozos. Utilice un microscopio para confirmar que se han formado agregados derivados de iPSC.
Si es así, capturar imágenes de los agregados a 40 X o 100 X.Continúe cultivando los iPSC y el biorreactor, hasta que el diámetro medio de los agregados, es de 100 micrómetros, luego reemplace el 80% del medio, con MT01 fresco sin inhibidor de roca. Cuando los agregados, alcancen 200 a 250 micrometros de diámetro, dejen que todos los organoides se asienten, en la parte inferior del biorreactor, luego reemplacen todo el medio gastado, con el medio de diferenciación de gfCDM. Coloque la unidad base y el biorreactor en la incubadora y disminuya la agitación a 25 RPM.
Después de retirar el sobrenadante de los organoides almacenados, agregue un mililitro de 15% de sacarosa al pellet, y mezcle bien girando suavemente. Después de incubar los organoides durante la noche, a cuatro grados Centígrados, retire la solución de sacarosa, luego agregue un mililitro de 15%sacarosa, 7.5% gelatina, y mezcle rápidamente arremolinando suavemente. Mientras que los organoides están incubando a 37 grados Celsius llenar un recipiente de plástico a mitad de camino con la solución de 15%sacarosa 7.5%gelatina, y permitir que se solidifique.
Después de que los organoides hayan estado incubando durante una hora, utilice una pipeta Pasteur, para colocar una gota de la mezcla de gelatina de sacarosa organoides, encima de la sacarosa solidificada y gelatina. Después de esperar 15 minutos para que la gota se solidifique, llene el resto del recipiente de plástico, con más 15%sacarosa, 7.5% gelatina, permita que se solidifique completamente a temperatura ambiente y luego incubarlo durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Cortar la gelatina en un cubo, con los organoides en el centro, fijar el cubo a un pedazo de cartón, con una gota de compuesto OCT, luego colocado 250 mililitros de Isopentane, en una taza de 500 mililitros, llenar un recipiente apropiado, con nitrógeno líquido.
Usando fórceps y guantes gruesos, coloque cuidadosamente la copa de Isopentane, en la superficie del nitrógeno líquido. El isopentano y los nitrógenos líquidos, son reactivos peligrosos. El uso de estos dos reactivos, requieren equipo de protección personal, incluyendo guantes gruesos y una ventilación adecuada.
Cuando el Isopentane, se haya enfriado a 80 grados Celsius negativos, coloque el cubo de gelatina en el Isopentane hasta que se congele. Un cubo bien congelado, produce un sonido metálico cuando se toca ligeramente con fórceps, lo que indica que está listo para ser almacenado. Lave los portaobjetos del microscopio que contienen las secciones organoides, con 50 mililitros 1X PBS durante cinco minutos, luego transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin, que contiene 1X PBS fresco.
Transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin, que contenga 50 mililitros de glicina recién preparada e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin, que contenga 50 mililitros de 0,1% Tritón, y permeabilizado durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos dos veces con 1X PBS, durante cinco minutos cada vez. Preparar el plato de inmunosuchado, con papel de tres milímetros, empapado en 1X PBS.
Seque los portaobjetos con un pañuelo alrededor de las rodajas y colóquelos en el papel de tres milímetros. Con una pipeta Pasteur, cubra cada diapositiva con 0,5 mililitros de solución de bloqueo. Después de incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, retire el exceso de solución de bloqueo y conduzca los portaobjetos con un pañuelo, alrededor de las rodajas.
Coloque 50 microlitros de anticuerpo primario diluido, en cada diapositiva y cúbralos con resbalones de cubierta. Encaje los portaobjetos, en el plato de inmunostaining previamente preparado, e incubarlos a cuatro grados centígrados. Después de la incubación durante la noche, transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin, con 50 mililitros de TBST, dejando que la cubierta se caiga, luego lave los portaobjetos tres veces con TBST, durante cinco minutos cada vez.
Coloque 50 microlitros, de anticuerpo secundario diluido en cada diapositiva, y cubra con los resbalones de la cubierta. Coloque los portaobjetos, en el plato de inmunosuchado previamente preparado, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin de nuevo y lávelos tres veces con 50 mililitros de TBST, durante cinco minutos cada vez.
Usando una pipeta Pasteur, a 0,5 mililitros de solución de ondas, sobre toda la superficie de cada tobogán e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de 24 horas en el biorreactor, los agregados en forma de esferoides de iPSC formaron eficientemente. La morfología estuvo bien mantenida hasta el día cinco, con un aumento gradual de tamaño.
Demostrando un alto grado de homogeneidad. Un análisis cuantitativo por microscopía, también reveló una distribución normal, de tamaños agregados por el primer día, y ambas líneas celulares alcanzaron el tamaño agregado óptimo en el segundo día. Después de alcanzar el diámetro agregado deseado, se indujo el compromiso neural, y luego se promovió la generación de diferentes progenitores cerebelosos.
Durante la diferenciación de organoides, mostró una epitelización más pronunciada similar a las estructuras similares a los tubos neurales con espacio luminal. Además, la distribución del diámetro organoide, fue homogénea durante el compromiso cerebeloso inicial hasta el día 14. El análisis de inmunofluorescencia apoya que ya se haya logrado un compromiso neuronal eficiente, de los organoides derivados del iPSC, para el séptimo día de diferenciación.
La inmunostaining también demostró un compromiso cerebeloso eficiente y una maduración eficiente de los organoides cerebelosos. Además, después de 80 días en el biorreactor, la tinción muerta viva de organoides mostró una alta viabilidad celular, y ninguna evidencia de áreas necróticas. Esta técnica representa una herramienta importante, para el estudio de las vías patológicas, implicada en la degeneración del cerebelo observada en y para evaluar el efecto terapéutico de nuevos fármacos.
