Los autores agradecen al Dr. Yangyang Yan del laboratorio del Dr. Fred Sigworth de la Universidad de Yale por el generoso donativo de células HEK293 que expresan establemente la proteína rata Slack-B. Además, los autores agradecen al Dr. Sigworth para crioelectrónica modelo de homología microscopía de Slack se muestra en el vídeo de introducción. Esta investigación fue apoyada por el NIH subvenciones DH067517 y NS073943 a LKK

1. Cultivos Celulares (Adaptado de Fleming y Kaczmarek 18) <ol><li> Células de cultivo en medios apropiados para superior a 2 pero menos de 10 pasajes antes de su uso en este ensayo. Células no transfectadas HEK-293 y las células HEK-293 que expresan establemente la proteína de rata de parafina y-B se cultivan en medio de Eagle modificado de Dulbecco uno medio y uno medio de Leibovitz L-15 suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y antibióticos. 500 g / ml de geneticina (G418) se añade a las células HEK-293 que expresan establemente Slack-B para seleccionar por la expresión del canal de parafina. Células Passage en 70-90% de confluencia por la disociación de los platos con una solución de tripsina-EDTA 0,25%. </li></ol> 2. Matriz extracelular (ECM) de recubrimiento de TiO 2 384 y placa de biosensor óptico con fibronectina y ovoalbúmina <ol><li> Preparación de la mezcla de ECM fibronectina y solución de bloqueo ovoalbúmina <ol><li> Prepare una solución de trabajo de fibronecten en tampón fosfato salino (PBS) con una concentración final de 5 g / ml de fibronectina en 20,0 ml de PBS. A partir de una concentración stock de 1,0 mg / ml, añadir 100 ml a 20,0 ml de PBS para una dilución de 200 veces. La solución de trabajo de la fibronectina se puede dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C después de la preparación. </li><li> Preparar una solución madre 5% de ovoalbúmina inactivado por calor en agua estéril. Diluir la ovoalbúmina en el tejido agua estéril de grado de cultivo de una solución al 5% y al calor inactivar durante 30 min a 60 ° C. Enfriar la solución a temperatura ambiente y el filtro estéril la solución. Alícuota de la solución de ovoalbúmina al 5% y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Preparar una solución de trabajo 2% de ovoalbúmina por dilución de la solución madre 5% en PBS. Por ejemplo, añadir 12,0 ml de solución de ovoalbúmina de almacén 5% a 18,0 ml de PBS para un volumen final de 30,0 ml. </li></ol></li><li> 384-y recubrimiento de placas biosensor óptico <ol><li> Hidratar la placa de TiO2 con 20,0 l / pocilloagua estéril de grado de cultivo de tejido durante 15 min. Los siguientes pasos deben realizarse con una pipeta de 16 canales. </li><li> Lavar 1x placa con 50,0 l de PBS por pocillo. </li><li> Añadir 20,0 l de la solución de trabajo de la fibronectina a cada pocillo y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente para crear el ECM. </li><li> Lavar 1x placa con 50,0 l de PBS por pocillo. </li><li> Añadir 40,0 l de la solución de trabajo de la ovoalbúmina a cada pocillo e incubar durante la noche a 4 º C para bloquear la placa. </li><li> Lave la placa 3x con 50,0 l de PBS por pocillo. Placas de ECM recubiertos se pueden almacenar a 4 ° C durante hasta 48 horas. </li></ol></li></ol> 3. La siembra de las células en el 384 pocillos Placa biosensor óptico <ol><li> Retire el medio de crecimiento de las células y añadir tripsina para desprender las células de la placa. Recoger las células y se centrifuga a 1000 × g durante 1 min. Quite el papel de la tripsina y las células se resuspenden en medio de cultivo. </li><li> El uso de un hemocitómetro o un automatizadocontador de células, determinar la concentración de las células. </li><li> Para reducir al mínimo los efectos de la evaporación durante la incubación, se utilizará 50,0 l de medio de crecimiento por pocillo. Las células deben ser diluidos para lograr el número deseado de células por pocillo en un volumen de 50,0 l de medio de crecimiento. Para estos experimentos, 1000 células / pocillo se sembraron en el biosensor. </li><li> Permitir que las células sembradas a incubar durante la noche en medio de crecimiento a 37 ° C bajo aire / 5% de CO 2. </li></ol> 4. Preparación de los biosensores y compuestas Placas para el ensayo de biosensor óptico GTR <ol><li> Retirar la placa de la incubadora y retirar medios de cultivo de las células. Lavar las células 1x con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Añadir 25,0 l de HBSS a cada pocillo. </li><li> Coloque la placa de biosensor en el escáner BIND y permiten que las células alcancen la temperatura ambiente durante 1-2 horas. </li><li> Preparar un plato compuesto por separado de la que los ligandos de interés serán added a la placa de biosensor durante el ensayo. Para estos ensayos, se añadió 25,0 l de solución que contiene el compuesto a cada pocillo en la placa de biosensor para un volumen total de 50,0 l. Como tales, los compuestos en solución se prepararon en 2X la concentración final deseada. </li></ol> 5. Lleve a cabo el ensayo de biosensor óptico GTR <ol><li> Realice una medición de línea de base con el sistema de escáner para pozos A1-P12 (la mitad de la placa de 384 pocillos SBS) con una resolución máxima de 3.75 m / pixel de la central de 1,5 mm de cada pocillo utilizando el software BIND Scan. Esta exploración de línea de base tendrá una duración aproximada de 30 min. </li><li> Añadir 25,0 l de las soluciones de compuesto a cada pocillo de los pocillos A1-P12. </li><li> Realice una medición de línea de base de pozos A13-P24. </li><li> Añadir 25,0 l de las soluciones de compuesto a cada pocillo para pozos A13-P24. </li><li> Realice una medición adición del compuesto después de los pocillos A1-P12, y repita para pozos A13-P24. </li></ol> 6. Lanálisis de Ensayo de datos con BIND Ver <ol><li> Abra los datos del ensayo de BIND para la medición de línea de base de Windows, y haga clic en el botón &quot;Editor de cuadrícula&quot; para permitir la selección de células. El software calcula la métrica de interés definidos por el usuario. </li><li> Abra el &quot;Plug-ins&quot;, que incluyen el &quot;Buscador de la célula&quot; y la función &quot;Baseliner&quot;. Establezca los parámetros de &quot;Buscador de la célula&quot;, por lo que las células se pueden distinguir de los antecedentes del biosensor. </li><li> Exportar el archivo de mapa de celdas que contiene los datos de &quot;Buscador de la célula&quot; para la medición de la línea de base. </li><li> Repita los pasos 6.1 hasta 6.2 para los datos de la adición del compuesto de correos. </li><li> Abra el &quot;Baseliner&quot; plug-in e importar el mapa de celdas de la medición inicial. El software calculará el cambio en la VOP entre los antecedentes y compuestas mensaje. </li><li> Seleccione &quot;Δ celular Mean&quot; para la salida de la desviación de la media en VOP para las células. Los datos pueden ser exportados a Microsoft ExcEL para su posterior análisis. </li></ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+controls+gating+of+the+sodium-activated+potassium+channel.">Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel.</a> 13, 819-821 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neuronal+excitability+by+interaction+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+slack+potassium+channels.">Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels.</a> J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).</li><li>Barcia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+gain-of-function+KCNT1+channel+mutations+cause+malignant+migrating+partial+seizures+of+infancy.">De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy.</a> Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).</li><li>Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+biosensors+to+detect+modulation+of+Slack+potassium+channels+by+G+protein-coupled+receptors.">Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors.</a> J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).</li><li>Nelson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins.">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li><li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data.">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li></ol>

Steven M. Shamah es un empleado de X-CUERPO Biosciences.

El primer Z (Z &#39;) factor es un método estadístico común para cuantificar la calidad de un ensayo de cribado de alto rendimiento 20, y porque la proyección de los agonistas de GPCR en este ensayo se produjo en un ensayo de 384 pocillos compatibles SBS, proporciona una excelente medida de la solidez y validez de este ensayo 21. Valor AZ &#39;de 1 indica un ensayo teóricamente ideal, con un número infinito de puntos de datos con desviaciones estándar inexistentes. Valor AZ &#39;de entre 0,5...

El examen de las células vivas en su contexto fisiológicamente relevante es crucial para la comprensión de las funciones biológicas de las dianas celulares. Sin embargo, los ensayos que examinan la interacción entre canales y proteínas citoplasmáticas reguladoras, tales como ensayos coimmunoprecipitation, generalmente proporcionan poca información sobre la evolución temporal de las interacciones en las células vivas. La mayoría de los ensayos basados ​​en células actuales medir un evento celular específico, tal como la translocación de una proteína marcado con fluorescencia de interés. Estos ensayos requieren modificaciones de las proteínas de interés, que potencialmente pueden alterar el comportamiento de la proteína y disminuir la relevancia fisiológica de la meta. Ensayos basados ​​en células no invasiva, que no requieren la manipulación del sistema, proporcionan una medición continua de la actividad celular y permiten estudios de células en su estado más fisiológicamente relevante 4. Biosensores ópticos están diseñados para producirun cambio medible en una característica de la luz que está acoplada a la superficie del sensor. Biosensores ópticos que utilizan ondas evanescentes, que incluyen la resonancia de plasmón de superficie (SPR) y la resonancia de longitud de onda de rejilla (GTR) técnicas, se han utilizado principalmente de detectar las afinidades y la cinética de las moléculas de unión a sus receptores biológicos inmovilizados sobre la superficie del sensor. Más recientemente, los biosensores GTR disponibles comercialmente se han desarrollado para permitir la detección de la variación relativa de la masa dentro de la porción inferior de las células adherentes a la superficie del sensor a alta resolución espacial (hasta 3,75 m / píxel) 5. Estos biosensores pueden detectar cambios en la masa cerca de la membrana plasmática de las células vivas que resultan de la estimulación, tales como la adhesión celular y la difusión, la toxicidad, la proliferación y vías de señalización provocados por una variedad de receptores de la superficie celular, incluyendo los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) 6 . Biosensores GTR detectan la relación chanGE en el índice de refracción como una función de la variación relativa en masa dentro de 150 nm del biosensor 7. Cuando las células se colocan en placas al biosensor, este cambio en el índice de refracción refleja el cambio en la masa cerca de la membrana plasmática de la célula resultante de un cambio en la adhesión celular para el biosensor. Este protocolo se discutirá la detección de interacciones proteína-canal utilizando biosensores GTR. Los sistemas de adquisición de datos GTR constan de varios componentes. Debido a que el X-CUERPO Biociencias BIND escáner fue utilizado para estos experimentos, se hará referencia a los componentes de este sistema en particular, que consiste en un lector de placas, biosensores asociados, software de adquisición de BIND Scan y software BIND Ver análisis 8. Los biosensores de cristal fotónico, nos referiremos en adelante como biosensores ópticos, están compuestos por un arreglo periódico de un dieléctrico y material en 2 o 3 dimensiones que impide la propagación de la luz en específicolongitudes de onda y las direcciones. Estructuras de cristal fotónico se basan en un fenómeno llamado anomalía de Wood. Descubierta por primera vez por Wood en 1902, estas anomalías son los efectos observados en el espectro de luz reflejada por las rejillas de difracción ópticas donde se producen variaciones rápidas en la intensidad de determinadas órdenes de difracción en ciertas bandas de frecuencia estrechas. En 1962, Hessel y Oliner presentan una nueva teoría de las anomalías de la madera en la que finita periodo de red genera una longitud de onda de resonancia de pie 9. En los biosensores ópticos descritos aquí, anomalías de madera se utilizan para producir un biosensor GTR que cuando se estimula con luz blanca refleja sólo banda muy estrecha de longitudes de onda (típicamente entre 850 a 855 nm). Biosensores individuales se componen de un material de bajo índice de refracción de plástico con una estructura superficial periódica que está recubierto con una fina capa de dióxido de titanio de material dieléctrico de alta refracción (TiO2). Cuando los Biosenso se ilumina con una fuente de luz de longitud de onda, la rejilla óptica de los cristales fotónicos refleja un rango estrecho de longitudes de onda de luz que se mide mediante un espectrofotómetro en el escáner de BIND. La intensidad máxima de las longitudes de onda reflejadas (Longitud de onda máxima del valor, o la VOP) se calcula a partir de la señal. El VOP de la luz cambia a un cambio en el índice de refracción como resultado de un aumento o disminución de la masa dentro de la proximidad (~ 150 nm) de la superficie del biosensor. Biosensores ópticos se incorporan en un estándar de la Sociedad de Ciencias Biomoleculares (SBS) de microplacas de 384 pocillos para los ensayos utilizados en estos experimentos. Biosensores RWV se utilizan para detectar cambios tras la adición de señales exógenas en las células vivas 10. Las células se cultivan directamente sobre la superficie de un biosensor GTR y el cambio en el índice local de refracción se monitoriza tras el tratamiento con estímulos específicos. La dirección del cambio en la masa en el biosensor puede serdeterminado, debido a un aumento en el índice local de resultados de la refracción de un aumento de masa cerca del biosensor y se mide como un aumento de la VOP. Por el contrario una disminución de la masa produce una disminución de la VOP. El cambio en la VOP detectado puede ser el resultado de numerosos eventos celulares, incluyendo cambios en la adhesión celular, proteínas de reclutamiento / liberación, la endocitosis y el reciclaje, la exocitosis, la apoptosis y reordenamiento del citoesqueleto. Por ejemplo, el ensayo puede detectar cambios en las interacciones proteína-canal entre los canales de potasio y otros componentes citoplasmáticos o citoesqueleto. El evento, sin embargo, debe ocurrir dentro de la zona de detección nm ~ 150 cerca del biosensor, y en el caso de una celda adjunta, cerca de la membrana plasmática. Adquisición de las respuestas celulares se realizó con el software de BIND Scan y se genera una representación de la imagen de cada uno de los 384 pocillos en la placa de SBS. Este sistema tiene una resolución de hasta 3,75 m / píxel, que permite la detección de eventos en células individuales, yse puede utilizar tanto con líneas celulares (tales como células HEK293 o CHO) o con más fisiológicamente relevantes células primarias. El análisis de imágenes con el software de BIND Ver permite la detección de respuestas celulares, tanto en individual y poblaciones de células. Como los biosensores se incorporan en estándar SBS microplacas de 384 pocillos, el sistema es fácilmente adaptable a cribado de alto rendimiento (HTS). Biosensores ópticos de rejilla de resonancia de longitud de onda se han usado previamente para detectar cambios en la masa cerca de la membrana plasmática de las células después de la activación de GPCR 11. Nuestro laboratorio ha clonado dos canales de potasio de sodio activados (K Na), Slack-B y Slick 12. La actividad de ambos canales B-Slack y Slick ha demostrado ser muy fuertemente influenciada por la activación directa de la proteína quinasa C (PKC) 13. La activación de los receptores acoplados a proteínas Gα q, tales como el receptor muscarínico M1 y el mGluR1 metabotrópico de glutamato receptor, regula de forma potente la actividad del canal a través de la activación de PKC. Estos canales de K Na contribuyen a la adaptación neuronal durante la estimulación sostenida y regular la exactitud de la sincronización de los potenciales de acción 14. Canales de tensión se sabe que interactúan con una variedad de moléculas de señalización citoplasmáticas, incluyendo FMRP, la proteína de retraso mental X Frágil 15,16. Las mutaciones en consecuencia Slack en múltiples Migración Convulsiones parciales de la infancia (MMPSI), una forma de aparición temprana de la epilepsia que se traduce en un retraso grave del desarrollo 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Geneticin G-418 Sulfate</td>
			<td style="width:172px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB05057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">HBSS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DPBS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Carbamoylcholine chloride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Finnpipette (5-50 &#181;l)</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4662090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIND Scanner System</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384-well TiO2 coated plates</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">TiO-96-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of label-free optical biosensors to detect modulation of potassium channels by g-protein coupled receptors

Los canales iónicos controlan las propiedades eléctricas de las neuronas y otros tipos de células excitables al permitir selectivamente los iones fluyan a través de la membrana de plasma 1. Para regular la excitabilidad neuronal, las propiedades biofísicas de los canales de iones son modificados por las proteínas y moléculas de señalización, que a menudo se unen a los propios canales para formar un complejo de 2,3 canal heteromérico. Ensayos tradicionales que analizan la interacción entre canales y proteínas reguladoras requieren etiquetas exógenos que potencialmente pueden alterar el comportamiento de la proteína y disminuir la relevancia fisiológica de la meta, mientras que proporciona poca información sobre la evolución temporal de las interacciones en las células vivas. Biosensores ópticos, tales como el sistema X-CUERPO Biociencias BIND escáner, utilizan una nueva tecnología sin etiqueta, rejilla de longitud de onda de resonancia (GTR) biosensores ópticos para detectar cambios en el resonante luz cerca del biosensor reflejada. Este ensayo permite la detección de la relacióncambio en la masa dentro de la porción inferior de las células vivas adheridas a la superficie del biosensor como resultado de cambios inducidos ligando en la adhesión celular y la difusión, la toxicidad, la proliferación, y los cambios en las interacciones proteína-proteína cerca de la membrana plasmática. Biosensores ópticos GTR se han utilizado para detectar cambios en la masa cerca de la membrana de plasma de las células después de la activación de los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs), los receptores de tirosina quinasas, y otros receptores de la superficie celular. Ligando los cambios inducidos en iones de interacciones proteína-canal también se pueden estudiar usando este ensayo. En este artículo, describiremos el procedimiento experimental utilizado para detectar la modulación de Slack-B de sodio y potasio activados (K Na) canales de GPCR.

Las células HEK-293 transfectadas Slack-B transfectadas establemente células HEK-293 y el control se sembraron a 1000 células / pocillo en 384 pocillos, recubiertos ECM GTR placas biosensores. Las imágenes de la central de 1,5 mm 2 del biosensor se registraron con una resolución de 3,75 m / píxel (Figura 1). Mapas de gradiente de densidad de masa se generaron antes y 30 minutos después de la adición del compuesto con el software BIND Scan. El BIND Ver software se utilizó para determi...

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Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Técnicas de biosensor óptico pueden detectar cambios en la masa cerca de la membrana plasmática en las células vivas y permitir una para seguir las respuestas celulares tanto en células individuales y poblaciones de células. Este protocolo describe la detección de la modulación de los canales de potasio por G-receptores acoplados a proteína en células intactas utilizando este enfoque.

El uso de biosensores ópticos sin etiqueta para Detectar la modulación de los canales de potasio por la proteína G-receptores acoplados

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K vistas.  Yale School of Medicine.  Técnicas de biosensor óptico pueden detectar cambios en la masa cerca de la membrana plasmática en las células vivas y permitir una para seguir las respuestas celulares tanto en células individuales y poblaciones de células. Este protocolo describe la detección de la modulación de los canales de potasio por G-receptores acoplados a proteína en células intactas utilizando este enfoque. 

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Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Colocación de sondas biológicas de biosensores ópticos de silicio mediante agentes de acoplamiento de silano

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Investigación

Bioingeniería

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Detección óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bacterias por mesoporosos Silicon Biosensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN por Pinzas Ópticas

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Una técnica-Label libre para el Imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

El uso de un análisis de biosensores conductimétricos β-lactamase-base para detectar las interacciones biomoleculares

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: un estudio sin etiquetas de las interacciones proteína-fosfoinositida

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations and development of microstructurally motivated mathematical models for understanding the mechanical properties of human resistance arteries in health and disease have the potential to aid understanding how disease and medical treatments affect the human microcirculation. To develop these mathematical models, it is essential to decipher the relationship between the mechanical and microarchitectural properties of the microvascular wall. In this work, we describe an ex vivo method for passive mechanical testing and simultaneous label-free three-dimensional imaging of the microarchitecture of elastin and collagen in the arterial wall of isolated human resistance arteries. The imaging protocol can be applied to resistance arteries of any species of interest. Image analyses are described for quantifying i) pressure-induced changes in internal elastic lamina branching angles and adventitial collagen straightness using Fiji and ii) collagen and elastin volume densities determined using Ilastik software. Preferably all mechanical and imaging measurements are performed on live, perfused arteries, however, an alternative approach using standard video-microscopy pressure myography in combination with post-fixation imaging of re-pressurized vessels is discussed. This alternative method provides users with different options for analysis approaches. The inclusion of the mechanical and imaging data in mathematical models of the arterial wall mechanics is discussed, and future development and additions to the protocol are proposed.

We describe simultaneous mechanical testing and 3D-imaging of the arterial wall of isolated, live human resistance arteries, and Fiji and Ilastik image analyses for the quantification of elastin and collagen spatial organization and volume densities. We discuss the use of these data in mathematical models of arterial wall mechanics.

Evaluación de colágeno y elastina Microarchitectures dependiente de la presión en las arterias de resistencia viva, humana por microscopía de fluorescencia etiqueta-libre

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...