El ensayo de doble adición de fluorescencia de calcio de alto rendimiento permite la identificación de nuevos ligandos de moléculas pequeñas de un receptor acoplado a proteína G que envía señales a través de la cascada de calcio intracelular. La principal ventaja del ensayo de doble adición es la detección de HTS agonista y antagonista en un solo ensayo con las mismas células, siempre que la señal de fluorescencia dure dos minutos. Este método se puede aplicar a cualquier GPCR que señale a través de la cascada de calcio, que incluye la mayor parte de la familia de péptidos de neuronas artrópodos, un GPCR.
Para la reproducibilidad del ensayo, es importante optimizar la densidad celular, la velocidad de inyección y la concentración del agonista conocido para la segunda edición. Demostrando el procedimiento estará Bianca Henriques-Santos, investigadora postdoctoral asociada en mi laboratorio. Comience el ensayo de fluorescencia de calcio retirando el medio gastado del matraz T-75 que contiene 70 a 90% de tres células BMLK confluentes.
Lave las células con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco o DPBS. Después de retirar el DPBS, separe las células con dos mililitros de ácido etilendiaminotetraacético o EDTA al 0,25% de tripsina e incube durante tres a cinco minutos a 37 grados centígrados. Agregue ocho mililitros de medio selectivo y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros.
Antes de centrifugar la suspensión celular a 1000 x g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros de medio F-12K que contenga 1% de suero bovino fetal o FBS y 400 microgramos por mililitro de sulfato G418. Para determinar la densidad celular de la suspensión para una dilución adicional, mezcle 20 microlitros de suspensión celular en 20 microlitros de azul de tripano al 0,4% y luego cargue 20 microlitros de mezcla en una cámara de conteo celular para que la lea un contador de células para determinar la densidad celular.
Diluir la suspensión celular usando el mismo medio F-12K y completar el volumen final a 15 mililitros a una densidad de cuatro veces 10 a la quinta celda por mililitro. Para sembrar las células en la placa de lisina Poly-D o PDL codificada 384 pocillos. Agregue 25 microlitros de la suspensión de celda diluida en 384 pocillos de la placa utilizando un sistema de manejo de líquidos.
Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en la incubadora humidificada. Al día siguiente, invierta rápidamente la placa de pocillos de 384 confluentes al 90%. Para retirar el medio gastado y secar suavemente en toallas de papel estériles dos o tres veces para eliminar todo el líquido del plato.
Realice los siguientes pasos en la luz tenue suave dentro del gabinete de bioseguridad. A continuación, agregue 25 microlitros del tinte de carga en cada pocillo utilizando un sistema de manejo de líquidos dispensando 12.5 microlitros en cada pocillo con una velocidad de aspiración y dispensación de 3.8 microlitros por segundo. Repita este paso de pipeteo para alcanzar un volumen final de 25 microlitros en cada pozo.
Una vez hecho esto, cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz ambiental e incube a 37 grados centígrados en la incubadora humidificada de dióxido de carbono durante 30 minutos. Después de equilibrar la placa cubierta durante otros 30 minutos, las células están listas para el cribado de alto rendimiento o HTS. A continuación, centrifugar la placa de fármaco a 1200 x g en una centrífuga de placa durante un minuto.
Transfiera la solución peptídica agonista 10x de Rhimi-K-1 a un depósito autoamigable de 150 mililitros. En el lector de placas, haga clic en administrar protocolos. Luego, en el protocolo de intensidad fluorescente de punto final, seleccione Flow Forte pre-read, haga clic en iniciar medición para medir la señal de fondo para todo el ensayo HTS.
Inserte la placa celular en el lector de placas. En el panel de instrumentos, haga clic en un pozo aleatorio en la placa y luego haga clic en la nueva altura de enfoque. Haga clic en ajuste de enfoque.
Haga clic en ajuste de ganancia. Asígnelo como 5% a 10% del valor máximo de fluorescencia medible. Haga clic en Iniciar ajuste.
Haga clic en iniciar medición para leer toda la placa de la señal de fluorescencia de fondo en unidades de fluorescencia relativa o RFU. Mientras la placa está leyendo, haga clic en el estado actual para ver el valor de lectura en tiempo real. Para el ensayo de doble adición, pipetear 10 microlitros de la solución del fármaco hacia arriba y hacia abajo tres veces utilizando el sistema de manejo de líquidos y aspirar 1,5 microlitros de cada pocillo de la placa del fármaco a una velocidad de aspiración de 1,0 microlitros por segundo.
Dispensar 0,5 microlitros de los compuestos en el ensayo celular para alcanzar una concentración final de dos micromolares en 0,2% de dimetilsulfóxido o DMSO. Después de agregar los compuestos de cribado, coloque la placa de ensayo inmediatamente en el lector de placas. Haga clic en el programa de lectura preestablecido y lea la placa en las direcciones de lectura hacia adelante y hacia atrás.
Deseche un microlitro de solución de fármaco restante en las puntas sumergiendo las puntas en un depósito de residuos de 150 mililitros que contenga aproximadamente 50 mililitros de DPBS. Incubar los compuestos de cribado con las células durante un total de cinco minutos, incluido el tiempo dentro del lector de placas en el gabinete de bioseguridad con las luces apagadas. A continuación, agregue tres microlitros del péptido agonista Rhimi-K-1 del depósito en la placa de ensayo utilizando el sistema de manejo de líquidos utilizando 384 puntas de 12.5 microlitros.
Coloque la placa en el lector de placas inmediatamente. Haga clic en el programa de lectura preestablecido y lea la placa en las direcciones de lectura hacia adelante y hacia atrás. Una vez hecho esto, calcule manualmente el factor Z para el control de calidad de cada ensayo de placa.
Seleccione manualmente las moléculas de impacto de los mapas de calor en la plataforma de datos HTS en línea y calcule el porcentaje normalizado de activación o NPA y actividad inhibitoria, o I0 para los golpes de agonistas y los golpes de antagonistas. Se utilizó una placa de fármaco interna SAC2-34-6170 compuesta por 320 moléculas pequeñas aleatorias para demostrar este ensayo HTS. El HTS tuvo una excelente calidad de ensayo con un factor Z de 0,7 que refleja que la calidad del ensayo independiente de los compuestos probados.
Es esencial leer la placa inmediatamente después de agregar el agonista porque la señal de fluorescencia es de corta duración. Después de este procedimiento, la molécula de acierto identificada debe validarse mediante ensayos de dosis-respuesta y probarse en células que no expresen el GPCR objetivo para excluir los golpes fuera del objetivo.
