Agradecemos a Alejandro Brun de CISA-INIA para proporcionar anti-sueros Rift La fiebre del valle Virus. El trabajo en nuestros laboratorios se apoya en Forschungsförderung joya. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, la Escuela de Graduados de Leibniz para las enfermedades virales emergentes (Eidis), la DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, y la DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

1. Siembra de células A549 para la infección <ol><li> Cultivar un matraz T75 de células A549 a 37 ° C y 5% de CO2 en medio de cultivo celular (DMEM suplementado con 10% de FCS, 526,6 mg / l de L-glutamina, 50.000 U / l de penicilina, y 50 mg / l de estreptomicina). </li><li> Antes de comenzar a cosechar las células, calentar medio de cultivo celular, PBS y 0,05% de tripsina-EDTA en un baño de agua calentado a 37 ° C. </li><li> Se retira el medio y se lavan las células con 10 ml de PBS. Retire la PBS de nuevo. </li><li> Añadir 3 ml de tripsina-EDTA y distribuir por igual en el matraz. 5% de CO 2 Transferir el matraz en un incubador con 37 ° C y. </li><li> Cuando se separan todas las células, añadir 7 ml de medio de cultivo celular, resuspender las células, y transferir la suspensión de células en un tubo Falcon de 15 ml. </li><li> Centrifugar las células a 800 xg durante 5 min a TA, eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml de medio de cultivo celular fresco. </li><li> Contar las células con una cámara de recuento. </li><li> Añadir 2,5 x 10 6 células en 5 ml de medio de cultivo celular en dos matraces T25 cada uno. Incubar durante 16 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Un matraz sirve para el control de maqueta y uno para la infección Cl 13. </li></ol> 2. Infección con Clone fiebre de Rift Valley Virus 13 (Cl 13) <ol><li> NOTA: Cl 13 es un mutante de virus atenuado que en Alemania se puede manejar bajo BSL-2 condiciones. Consulte las normativas nacionales pertinentes. Otros inductores de IFN típicos serían virus Sendai (cepa Cantell) o el virus de la enfermedad de Newcastle. </li><li> , Medio libre de suero Pre-caliente PBS, y el medio de cultivo celular que contiene 5% de FCS. </li><li> Preparar 1.25 x 10 7 PFU / ml de Cl 13 en medio libre de suero para infectar a 2,5 x 10 6 células A549 con una multiplicidad de infección (MOI) de 5. Preparar un poco (aproximadamente 10%) mayor cantidad de la necesaria para tener en cuenta errores de pipeta. </li><li> Lavar las células con PBS como se describe en 1.3. </li><li> Añadir 1 ml de la dilución o Cl 13de medio libre de suero (control no infectado, maqueta) a las células, y se incuba durante 1 hora a 37 ° C y 5% de CO 2. Mueva el frasco cuidadosamente cada 15 minutos para asegurar la distribución equitativa de la Cl 13 dilución y medio libre de suero, respectivamente. </li><li> Después de 1 h de infección, retire la inoculación, añadir 5 ml de medio de cultivo de células pre-calentado con 5% de FCS, y se incuba durante 5 horas a 37 º C y 5% de CO 2. </li></ol> 3. Preparación de lisados ​​de células <ol><li> Preparar PBS / 0,5% de Triton X-100 a 4 ° C. No agregue inhibidores de la proteasa de serina. </li><li> Lavar las células con PBS frío y añadir 10 ml de PBS fresca. </li><li> Raspar las células fuera, transferir la suspensión de células en un tubo Falcon, y centrifugar a 800 xg durante 5 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 30 l de PBS / 0,5% de Triton X-100. Transferir el lisado en un tubo nuevo de 1,5 ml y se incuba durante al menos 10 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar el lisado a 10,000 xg durante 10 min a 4 ° C y transferir el lisado celular clarificado (sobrenadante) en un tubo fresco. </li><li> Determinar la concentración de proteína por el ensayo de Bradford como se describe en otra parte 33. </li><li> Almacenar a -20 ° C o proceder a la digestión de tripsina (4,1) o PAGE nativa (5.1). </li></ol> 4. Determinación de Cambios conformacionales de Reconocimiento de Patrones Receptores <ol><li> Tratamiento TPCK-tripsina de lisados ​​de células <ol><li> Diluir L-1-tosilamido-2-feniletil clorometil cetona tratada con (TPCK) tripsina en PBS a una concentración de trabajo final de 2 mg / l. </li><li> Ajuste en dos nuevos tubos una concentración final de proteína de 25 g de cada proteína lisado (mock o Cl 13) en un volumen final de 9 l con PBS. Por lo tanto, debería ser de cuatro tubos con 25 g de lisado de cada uno, dos veces simuladas y dos veces Cl 13 infección. Un juego como el control de entrada (sin tratar) y otro para el tratamiento con TPCK-tripsina. </li><li> Añadir 1 l de PBS (sin tratar)o 1 l de 2 mg / l de TPCK-tripsina (concentración final: 0,2 g / l) a los lisados ​​de células y mezclar las reacciones mediante pipeteo. NO congelar y descongelar alícuotas-TPCK tripsina, porque va a poner en peligro la eficiencia de la digestión. </li><li> Incubar los lisados ​​a 37 ° C durante 25 min. Detener la reacción mediante la adición de 5x tampón de desnaturalización de la muestra (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% de SDS, 50% de glicerol, 25% β-mercaptoetanol, 0,5% azul de bromofenol) y mediante ebullición durante 5 min a 95 ° C. Es importante no extender el tiempo de incubación con tripsina. En caso de que no hay fragmentos resistentes a la proteasa son detectables, el tiempo de digestión con tripsina se debe acortar. </li><li> Después de la ebullición, las muestras se pueden almacenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> SDS poliacrilamida electroforesis en gel (PAGE) y transferencia Western <ol><li> Cargar las muestras en un dodecil sulfato de sodio (SDS) en gel de poliacrilamida que contiene un apilamiento de 5% en un gel de resolución 12%. Separar las proteínas a 25 mA por gel hastael azul de bromofenol se agote. </li><li> Activar una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) durante 30 segundos con metanol y ponerlo en tampón de transferencia (48 mM Tris, 39 mM glicina, 1,3 mM de SDS, 20% de metanol). </li><li> Preparar la transferencia con un sistema de transferencia semiseco y permitir la transferencia de las proteínas a 10 V durante 1 hora. Tome la membrana, enjuáguelo brevemente con agua y deje que se seque. </li><li> Reactivar la membrana por poco transfiriendo en metanol. Lavar durante 5 min con TBS. Se bloquea con 10% de leche desnatada en TBS durante 1 hora a temperatura ambiente o a 4 º CO / N. Lavar la membrana 3x durante 5 minutos cada uno con TBS. </li><li> Preparar la dilución de anticuerpo como se recomienda en la tabla 1 y se incuba la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente o a 4 º CO / N. </li><li> Lavar la membrana 3x durante 10 min cada uno con TBS-T. Añadir el anticuerpo secundario apropiado acoplado con peroxidasa de rábano picante a una dilución 1:20.000 en 1% de leche desnatada en TBS. Incubar 45 min a TA. </li><li> Lavar la membrana 3x durante 10 min cada uno con TBS-T, y Otiempo adicional ne con TBS. </li><li> Para la detección de la señal de utilizar un kit de quimioluminiscencia comercial y un sistema de imágenes de gel digital. </li></ol></li><li> Coomassie Brilliant tinción azul G-250 <ol><li> Realice SDS-PAGE como se describe en el punto 4.2.1. Cargue las muestras en un gel de poliacrilamida SDS y corren el gel a 25 mA por gel hasta azul de bromofenol se agote. </li><li> Realice brillante coloración azul de Coomassie G-250 a RT. ¿Todas las incubaciones con agitación constante. </li><li> Transferir el gel a la solución de fijación que contiene 40% de metanol y ácido acético al 10% durante 30 min. </li><li> Cambiar el buffer para solución decolorante (25% de etanol y ácido acético al 8%) y se incuba durante 5 min. </li><li> Tinción del gel con 0,2% de Coomassie Azul Brillante G-250 en 40% de metanol y ácido acético al 10% durante 1 hora. </li><li> Destain el gel con la solución decolorante y el intercambio de la memoria intermedia después de 10 min, 30 min, y 60 min. </li><li> Almacenar el gel en 25% de etanol, ácido acético 8%, y 4% de glicerol a 4 ° C. </li&gt; <li> Realice imagen y el análisis como se describe en 4.2.8. </li></ol></li></ol> 5. Análisis de oligoméricas Unidos de Reconocimiento de Patrones Receptores <ol><li> PÁGINA Nativo <ol><li> Preparar 50 g de lisado de células en un volumen final de 10 l con PBS y añadir 5 x tampón de muestra nativo (250 mM de Tris-HCl pH 6,8, 1% de desoxicolato de sodio, 50% de glicerol, 0,5% azul de bromofenol) a una concentración final de 1x. </li><li> Cargar las muestras inmediatamente en un gel de poliacrilamida nativo con 5% como el apilamiento y 8% como gel de resolución. Cualquier retraso se traducirá en una pérdida de complejos nativas 34. </li><li> Correr el gel a 20 mA por gel a 4 ° C con 50 mM de Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM de glicina como como ánodo y 50 mM de Tris pH 8,3, 384 mM de glicina, 1% de desoxicolato de sodio como tampón de cátodo. Después de 1,5 a 2 horas (banda azul de bromofenol haya abandonado el gel de aproximadamente 45 min antes) la electroforesis ha terminado. </li></ol></li><li> Western Blotting <ol><li> Activar un PolyVinylidene fluoruro (PVDF) membrana durante 30 segundos con metanol y se puso en tampón de Towbin (25 mM de Tris, 192 mM glicina, 0,1% de SDS, 20% metanol). </li><li> Montar una cámara blot húmedo de acuerdo con las instrucciones del fabricante y llene el tanque con tampón Towin. </li><li> Realice la transferencia de 250 mA durante 1,5 horas a 4 ° C. </li><li> Cuando secante proseguir de la forma descrita a partir de 4.2.3 a. </li></ol></li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Detección de la presencia de virus y la activación del sistema de tipo antiviral I IFN son cruciales para la respuesta inmune innata de éxito 22. La detección de virus es por ello mediado por los receptores de reconocimiento de patógenos (PRRS) como RIG-I y PKR, lo que permite una respuesta rápida y la activación de mecanismos de defensa antiviral. Aquí se describen dos métodos para evaluar directamente el estado de activación de RIG-I y PKR. Digestión con proteasa Limi...

Un evento crucial en la defensa del huésped antiviral es la detección rápida del patógeno por los receptores de reconocimiento de patrón de llamadas (PRRS) 1,2. La detección intracelular de la infección por virus de ARN depende de dos helicasas de ARN citoplásmico, RIG-I (ácido retinoico de genes inducibles I) y MDA5 (proteína asociada a la diferenciación del melanoma 5) 3-5. RIG-I está compuesta por dos dominios N-terminales de reclutamiento de caspasas (tarjetas), un tipo DECH-box RNA helicasa dominio central, y un dominio C-terminal (CTD) de 4,6. Considerando que el CTD y el dominio helicasa se requieren para el reconocimiento de la no auto RNAs (virales), las tarjetas median la señalización corriente abajo que conduce a establecimiento de un estado anfitrión antiviral. Si RIG-I está en el estado de silencio, es decir, en ausencia de un ligando de ARN específico, la segunda tarjeta interactúa con el dominio helicasa central y mantiene GAR-I en una conformación auto-inhibidor 7-11. RIG-I se une a corto doble-hebra (ds) de ARN que lleva un 5&#39;-trifosfato (5&#39;PPP), largo dsRNA, y polyU / UC-rica ARN, estructuras de firma clásicos que están presentes en los genomas de muchos virus de ARN 12-16. Dos características importantes de la activación de RIG-I son un cambio a una conformación cerrada 6,17 y la homo-oligomerización 6,18,19. El cambio conformacional mejora ARN vinculante, expone las tarjetas de señalización corriente abajo, y reconstituye un sitio ATPasa activa 8,9,11,20. La formación de complejos oligoméricos RIG-I conduce a una mayor captación de las moléculas adaptadoras de señalización aguas abajo para formar una plataforma para la transducción de señales antiviral 11. La cadena de señalización regulada por el RIG-I se activa con el tiempo el factor de transcripción IRF-3 para la regulación de interferón genes (IFN-alpha/beta) y por lo tanto la expresión génica de los genes de interferón estimulado (ISGs) para una respuesta antiviral completa 21,22 . Uno de los mejor caracterizados ISGs es la proteinuria ARN-activadon quinasa (PKR) 23. PKR pertenece a la familia de iniciación de la traducción eucariótica factor de 2 alfa (eIF2α) quinasas y se compone de un dominio de ARN de doble cadena de unión y un dominio C-terminal de la quinasa N-terminal. El dominio quinasa constituye la interfaz de dimerización crucial para la activación de PKR y lleva a cabo las funciones catalíticas de la proteína. La unión de PKR a dsRNA viral conduce a su cambio conformacional que permite la dimerización y auto-fosforilación en Thr 446, entre otros residuos. PKR continuación, media la fosforilación de eIF2α, bloqueando de este modo la traducción de los ARNm viral 23-27. Tanto RIG-I y PKR sufrir importantes reajustes estructurales, forman complejos oligómeros y son después de la traducción modificado por fosforilación / desfosforilación y ubiquitinación 10,11,19,23,24,26-29. Para una mejor comprensión de lo que las estructuras de ARN virales están activando RIG-I y PKR (y en qué etapa antagonistas virales podrían be interferir), es importante determinar con precisión el estado de activación. Para ambos parentales que se ha descrito anteriormente que la activación conduce a la aparición de fragmentos de proteína resistente a tripsina 6,17,30 y oligómeros de orden superior 6,18,19. Sin embargo, dada la gran cantidad de literatura sobre estos factores clave de la respuesta del huésped antiviral 1,2,24, la aplicación de métodos directos parece relativamente rara. En la esperanza de estimular el uso más amplio, ofrecemos protocolos convenientes y sensibles para analizar con firmeza los estados de activación de RIG-I y PKR. El IFN competente línea celular humana A549 está infectado con un activador establecida de RIG-I y PKR, el virus de la fiebre del Valle del Rift atenuada clon mutante 13 (Cl 13) 31,32. Después de un procedimiento de lisis simple, los extractos de células infectadas se prueban por digestión análisis de transferencia limitada tripsina / Western para evaluar conmutación conformacional, y por azul electroforesis nativa en gel de poliacrilamida (PAGE) / Analys Western blotes medir la formación de oligómeros.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

Las defensas del huésped a la infección por virus dependen de una detección rápida por los receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) del sistema inmune innato. En el citoplasma, los derechos y responsabilidades parentales RIG-I y PKR se unen a ligandos específicos de ARN viral. Esta primera media la conmutación conformacional y oligomerización y, a continuación, permite la activación de una respuesta antiviral de interferón. Si bien los métodos para medir la expresión de genes antivirales de acogida están bien establecidos, los métodos para supervisar directamente los estados de activación de RIG-I y PKR son sólo parcialmente y menos bien establecidos. Aquí se describen dos métodos para controlar RIG-I y PKR estimulación tras la infección con un inductor de interferón establecido, el virus de la fiebre del Valle del Rift clon mutante 13 (Cl 13). Digestión con tripsina Limited permite analizar las alteraciones en la sensibilidad a la proteasa, lo que indica cambios conformacionales de los derechos y responsabilidades parentales. La digestión con tripsina de lisados ​​de simulacros de las células infectadas como resultado una rápida degradación de RIG-I y PKR, whereas Cl 13 infección conduce a la aparición de un fragmento resistente a la proteasa RIG-I. También PKR muestra una resistencia parcial inducida por el virus de la digestión de la tripsina, que coincide con su fosforilación en Thr sello 446. La formación de RIG-I y oligómeros PKR fue validado por electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE). Tras la infección, existe una fuerte acumulación de RIG-I y complejos oligoméricos PKR, mientras que estas proteínas se mantuvieron como monómeros en muestras infectados de forma simulada. Digestión con proteasa Limited y PAGE nativa, tanto acopladas a análisis de Western blot, permiten una medición sensible y directa de dos diversas etapas de RIG-I y la activación de PKR. Estas técnicas son relativamente fácil y rápido de realizar y no requieren equipos costosos.

El reconocimiento de un agonista viral RIG-I o PKR desencadena conmutación conformacional 6,17,30 y oligomerización 6,18,27. Estamos analizarse estos dos marcadores de activación por digestión con proteasa limitada y electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE), respectivamente. Células A549 humanas fueron infectadas con el clon de virus de la fiebre del Valle del Rift 13 (Cl 13), que se caracteriza por una mutación del antagonista de IFN NSS 35,36.<...

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Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Defensas innatas a las infecciones por virus son provocados por los receptores de reconocimiento de patrones (RRP). Los dos PRRs citoplasmáticos RIG-I y PKR se unen a los ARN virales de firma, cambio de conformación, oligomerize y activar la señalización antiviral. Se describen procedimientos que permiten controlar cómodamente el cambio conformacional y la oligomerización de estos derechos y responsabilidades parentales citoplasmáticos.

Monitoreo La activación del antiviral Pattern Recognition Receptores RIG-I Y PKR Por Limited proteasa Digestión y PÁGINA Nativo

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K vistas.  Philipps-University Marburg.  Defensas innatas a las infecciones por virus son provocados por los receptores de reconocimiento de patrones (RRP). Los dos PRRs citoplasmáticos RIG-I y PKR se unen a los ARN virales de firma, cambio de conformación, oligomerize y activar la señalización antiviral. Se describen procedimientos que permiten controlar cómodamente el cambio conformacional y la oligomerización de estos derechos y responsabilidades parentales citoplasmáticos. 

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Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In genetically predisposed individuals, tTG2 triggers autoimmune responses that are characterized by the production of tTG2 antibodies and their direct deposition into small intestinal wall 1,2. The presence of such antibodies constitutes one of the major hallmarks of the celiac disease (CD). Epidermal transglutaminase (eTG) is another member of the transglutaminase family that can also function as an autoantigen in a small minority of CD patients. In these relatively rare cases, eTG triggers an autoimmune reaction (a skin rash) clinically known as dermatitis herpetiformis (DH). Although the exact mechanism of CD and DH pathogenesis is not well understood, it is known that tTG2 and eTG share antigenic epitopes that can be recognized by serum antibodies from both CD and DH patients 3,4.
In this study, the confocal microscopy examination of biopsy samples from skin lesions of two rhesus macaques (Macaca mulatta) with dermatitis (Table 1, Fig. 1 and 2) was used to study the affected tissues. In one animal (EM96) a spectral overlap of IgA and tTG2 antibodies (Fig. 3) was demonstrated. The presence of double-positive tTG2+IgA+ cells was focused in the deep epidermis, around the dermal papillae. This is consistent with lesions described in DH patients 3. When EM96 was placed on a gluten-free diet, the dermatitis, as well as tTG2+IgA+ deposits disappeared and were no longer detectable (Figs. 1-3). Dermatitis reappeared however, based on re-introduction of dietary gluten in EM96 (not shown). In other macaques including animal with unrelated dermatitis, the tTG2+IgA+ deposits were not detected. Gluten-free diet-dependent remission of dermatitis in EM96 together with presence of tTG2+IgA+ cells in its skin suggest an autoimmune, DH-like mechanism for the development of this condition. This is the first report of DH-like dermatitis in any non-human primate.

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) is a chronic inflammatory condition characterized by an autoimmune reaction between IgA and epidermal transglutaminase (eTG). DH develops in a very small portion of gluten-sensitive and/or celiac patients. The results of this study indicate that DH can also develop in a rhesus monkey host with symptoms of idiopatic dermatitis.

Reconocimiento de la transglutaminasa epidérmica por IgA y anticuerpos transglutaminasa tisular 2 en un raro caso de Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Investigación

Inmunología e Infección

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

La inmunofluorescencia para supervisar la captación celular de lactoferrina humana y su Asociado actividad antiviral contra el virus de hepatitis C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Ensayos pronta entrada virales para la identificación y evaluación de compuestos antivirales

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura y Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Ensayo de co-inmunoprecipitación para el estudio de las interacciones funcionales entre los receptores y enzimas

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Proyección de imagen confocal de ARN bicatenario y receptores de reconocimiento de patrón en la infección por Virus de ARN de sentido negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Procesamiento de imagen protocolo para el análisis de la difusión y del tamaño del clúster de receptores de membrana por microscopía de fluorescencia

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...