Nous remercions Alejandro Brun de CISA-INIA pour fournir anti-fièvre de la vallée du Rift Virus sérums. Travail dans nos laboratoires est soutenu par Forschungsförderung bijou. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, la Graduate School Leibniz pour les maladies virales émergentes (Eidis), la DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, et la DFG Schwerpunktprogramm (PSP) 1596.

1. L&#39;ensemencement des cellules A549 pour infection <ol><li> Cultiver un flacon T75 de cellules A549 à 37 ° C et 5% de CO2 dans du milieu de culture cellulaire (DMEM supplémenté avec 10% de FCS, 526,6 mg / l de L-glutamine, 50.000 U / l de pénicilline et 50 mg / l de streptomycine). </li><li> Avant de commencer à récolter les cellules, réchauffer le milieu de culture cellulaire, du PBS et 0,05% de trypsine-EDTA dans un bain-marie chauffé à 37 ° C. </li><li> Retirez le support et laver les cellules avec 10 ml de PBS. Retirer à nouveau la PBS. </li><li> Ajouter 3 ml de trypsine-EDTA et répartir également dans le ballon. Transférer le ballon dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Lorsque toutes les cellules sont décollées, ajouter 7 ml de milieu de culture cellulaire, de remettre en suspension les cellules, et transférer la suspension de cellules dans un tube Falcon de 15 ml. </li><li> Centrifuger les cellules à 800 xg pendant 5 min à température ambiante, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml de milieu de culture cellulaire frais. </li><li> Compter les cellules avec une chambre de comptage. </li><li> Ajouter 2,5 x 10 6 cellules dans 5 ml de milieu de culture cellulaire dans deux flacons T25 chacune. Incuber pendant 16 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Un flacon sert pour le contrôle maquette et une pour infection Cl 13. </li></ol> 2. L&#39;infection par le virus de la Rift Valley Fever Clone 13 (Cl 13) <ol><li> REMARQUE: Cl 13 est un mutant du virus atténué qui en Allemagne peut être manipulé dans BSL-2 conditions. S&#39;il vous plaît se référer aux directives nationales pertinentes. D&#39;autres inducteurs d&#39;IFN typiques seraient virus Sendai (souche Cantell) ou le virus de la maladie de Newcastle. </li><li> , Un milieu exempt de sérum pré-PBS chaud, et un milieu de culture cellulaire contenant 5% de FCS. </li><li> Préparer 1,25 x 10 7 UFP / ml de Cl 13 dans du milieu sans sérum pour infecter 2,5 x 10 6 cellules A549 avec une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 5. Préparer une quantité légèrement (environ 10%) plus grand que nécessaire pour tenir compte de les erreurs de pipetage. </li><li> Laver les cellules avec du PBS comme décrit sous 1.3. </li><li> Ajouter 1 ml de la dilution 13 Cl oude milieu sans sérum (témoin non infecté, mock) aux cellules et incuber pendant 1 heure à 37 ° C et 5% de CO 2. Déplacer le ballon soigneusement toutes les 15 min pour assurer une distribution égale de Cl et 13 dilution du milieu sans sérum, respectivement. </li><li> Après 1 h d&#39;infection, les inoculums supprimer, ajouter 5 ml de milieu préchauffé de culture de cellules avec 5% de FCS, et incuber pendant 5 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3. Préparation des lysats cellulaires <ol><li> Préparer du PBS / 0,5% de Triton X-100 à 4 ° C. Ne pas ajouter des inhibiteurs de protease à serine. </li><li> Laver les cellules avec du PBS froid et ajouter 10 ml de PBS frais. </li><li> Grattez les cellules off, transférer la suspension de cellules dans un tube de faucon, et centrifuger à 800 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 30 ul de PBS / 0,5% de Triton X-100. Transférer le lysat dans un nouveau tube de 1,5 ml et incuber pendant au moins 10 min à 4 ° C. </li><li> Centrifuger le lysat à 10h000 x g pendant 10 min à 4 ° C et à transférer le lysat cellulaire clarifié (surnageant) dans un tube frais. </li><li> Déterminer la concentration en protéine par dosage de Bradford comme décrit par ailleurs 33. </li><li> Conserver à -20 ° C ou procéder à la digestion de la trypsine (4.1) ou PAGE native (5.1). </li></ol> 4. Détermination des changements conformationnels de Pattern Recognition Receptors <ol><li> Traitement TPCK-trypsine de Lysats de cellules <ol><li> Diluer L-1-tosylamido-2-phényléthyl-chlorométhyl cétone traitée (TPCK) de la trypsine dans du PBS à une concentration de travail finale de 2 ug / ul. </li><li> Régler dans deux nouveaux tubes une concentration finale en protéine de 25 ug de chaque lysat de protéine (mock ou Cl. 13) dans un volume final de 9 pl avec du PBS. Par conséquent, il devrait être de quatre tubes avec 25 ng de chaque lysat, deux fois simulés et deux fois 13 Cl infection. Un jeu comme le contrôle d&#39;entrée (non traité) et un ensemble de traitement avec TPCK-trypsine. </li><li> Ajouter 1 pl de PBS (non traité)ou 1 ul de 2 ug / ul TPCK-trypsine (concentration finale: 0,2 pg / pl) pour les lysats cellulaires et les réactions mélanger par pipetage. NE PAS congeler et décongeler aliquotes de TPCK-trypsine, car il risque de compromettre l&#39;efficacité de la digestion. </li><li> Incuber les lysats à 37 ° C pendant 25 min. Arrêter la réaction en ajoutant de 5x tampon de dénaturation de l&#39;échantillon (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% de SDS, 50% glycerol, 25% β-mercaptoéthanol, 0,5% de bleu de bromophénol) et en faisant bouillir pendant 5 min à 95 ° C. Il est important de ne pas prolonger le temps d&#39;incubation de la trypsine. Dans le cas où aucun des fragments d&#39;résistante aux protéases sont détectables, au moment de la digestion par la trypsine doit être raccourcie. </li><li> Après l&#39;ébullition, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C. </li></ol></li><li> SDS sur gel de polyacrylamide (PAGE) et Western Blot <ol><li> Charger les échantillons sur un dodécylsulfate de sodium (SDS) gel de polyacrylamide contenant un empilement de 5% sur un gel de résolution à 12%. Séparer les protéines à 25 mA par gel jusqu&#39;àle bleu de bromophénol s&#39;épuise. </li><li> Activer un polyfluorure de vinylidène (PVDF) pendant 30 secondes avec du methanol et le mettre dans un tampon de transfert (Tris 48 mM, glycine 39 mM, 1,3 mM de SDS, 20% de methanol). </li><li> Préparer le blot avec un système de blotting semi-sec et de permettre le transfert des protéines à 10 V pendant 1 h. Prenez la membrane, rincez brièvement avec de l&#39;eau, et laisser sécher. </li><li> Réactiver la membrane en transférant peu en méthanol. Laver pendant 5 min avec du TBS. Bloc avec 10% de lait écrémé dans du TBS pendant 1 heure à température ambiante ou à 4 ° CO / N. Laver 3x de membrane pendant 5 min chacun avec le SCT. </li><li> Préparation de l&#39;anticorps en tant que la dilution recommandée dans le tableau 1 et incuber la membrane pendant 1 heure à température ambiante ou à 4 ° CO / N. </li><li> Laver 3x de membrane pendant 10 minutes chacune avec TBS-T. Ajouter l&#39;anticorps secondaire approprié couplé à la peroxydase de raifort à une dilution de 1:20,000 dans 1% de lait écrémé dans du TBS. Incuber 45 minutes à température ambiante. </li><li> Laver 3x de membrane pendant 10 minutes chacune avec TBS-T, et oun délai supplémentaire ne SCT. </li><li> Pour la détection du signal utiliser un kit de chimioluminescence commercial et un système d&#39;imagerie numérique de gel. </li></ol></li><li> Coloration au bleu de Coomassie G-250 <ol><li> Effectuer SDS-PAGE comme décrit au point 4.2.1. Charger les échantillons sur un gel de polyacrylamide SDS et courent le gel à 25 mA par gel jusqu&#39;à bleu de bromophénol s&#39;épuise. </li><li> Effectuer Coomassie coloration bleu G-250 à TA. Faire toutes les incubations sous agitation constante. </li><li> Transférer le gel dans la solution de fixation contenant 40% de méthanol et d&#39;acide acétique à 10% pendant 30 min. </li><li> Échanger le tampon de la solution de décoloration (25% d&#39;éthanol et d&#39;acide acétique à 8%) et incuber pendant 5 min. </li><li> Colorer le gel avec 0,2% de bleu de Coomassie Brillant G-250 dans 40% de methanol et d&#39;acide acétique à 10% pendant 1 heure. </li><li> Décolorer le gel avec la solution de décoloration et échanger le tampon après 10 min, 30 min et 60 min. </li><li> Stocker le gel à 25% d&#39;éthanol, de l&#39;acide acétique à 8%, et de 4% de glycerol à 4 ° C. </li&gt; <li> Effectuez l&#39;imagerie et l&#39;analyse comme décrit sous 4.2.8. </li></ol></li></ol> 5. Analyse des oligomères Unis d&#39;Pattern Recognition Receptors <ol><li> PAGE natif <ol><li> Préparer 50 pg de lysat de cellules dans un volume final de 10 pl avec du PBS et ajouter 5 x tampon native de l&#39;échantillon (250 mM Tris-HCl pH 6,8, du désoxycholate de sodium à 1%, 50% de glycerol, 0,5% bleu de bromophénol) à une concentration finale de 1x. </li><li> Charger les échantillons immédiatement sur un gel de polyacrylamide natif avec 5% d&#39;empilage et de 8% en gel de résolution. Tout retard entraînera une perte de complexes indigènes 34. </li><li> Exécuter le gel à 20 mA par gel à 4 ° C avec 50 mM de Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM de glycine comme anode et comme 50 mM de Tris pH 8,3, 384 mM glycine, le désoxycholate de sodium à 1% comme tampon de cathode. Après 1,5-2 h (bande bleu de bromophénol a quitté le gel d&#39;environ 45 min plus tôt) l&#39;électrophorèse est terminée. </li></ol></li><li> Western Blot <ol><li> Activer une polyvinylidene fluorure (PVDF) pendant 30 secondes avec du méthanol et mettre en mémoire tampon Towbin (Tris 25 mM, glycine 192 mM, 0,1% de SDS, 20% de methanol). </li><li> Monter une chambre de transfert humide selon les instructions du fabricant et remplir le réservoir avec du tampon Towin. </li><li> Effectuer le blot avec 250 mA pendant 1,5 h à 4 ° C. </li><li> Lorsque buvard est terminé, procédez comme décrit à partir de 4.2.3. </li></ol></li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Détecter la présence de virus et l&#39;activation du type antiviral système I IFN sont cruciales pour les réponses immunitaires innées succès 22. La détection des virus est donc médiatisée par la reconnaissance des agents pathogènes récepteurs (PRR) comme RIG-I et PKR, ce qui permet une réponse rapide et l&#39;activation des mécanismes de défense antivirale. Ici, nous décrivons deux méthodes pour évaluer directement l&#39;état d&#39;activation de RIG-I et de PKR. ...

Un événement crucial dans la défense antivirale de l&#39;hôte est la détection rapide de l&#39;agent pathogène par les soi-disant récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) 1,2. La détection intracellulaire de l&#39;infection par le virus à ARN est dépendante de deux hélicases d&#39;ARN cytoplasmique, RIG-I (gène inductible par l&#39;acide rétinoïque I) et MDA5 (différenciation des mélanomes protéine associée 5) 3-5. RIG-I est composée de deux domaines N-terminaux recrutement de caspase (CARDS), un domaine ARN hélicase de type DECH-caisson central, et un domaine C-terminal (CTD) 4,6. Considérant que le CTD et le domaine hélicase sont nécessaires pour la reconnaissance de la non-autonomes (ARN viraux), les cartes médiation signalisation en aval conduisant à l&#39;établissement d&#39;un statut d&#39;hôte antiviral. Si RIG-I est à l&#39;état silencieux, c&#39;est à dire en l&#39;absence d&#39;un ligand d&#39;ARN spécifique, la deuxième carte interagit avec le domaine hélicase central et maintient RIG-I dans une conformation d&#39;auto-inhibition de 7-11. RIG-I se lie à court doublebrin (ds) ARN portant un 5&#39;-triphosphate (5&#39;PPP), à long ARN double brin et l&#39;ARN polyU / UC-riche, structures de signature classiques qui sont présents sur les génomes de nombreux virus à ARN de 12-16. Deux caractéristiques majeures de RIG-I activation sont un commutateur à une conformation fermée 6,17 et l&#39;homo-oligomérisation 6,18,19. L&#39;interrupteur conformationnel améliore liaison à l&#39;ARN, expose les cartes pour la signalisation en aval, et reconstitue un site ATPase actif 8,9,11,20. La formation de complexes oligomères RIG-I conduit à accroître le recrutement de molécules d&#39;adaptateurs en aval de la signalisation pour former une plate-forme pour la transduction du signal 11 antiviral. La chaîne de signalisation RIG-I-régulé éventuellement active le facteur de transcription IRF-3, pour la régulation de l&#39;interféron (IFN-alpha/beta) gènes et par conséquent l&#39;expression génique de gènes stimulés par l&#39;interféron (ISG) pour une réponse antivirale complète 21,22 . L&#39;un des meilleurs ISGs caractérisé est le protei ARN activén kinase (PKR) 23. PKR appartient à la famille du facteur d&#39;initiation de traduction eucaryote alpha 2 (eIF2α) kinases et est composé d&#39;un domaine de liaison à N-terminal de l&#39;ARN double brin et un domaine de kinase C-terminal. Le domaine de kinase constitue l&#39;interface de dimérisation cruciale pour l&#39;activation de PKR et réalise les fonctions catalytiques de la protéine. Reliure de PKR à l&#39;ARN double brin viral conduit à son changement de conformation permettant la dimérisation et l&#39;auto-phosphorylation sur Thr 446 entre autres résidus. PKR produit ensuite la phosphorylation de eIF2α, bloquant ainsi la traduction des ARNm viral 23-27. Les deux RIG-I et PKR objet d&#39;importants réaménagements structurels, former des complexes oligomères et sont modifications post-traductionnelles par phosphorylation / déphosphorylation et ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. Pour une meilleure compréhension de laquelle les structures d&#39;ARN viral activent RIG-I et PKR (et à quel stade antagonistes virales pourraient binterférant e), il est important de déterminer avec précision l&#39;état d&#39;activation. Pour les deux PRRs il a été précédemment décrit que l&#39;activation conduit à l&#39;apparition de fragments de protéine résistant à la trypsine 6,17,30 et oligomères d&#39;ordre supérieur 6,18,19. Toutefois, compte tenu de la richesse de la littérature sur les facteurs clés de la réponse antivirale de l&#39;hôte 1,2,24, l&#39;application de méthodes directes semble relativement rare. Dans l&#39;espoir de stimuler l&#39;utilisation plus large, nous fournissons des protocoles pratiques et sensibles pour analyser robuste les états d&#39;activation de RIG-I et PKR. Le compétente A549 de lignée cellulaire humaine IFN est infecté par un activateur établi de RIG-I et de PKR, le virus de la fièvre de la Vallée du Rift atténué clone mutant 13 (Cl 13) 31,32. Après une procédure de lyse simple, les extraits de cellules infectées sont testés par digestion à la trypsine / ouest analyse limitée blot pour évaluer commutation de conformation, et par le bleu natif gel de polyacrylamide (PAGE) / analys Western blotest de mesurer la formation d&#39;oligomères.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

Défenses de l&#39;hôte à l&#39;infection par le virus dépendent d&#39;une détection rapide par les récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) du système immunitaire inné. Dans le cytoplasme, les PRR RIG-I et de PKR se lient à des ligands spécifiques d&#39;ARN viral. Cette première commutation assure la médiation de conformation et l&#39;oligomérisation, et permet ensuite l&#39;activation d&#39;une réponse antivirale de l&#39;interféron. Bien que les méthodes de mesure de l&#39;expression des gènes de l&#39;hôte antiviral sont bien établis, des méthodes pour surveiller directement les états d&#39;activation de RIG-I et PKR ne sont que partiellement et moins bien établis. Ici, nous décrivons deux méthodes pour surveiller RIG-I et PKR stimulation lors de l&#39;infection avec un inducteur d&#39;interféron établie, le virus vallée du Rift clone mutant 13 (Cl 13). Digestion de la trypsine limité permet d&#39;analyser les modifications de la sensibilité de la protéase, indiquant des changements de conformation des PRR. Digestion par la trypsine de lysats de maquettes résultats cellules infectées à une dégradation rapide de RIG-I et PKR, whereas Cl 13 infection conduit à l&#39;émergence d&#39;un RIG-I fragment résistant aux protéases. Aussi PKR présente une résistance partielle induite par le virus de la digestion de la trypsine, qui coïncide avec sa marque de fabrique de la phosphorylation au niveau de Thr 446. La formation de RIG-I et oligomères PKR a été validé par électrophorèse native sur gel de polyacrylamide (PAGE). Lors de l&#39;infection, il existe une forte accumulation de complexes d&#39;oligomères PKR RIG-I et, alors que ces protéines sont restés en tant que monomères dans des échantillons infectés simulés. Digestion de protéase Limited et PAGE native, à la fois couplées à une analyse Western blot, permet une mesure sensible et directe de deux différentes étapes de RIG-I et l&#39;activation de PKR. Ces techniques sont relativement faciles et rapides à réaliser et ne nécessitent pas un équipement coûteux.

La reconnaissance d&#39;un agoniste virale par RIG-I ou PKR déclenche commutation conformationnelle 6,17,30 et oligomérisation 6,18,27. Nous avons mesuré ces deux marqueurs d&#39;activation par digestion de protéase native limitée et électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), respectivement. Les cellules A549 humaines ont été infectées avec le virus de la fièvre du Rift Valley clone 13 (Cl 13), qui est caractérisée par une mutation de l&#39;antagonist...

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Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Défenses innées à des infections virales sont déclenchés par des récepteurs de reconnaissance des formes (PRR). Les deux PRR cytoplasmiques RIG-I et PKR se lient aux ARN viraux de signature, le changement de conformation, oligomérisation, et activer la signalisation antiviral. Les méthodes sont décrites qui permettent de surveiller facilement la commutation de conformation et l&#39;oligomérisation de ces PRR cytoplasmiques.

Suivi d&#39;activation du motif de reconnaissance antiviraux récepteurs RIG-I et par PKR limitée protéase digestion et PAGE native

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K vues.  Philipps-University Marburg.  Défenses innées à des infections virales sont déclenchés par des récepteurs de reconnaissance des formes (PRR). Les deux PRR cytoplasmiques RIG-I et PKR se lient aux ARN viraux de signature, le changement de conformation, oligomérisation, et activer la signalisation antiviral. Les méthodes sont décrites qui permettent de surveiller facilement la commutation de conformation et l'oligomérisation de ces PRR cytoplasmiques. 

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Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In genetically predisposed individuals, tTG2 triggers autoimmune responses that are characterized by the production of tTG2 antibodies and their direct deposition into small intestinal wall 1,2. The presence of such antibodies constitutes one of the major hallmarks of the celiac disease (CD). Epidermal transglutaminase (eTG) is another member of the transglutaminase family that can also function as an autoantigen in a small minority of CD patients. In these relatively rare cases, eTG triggers an autoimmune reaction (a skin rash) clinically known as dermatitis herpetiformis (DH). Although the exact mechanism of CD and DH pathogenesis is not well understood, it is known that tTG2 and eTG share antigenic epitopes that can be recognized by serum antibodies from both CD and DH patients 3,4.
In this study, the confocal microscopy examination of biopsy samples from skin lesions of two rhesus macaques (Macaca mulatta) with dermatitis (Table 1, Fig. 1 and 2) was used to study the affected tissues. In one animal (EM96) a spectral overlap of IgA and tTG2 antibodies (Fig. 3) was demonstrated. The presence of double-positive tTG2+IgA+ cells was focused in the deep epidermis, around the dermal papillae. This is consistent with lesions described in DH patients 3. When EM96 was placed on a gluten-free diet, the dermatitis, as well as tTG2+IgA+ deposits disappeared and were no longer detectable (Figs. 1-3). Dermatitis reappeared however, based on re-introduction of dietary gluten in EM96 (not shown). In other macaques including animal with unrelated dermatitis, the tTG2+IgA+ deposits were not detected. Gluten-free diet-dependent remission of dermatitis in EM96 together with presence of tTG2+IgA+ cells in its skin suggest an autoimmune, DH-like mechanism for the development of this condition. This is the first report of DH-like dermatitis in any non-human primate.

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) is a chronic inflammatory condition characterized by an autoimmune reaction between IgA and epidermal transglutaminase (eTG). DH develops in a very small portion of gluten-sensitive and/or celiac patients. The results of this study indicate that DH can also develop in a rhesus monkey host with symptoms of idiopatic dermatitis.

La reconnaissance de la transglutaminase épidermique par les IgA et Tissue Transglutaminase 2 anticorps dans un cas rare de Rhésus Dermatite

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Recherche

Immunologie et infection

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Immunofluorescence de suivi de l&#39;absorption cellulaire de la lactoferrine humaine et de son activité associée antivirale contre le virus de l&#39;hépatite C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Early Viral entrée dosages pour l&#39;identification et l&#39;évaluation des composés antiviraux

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

le<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture et Pattern Recognition Receptor Stimulation de la souris Intestinal organites

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Générateur<em&gt; De Novo</em&gt; Spécifiques de l&#39;antigène T Human cellulaires Receptors par rétrovirale transduction de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-Immunoprécipitation dosage pour l’étude des Interactions fonctionnelles entre les récepteurs et les Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Traitement d’image protocole pour l’analyse de la Diffusion et la taille de Cluster de récepteurs membranaires par microscopie de Fluorescence

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...