Agradecemos Alejandro Brun do CISA-INIA para fornecer anti-febre Rift Vale Vírus soros. Trabalho em nossos laboratórios é suportado por Forschungsförderung jóia. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, da Escola de Pós-Graduação Leibniz para doenças virais emergentes (EIDIS), o DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, ea DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

1. Sementeira de Células A549 para a Infecção <ol><li> Cultivar um frasco T75 de células A549 a 37 ° C e 5% de CO 2 em meio de cultura celular (DMEM suplementado com FCS a 10%, 526,6 mg / l de L-glutamina, 50,000 U / l de penicilina, e 50 mg / l de estreptomicina). </li><li> Antes de iniciar a colheita das células, aquecer-se o meio de cultura de células, PBS e 0,05% de tripsina-EDTA em um banho de água aquecida a 37 ° C. </li><li> Remover o meio e lava-se as células com 10 ml de PBS. Remover o PBS novamente. </li><li> Adicionar 3 ml de tripsina-EDTA e distribuir igualmente no balão. Transferir o frasco em um incubador com 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Quando todas as células são separadas, adicionar 7 ml de meio de cultura celular, ressuspender as células, e transferir a suspensão de células para um tubo Falcon de 15 ml. </li><li> Centrifugar as células a 800 xg durante 5 min à temperatura ambiente, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de meio de cultura de células fresco. </li><li> Contar as células com uma câmara de contagem. </li><li> Adicionar 2,5 x 10 6 células em 5 ml de meio de cultura de células em frascos T25 dois cada. Incubar durante 16 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Um frasco serve para o controle de simulação e outro para infecção Cl 13. </li></ol> 2. Infecção com Vírus da Febre do Vale do Rift Clone 13 (Cl 13) <ol><li> NOTA: Cl 13 é um mutante do vírus atenuado, que na Alemanha pode ser tratado sob condições de NBS-2. Por favor, consulte as diretrizes nacionais relevantes. Outros indutores de IFN típicas seria vírus Sendai (cepa Cantell) ou vírus da doença de Newcastle. </li><li> PBS, meio isento de soro pré-quente, e meio de cultura de células, contendo 5% de FCS. </li><li> Prepare a 1,25 x 10 7 PFU / ml de Cl 13 em meio isento de soro, para infectar de 2,5 x 10 6 células A549 com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. Prepara-se uma quantidade ligeiramente (aproximadamente 10%) maior do que o necessário para ter em conta erros de pipeta. </li><li> Lavar as células com PBS, como descrito em 1.3. </li><li> Adicionar 1 ml da diluição 13 Cl oude meio isento de soro (controlo não infectado, simulada) para as células, e incuba-se durante 1 hora a 37 ° C e 5% de CO 2. Mova o frasco com cuidado a cada 15 minutos para garantir a igualdade de distribuição de Cl 13 diluição e meio livre de soro, respectivamente. </li><li> Após 1 hr de infecção, remover o inóculo, adicionam-se 5 ml de meio de cultura de células pré-aquecido com 5% de FCS, e incubar durante 5 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 3. Preparação de Lisados ​​celulares <ol><li> Prepare PBS / 0,5% de Triton X-100 a 4 ° C. Não adicionar inibidores de protease serina. </li><li> Lavar as células com PBS frio e adicione 10 ml de PBS fresco. </li><li> Raspar as células fora e transferir a suspensão de células num tubo de Falcon, e centrifugar a 800 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 30 ul de PBS / 0,5% de Triton X-100. Transferir o lisado para um novo tubo de 1,5 ml e incubar durante pelo menos 10 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar o lisado às 10h000 xg durante 10 min a 4 ° C e transferir o lisado celular clarificado (sobrenadante) para um tubo fresco. </li><li> Determinar a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford, tal como descrito noutro local 33. </li><li> Armazenar a -20 ° C, ou prosseguir para a digestão de tripsina (4,1) ou PAGE nativa (5,1). </li></ol> 4. Determinação de alterações na conformação do Pattern Recognition Receptores <ol><li> Tratamento de TPCK-tripsina de lisados ​​celulares <ol><li> Dilui-se L-1-tosylamido-2-fenil-etil-clorometil tratada cetona (TPCK) tripsina em PBS para uma concentração de trabalho final de 2 mg / mL. </li><li> Ajustar em dois novos tubos de uma concentração final de proteína de 25 ug de proteína de cada ligado (simulada ou Cl 13) em um volume final de 9 mL com PBS. Por isso, deve ser de quatro tubos com 25 mcg lisado cada, duas vezes simulados e duas vezes Cl infecção 13. Uma definido como controle de entrada (sem tratamento) e um conjunto para o tratamento com TPCK-tripsina. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS (sem tratamento)ou 1 ul de 2 mg / mL de TPCK-tripsina (concentração final: 0,2 mg / mL) para os lisados ​​de células e misturar as reacções por pipetagem. NÃO congelar e descongelar alíquotas TPCK-tripsina, porque vai comprometer a eficiência da digestão. </li><li> Incubar os lisados ​​a 37 ° C durante 25 min. Parar a reacção por adição de 5x tampão de desnaturação da amostra (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glicerol, 25% β-mercaptoetanol, 0,5% de azul de bromofenol) e por ebulição durante 5 min a 95 ° C. É importante para não aumentar o tempo de incubação com tripsina. No caso de não haver fragmentos resistentes à protease são detectáveis, o tempo de digestão de tripsina deve ser encurtado. </li><li> Depois de ferver, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C. </li></ol></li><li> SDS poliacrilamida Eletroforese em Gel (PAGE) e Western Blotting <ol><li> Coloque as amostras em um dodecil sulfato de sódio (SDS) em gel de poliacrilamida contendo um empilhamento de 5% ao longo de um gel de resolução de 12%. Separam-se as proteínas a 25 mA por gel atéo azul de bromofenol se esgote. </li><li> Ative uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) por 30 segundos com metanol e colocá-lo em tampão de transferência (Tris 48 mM, glicina 39 mM, SDS 1,3 mM, 20% de metanol). </li><li> Prepare o blotting com um sistema de mancha semi-seco e permitir a transferência das proteínas a 10 V durante 1 hora. Tome a membrana para fora, lave-o rapidamente com água e deixe secar. </li><li> Reativar a membrana por pouco transferindo para o metanol. Lavar durante 5 minutos com TBS. Bloco com 10% de leite desnatado em TBS durante 1 hora à temperatura ambiente ou a 4 ° CO / N. Lava-se a membrana 3 vezes durante 5 minutos cada com TBS. </li><li> Prepare a diluição de anticorpo, tal como recomendado na tabela 1 e incubar a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente ou a 4 ° CO / N. </li><li> Lava-se a membrana 3 vezes durante 10 minutos cada com TBS-T. Adicionar o anticorpo secundário adequado, juntamente com peroxidase de rábano, a uma diluição de 1:20000 em 1% de leite desnatado em TBS. Incubar 45 min a RT. </li><li> Lava-se a membrana 3 vezes durante 10 minutos cada com TBS-T, e otempo adicional ne com TBS. </li><li> Para a detecção do sinal usar um kit de quimioluminescência comercial e de um sistema de imagem gel digital. </li></ol></li><li> Coomassie Brilliant Blue G-Coloração 250 <ol><li> Realize SDS-PAGE como descrito no ponto 4.2.1. Carregar as amostras em um gel de poliacrilamida SDS e executar o gel a 25 mA por gel até bromofenol azul esgote. </li><li> Realizar Comassie coloração azul L-250 à temperatura ambiente. Faça todas as incubações sob agitação constante. </li><li> Transferir o gel para a solução de fixação contendo 40% de metanol e 10% ácido acético durante 30 min. </li><li> Trocar o tampão de solução de descoloração (25% de etanol e ácido acético a 8%) e incubar durante 5 min. </li><li> Corar o gel com 0,2% de Coomassie Brillant Blue G-250 em 40% de metanol e 10% ácido acético durante 1 hora. </li><li> Destain o gel com a solução de descoloração e trocar o tampão depois de 10 min, 30 min e 60 min. </li><li> Armazenar o gel em 25% de etanol, ácido acético a 8%, e 4% de glicerol, a 4 ° C. </li&gt; <li> Realizar imagem e análise, como descrito em 4.2.8. </li></ol></li></ol> 5. Análise de Oligomeric Unidos da Pattern Recognition Receptores <ol><li> PAGE nativo <ol><li> Preparar 50 ug de lisado de células, num volume final de 10 ul com tampão de PBS e adicionar 5 × nativa amostra (250 mM Tris-HCl pH 6,8, desoxicolato de sódio a 1%, 50% de glicerol, 0,5% de azul de bromofenol) para uma concentração final de 1x. </li><li> Coloque as amostras imediatamente sobre um gel de poliacrilamida nativa, com 5% de empilhamento e 8% como resolver gel. Qualquer atraso irá resultar numa perda de 34 complexos nativos. </li><li> Submeter o gel a 20 mA por gel a 4 ° C com 50 mM de Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM de glicina como como ânodo e 50 mM Tris pH 8,3, glicina 384 mM, 1% de desoxicolato de sódio, como tampão de cátodo. Após 1,5-2 h (azul de bromofenol banda deixou o gel cerca de 45 min antes) a eletroforese é concluída. </li></ol></li><li> Western Blotting <ol><li> Activar um polyvinylidene fluoreto (PVDF) de membrana durante 30 segundos com metanol e colocá-la em tampão Towbin (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% de SDS, 20% metanol). </li><li> Montar uma câmara mancha húmida de acordo com as instruções do fabricante e encher o tanque com tampão Towin. </li><li> Realizar o blotting com 250 mA durante 1,5 horas a 4 ° C. </li><li> Ao borrar está terminado proceda conforme descrito a partir de 4.2.3 diante. </li></ol></li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Sentindo a presença de vírus e ativação do tipo I IFN antiviral sistema são cruciais para a resposta imune inata de sucesso 22. A detecção de vírus é assim mediada por receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs) como RIG-I e PKR, permitindo uma resposta rápida e ativação de mecanismos de defesa anti-virais. Aqui, descrevemos dois métodos para avaliar diretamente o status de ativação de RIG-I e PKR. Digestão protease limitada como uma ferramenta para monitorar...

Um acontecimento importante na defesa do hospedeiro antiviral é a detecção rápida do agente patogénico pelos chamados receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) 1,2. Detecção intracelular de infecção por vírus de ARN é dependente de dois helicases de ARN citoplasmáticos, RIG-I (ácido retinóico gene indutível I) e MDA5 (diferenciação associado a melanoma de proteína 5) 3-5. RIG-I é composto por dois domínios N-terminais de recrutamento de caspase (cartões), um tipo de caixa de DECH-domínio RNA helicase central, e um domínio C-terminal (CTD) 4,6. Considerando que a CTD eo domínio helicase são necessários para o reconhecimento da não-auto (virais) RNAs, os cartões mediar sinalização a jusante levando ao estabelecimento de um estado anfitrião antiviral. Se RIG-I está no estado de silêncio, isto é, na ausência de um ligando de ARN específico, a segunda placa interage com o domínio da helicase central e mantém RIG-I numa conformação auto-inibidora 7-11. RIG-I liga-se a curto duploARN de cadeia (ds) contendo um 5&#39;-trifosfato (5&#39;PPP), dsRNA longo, e RNA PolyU / UC-rico, estruturas clássicas de assinatura que estão presentes nos genomas de muitos vírus de ARN de 12-16. Duas características principais de ativação RIG-I é uma mudança para uma conformação fechada 6,17 eo homo-oligomerização 6,18,19. A mudança conformacional aumenta a ligação do RNA, expõe os cartões para sinalização a jusante, e reconstitui um site ATPase ativa 8,9,11,20. A formação de complexos oligoméricos RIG-I conduz a uma melhor recrutamento de moléculas adaptadoras de sinalização a jusante de modo a formar uma plataforma para a transdução de sinal antiviral 11. A cadeia de sinalização RIG-I-regulada, eventualmente, ativa o fator de transcrição IRF-3 para o aumento da regulação do interferon (IFN-alpha/beta) genes e, portanto, a expressão gênica de genes interferon estimulada (ISGs) por uma resposta antiviral completo 21,22 . Um dos ISGs melhor caracterizada é a protei activado ARNn quinase (PKR) 23. PKR pertence à família do factor de iniciação da tradução eucariótica 2 alfa (eIF2α) quinases e é composta de um domínio de cadeia dupla de RNA de ligação N-terminal e um domínio de cinase de terminal-C. O domínio cinase constitui a interface de dimerização crucial para a activação PKR e realiza as funções catalíticas da proteína. A ligação de PKR para dsRNA viral leva à sua alteração conformacional que permite a dimerização e auto-fosforilação em Thr 446 entre outros resíduos. PKR então medeia fosforilação de eIF2α, bloqueando assim a tradução de mRNAs viral 23-27. Ambos RIG-I e PKR sofrer grandes rearranjos estruturais, formam complexos oligoméricas e são modificada após a tradução por fosforilação / desfosforilação e ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. Para uma melhor compreensão do que as estruturas do RNA viral está ativando RIG-I e PKR (e em que estágio antagonistas virais poderia be interferindo), é importante para determinar com precisão o estado de activação. Para ambos os PRRs foi previamente descrito que a activação conduz ao aparecimento de fragmentos de proteína de tripsina-resistente 6,17,30 e oligómeros de ordem superior 6,18,19. No entanto, dada a riqueza da literatura sobre esses fatores-chave da resposta do hospedeiro antiviral 1,2,24, a aplicação de métodos diretos parece comparativamente raros. Na esperança de estimular o uso mais amplo, nós fornecemos protocolos convenientes e sensíveis para analisar de forma robusta os estados de ativação de RIG-I e PKR. O IFN competente linha celular humana A549 está infectado com um ativador estabelecido de RIG-I e PKR, o atenuado vírus da febre do Vale do Rift clone mutante 13 (Cl 13) 31,32. Depois de um procedimento de lise simples, os extratos de células infectadas são testados por tripsina digestão / western blot limitado para avaliar mudança conformacional, e pelo azul de eletroforese em gel de poliacrilamida nativa (PAGE) / analys Western bloté medir a formação de oligômeros.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

Defesas do hospedeiro à infecção do vírus são dependentes de uma rápida detecção pelos receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) do sistema imune inato. No citoplasma, PRRS RIG-I e PKR de ligação a ligandos específicos de RNA viral. Esta primeira medeia comutação conformacional e oligomerização, e, em seguida, permite a ativação de uma resposta interferon antiviral. Embora os métodos para medir a expressão do gene antiviral acolhimento estão bem estabelecidos, os métodos para monitorar diretamente os estados de ativação de RIG-I e PKR são apenas parcialmente e menos bem estabelecida. Aqui, descrevemos dois métodos para monitorar estimulação RIG-I e PKR sobre a infecção com um indutor interferon estabelecido, o vírus da febre do Vale do Rift clone mutante 13 (Cl 13). Digestão de tripsina limitada permite analisar as alterações na sensibilidade da protease, indicando alterações de conformação de PRRS. Digestão de tripsina de lisados ​​de simulações de células infectadas resulta em uma rápida degradação da RIG-I e PKR, whereainfecção s Cl 13 leva ao surgimento de um RIG-I fragmento resistente à protease. Também PKR mostra uma resistência parcial induzida por vírus para a digestão com tripsina, o qual coincide com a sua fosforilação marca em Thr 446. A formação de RIG-I e oligómeros PKR foi validado por electroforese em gel de poliacrilamida nativo (PAGE). Após a infecção, há um forte acumulação de RIG-I e complexos oligoméricos PKR, que estas proteínas permaneceram como monómeros em amostras infectadas simuladas. Digestão protease limitada e PAGE nativa, ambos acoplados a análise western blot, permitir uma medição sensível e direta de dois diferentes etapas do RIG-I e ativação PKR. Estas técnicas são relativamente fácil e rápido de executar e não requer equipamento caro.

O reconhecimento de um agonista viral por RIG-I ou PKR desencadeia mudança conformacional 6,17,30 e oligomerização 6,18,27. Analisamos estes dois marcadores de activação por digestão com protease limitado e electroforese em gel de poliacrilamida nativo (PAGE), respectivamente. As células A549 humanas infectadas com o clone de vírus da febre do vale do Rift 13 (Cl 13), que é caracterizada por uma mutação do antagonista de IFN NSS 35,36. Devido à au...

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Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Defesas inata de infecções por vírus são acionados por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Os dois PRRs citoplasmáticos RIG-I e PKR ligam para RNAs virais de assinatura, mudança de conformação, oligomerizar e ativar sinalização antiviral. São descritos métodos que permitem monitorizar convenientemente a comutação conformacional e a oligomerização destes PRRs citoplasmáticos.

Monitoramento de ativação do Padrão Antiviral Reconhecimento Receptores RIG-I e PKR por limitada Protease Digestão e PAGE nativo

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K visualizações.  Philipps-University Marburg.  Defesas inata de infecções por vírus são acionados por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Os dois PRRs citoplasmáticos RIG-I e PKR ligam para RNAs virais de assinatura, mudança de conformação, oligomerizar e ativar sinalização antiviral. São descritos métodos que permitem monitorizar convenientemente a comutação conformacional e a oligomerização destes PRRs citoplasmáticos. 

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Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In genetically predisposed individuals, tTG2 triggers autoimmune responses that are characterized by the production of tTG2 antibodies and their direct deposition into small intestinal wall 1,2. The presence of such antibodies constitutes one of the major hallmarks of the celiac disease (CD). Epidermal transglutaminase (eTG) is another member of the transglutaminase family that can also function as an autoantigen in a small minority of CD patients. In these relatively rare cases, eTG triggers an autoimmune reaction (a skin rash) clinically known as dermatitis herpetiformis (DH). Although the exact mechanism of CD and DH pathogenesis is not well understood, it is known that tTG2 and eTG share antigenic epitopes that can be recognized by serum antibodies from both CD and DH patients 3,4.
In this study, the confocal microscopy examination of biopsy samples from skin lesions of two rhesus macaques (Macaca mulatta) with dermatitis (Table 1, Fig. 1 and 2) was used to study the affected tissues. In one animal (EM96) a spectral overlap of IgA and tTG2 antibodies (Fig. 3) was demonstrated. The presence of double-positive tTG2+IgA+ cells was focused in the deep epidermis, around the dermal papillae. This is consistent with lesions described in DH patients 3. When EM96 was placed on a gluten-free diet, the dermatitis, as well as tTG2+IgA+ deposits disappeared and were no longer detectable (Figs. 1-3). Dermatitis reappeared however, based on re-introduction of dietary gluten in EM96 (not shown). In other macaques including animal with unrelated dermatitis, the tTG2+IgA+ deposits were not detected. Gluten-free diet-dependent remission of dermatitis in EM96 together with presence of tTG2+IgA+ cells in its skin suggest an autoimmune, DH-like mechanism for the development of this condition. This is the first report of DH-like dermatitis in any non-human primate.

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) is a chronic inflammatory condition characterized by an autoimmune reaction between IgA and epidermal transglutaminase (eTG). DH develops in a very small portion of gluten-sensitive and/or celiac patients. The results of this study indicate that DH can also develop in a rhesus monkey host with symptoms of idiopatic dermatitis.

Reconhecimento da transglutaminase epidérmica por 2 Anticorpos IgA transglutaminase tecidular e em um caso raro de Rhesus Dermatite

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Imunologia e Infecção

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Imunofluorescência para monitorar a Incorporação celular de lactoferrina humana e sua Associated atividade antiviral contra o vírus da hepatite C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

No início virais Ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Gerando<em&gt; De Novo</em&gt; Antígeno-específica T Humano receptores celulares por Transdução retroviral de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-imunoprecipitação ensaio para estudar interações funcionais entre receptores e enzimas

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Imagem latente confocal de RNA Double-Stranded e receptores de reconhecimento padrão na infecção pelo vírus de RNA de sentido negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Processamento de imagem protocolo para análise de difusão e o tamanho do Cluster de receptores de membrana por microscopia de fluorescência

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...