Este trabajo fue apoyado por el proyecto VENOMICS, subvención para el proyecto europeo N ° 278.346 a través del Séptimo Programa Marco (7PM SALUD 2011-2015). El proyecto VENOMICS es una colaboración entre varias instituciones de investigación y empresas en Europa: AFMB, Aix-Marseille Université (Francia), CEA Saclay (Francia), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (España), la Universidad de Lieja (Bélgica), VenomeTech (Francia), Vitamib (Francia), Zealand Pharma (Dinamarca) Este trabajo fue apoyado por la infraestructura francesa de Biología Integrada Estructural (Frisbi) ANR-10-INSB-05-01. Los autores también quisiera dar las gracias al Sr. Jeremy Turchetto para ayudar con los preparativos para el rodaje del video.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

No existe un protocolo único y universal para la expresión de doblado, proteínas solubles, funcionales. Para ser costo y eficiente en el tiempo, la mayoría de los laboratorios o instalaciones centrales de proteínas que trabajan con múltiples objetivos, por tanto, utilizan la expresión de proteínas de alto rendimiento de detección para encontrar la mejor combinación &quot;genérico&quot; de las variables para obtener una proteína activa soluble en la mayoría de los objetivos. Hemos identificado DsbC como una pareja de fusión de aplicación general para la expresión soluble de péptidos y proteínas 11 disulfuro-rica. El uso de fusiones de DsbC y métodos de alto rendimiento, dentro de una semana la expresión soluble de múltiples objetivos se puede observar 11 y luego variables adicionales, tales como los discutidos en la introducción, se puede cribar en rondas posteriores en aquellos objetivos que requieren una mayor optimización. Los protocolos que se describen en este documento tienen como objetivo la expresión de las proteínas y péptidos disulfuro ricos. Sin embargo, para los usuarios que deseen expproteínas no reticuladas ress en un alto rendimiento, los protocolos correspondientes han sido publicados anteriormente y se pueden encontrar en otras partes 22,24. La configuración de alto rendimiento es ideal para una serie de aplicaciones, incluyendo la detección de un gran número de diferentes proteínas para la expresión soluble o el cribado de un gran número de construcciones de expresión (incluyendo etiquetas de fusión diferentes) para varios genes diana al mismo tiempo ( o expresión múltiple construye para un solo objetivo) con el fin de mejorar las tasas de éxito. La plataforma también se puede utilizar para la evaluación comparativa y la validación de nuevos protocolos en un gran número de objetivos. Otras aplicaciones incluyen la detección de variantes de un único objetivo difícil, por ejemplo, todos los ortólogos o miembros de la misma familia, o para comprobar el éxito de la producción de un panel de mutantes de un solo objetivo en un experimento. Este protocolo también se ha utilizado en combinación con vectores co-expresión (WITh una proteína marcada solamente) para permitir que el telecine y caracterización preliminar de los complejos de proteína-proteína, seguido de análisis biofísico más a fondo para confirmar la formación de complejos y la estequiometría correcta 33. La cantidad de proteína purificada a veces es conveniente para los micro-ensayos (pruebas funcionales, las proteínas de ADN 34 o ensayos de interacción proteína-proteína). Hay varias ventajas de la estrategia de cribado de alto rendimiento de expresión: (i) la capacidad de probar un gran número de objetivos o un gran número de variables en un solo experimento, (ii) limitada variación de lote a lote, (iii) la la sencillez y la facilidad de trabajar en una escala más pequeña usando pozos profundos, (iv) la escalabilidad y la reproducibilidad en mayor escala, (v) la posibilidad de automatización, y (vi) la simplicidad de seguimiento y manipulación (no etiquetado de tubos individuales, menos errores introducidos cuando se utiliza el formato de placa que con la manipulación de tubos individuales en la mezcla o intercambio de clones). <pclase = &quot;jove_content&quot;&gt; Aunque no se discute en la sección de protocolo, hay varias consideraciones importantes para la preparación del experimento que se discutirá brevemente a continuación. Para una discusión más detallada, por favor consulte nuestra publicación anterior 24. Para una máxima eficiencia, es beneficioso contar con un sistema adecuado para la clonación de alto rendimiento, para simplificar la sub-clonación de un gran número de objetivos. Para la fase inicial del proyecto VENOMICS, utilizamos el sistema de recombinación de puerta de enlace 25 versátil que permite la subclonación en cualquier vector de destino a un ritmo de cientos de clones por semana. Protocolos del Gateway clonación de recombinación se pueden encontrar en el sitio web de Invitrogen. Otras alternativas para la clonación de alto rendimiento incluyen la ligadura independiente clonación (LIC) 35,36 y la restricción (SR) clonar 37. Hay varias formas de obtener los genes diana para la expresión, incluso mediante PCR a partir de ADN molde, de colecciones de clones de entrada o comogenes sintéticos, lo cual es la estrategia elegida para el proyecto VENOMICS. Los genes sintéticos se pueden pedir con sitios de recombinación en cada extremo del gen y el gen de la síntesis permite la optimización de codones fácil de la secuencia de gen diana (para excluir codones raros de E. coli). Esto es recomendable pero no esencial. Para objetivos sin optimización de codones que contienen un alto número de codones raros, Rosetta 2 (DE3) pLysS (que lleva ARNt para codones raros que no son altamente expresado en E. coli) puede ser más adecuado que BL21 (DE3) pLysS. Mientras que hay cepas disponibles que limitan la reducción de los enlaces disulfuro en el medio ambiente normalmente de reducir el citoplasma, en nuestras manos no han tenido tanto éxito como E. regulares coli cepas 11. Purificación por afinidad escala analítica se lleva a cabo a partir de los cultivos de expresión de prueba con el fin de recuperar las proteínas de fusión solubles y cuantificar los rendimientos. Los datos cuantitativos se pueden obtener en el the rendimientos solubles de las proteínas de fusión expresadas dentro de un rango de 0,1 - 100 mg / l de cultivo. Si un objetivo no es soluble, de expresión y de inducción temperaturas, tensiones o medios alternativos pueden ser probados antes se persiguen diferentes parejas de fusión. Para la expresión de las proteínas solubles en disulfuro-rica, que previamente clasificado como el efecto de las parejas de fusión como DsbC&gt; DsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; Su-etiqueta para la expresión citoplasmática 11. Expresión periplásmica es otra posibilidad que puede ayudar al plegamiento éxito de los objetivos de disulfuro-rica. El periplasma es un ambiente menos reductor que contiene el citoplasma y chaperonas redox útiles para ayudar a la unión disulfuro. DsbC, DsbA, y MBP proteínas están normalmente localizados en el periplasma por sus secuencias señal periplásmicas. Esto proporciona la oportunidad de explotar estas etiquetas para dirigir los objetivos de disulfuro-rica al espacio periplásmico con el fin de ayudar a plegado. Para blancos intratables, el siguiente paso sería purify el objetivo marcado con His insoluble de cuerpos de inclusión, solubilizar y replegar (esto está fuera del alcance de este protocolo y no se discutirá aquí 3 9). Esto puede ser bastante simple para objetivos con sólo uno o dos enlaces disulfuro, pero se vuelve cada vez más difícil, ya que el número de enlaces disulfuro se incrementa. Alternativamente, y particularmente para las proteínas y péptidos con cuatro o más enlaces de disulfuro, puede ser beneficioso para tratar sistemas de producción más complejas, tales como levadura, de insecto o de expresión de mamífero. Con los avances en la miniaturización y automatización, las tecnologías de la electrofisiología HTP lab-on-a-chip 28, sin duda, ser el camino del futuro para los análisis funcionales. Prevemos que para la mayoría de propósitos (quizás con la excepción de los estudios estructurales) esto negar la necesidad de cultivos a gran escala. Culturas a pequeña escala no sólo serán útiles para las condiciones de expresión de cribado, sino también ser capaz de proporcionar suficientes cantidades de muestra para estos ensayos funcionales miniaturizados. La capacidad para producir múltiples objetivos en paralelo en cantidades suficientes para la caracterización funcional reducirá los costes de cultivo y el uso de este tipo de plataformas, expresión y caracterización de las proteínas recombinantes se harán más costo y el tiempo-efectiva. Los protocolos de la presente memoria se han aplicado a la expresión de péptidos y proteínas disulfuro-rica en la fase inicial del proyecto 7PM VENOMICS Europea. Venenos son una excelente fuente de péptidos bioactivos que a menudo tienen un interesante potencial farmacológico. Sin embargo, su producción es un reto debido a sus patrones de disulfuro de unión complejas y tamaño pequeño. El uso de plataformas de alto rendimiento como el descrito en el presente documento, el proyecto VENOMICS tiene como objetivo generar una biblioteca de 10.000 nuevos péptidos de veneno de reproducir la diversidad observada en la naturaleza. Esta biblioteca será explotado para la caracterización de disulfuro-rpéptidos ich con farmacológica potencial o aplicaciones terapéuticas con el objetivo de desarrollar nuevos fármacos. La plataforma se está utilizando actualmente para la evaluación comparativa y la validación de nuevos protocolos para su uso en el proyecto VENOMICS.

Motivado por el avance de la genómica y la acelerada tasa de descubrimiento de nuevas proteínas, las tuberías de alto rendimiento han sido desarrollados para paralelizar los enfoques tradicionales para la detección e identificación de estrategias óptimas de producción de proteínas. Variables de potencial para ser optimizados incluyen, pero no se limitan a, diferentes cepas de expresión de 1,2, temperatura de 3,4, 2,3 medios de comunicación, objetivo variantes de 5, parejas de fusión 6-13, co-expresión con chaperonas 14,15, citoplásmica o expresión de 16-18, y de amortiguamiento de purificación componentes periplásmicos 3. Mediante la implementación de enfoques de rendimiento altos, muchas variables o muchos objetivos pueden ser probados en paralelo con un alto nivel de eficiencia, al tiempo que limita la variación de lote a lote. En nuestra experiencia, la estrategia también da una buena reproducibilidad en ampliación con el mismo cultivo (temperatura, medios de comunicación, la aireación, etc) y las condiciones de purificación (misma resiN, tampones, etc). Varias plataformas de alto rendimiento se han utilizado en la década pasada para identificar las condiciones para la expresión de proteína soluble, a saber, a través de diferentes parámetros tales como compañeros de fusión, las cepas de expresión o temperatura de 19-23. Hemos utilizado recientemente nuestro enfoque de selección de alto rendimiento para la expresión de proteínas disulfuro ricos solubles 11. Las proteínas seleccionadas no eran sólo de fuentes venenosas, pero también incluían inhibidores de la enzima disulfuro ricos de una amplia gama de especies, incluyendo plantas, cerdos, vacas y seres humanos. El experimento comparó los efectos de 12 parejas de fusión diferentes y tres cepas de expresión diferentes en la solubilidad y el plegamiento de 28 proteínas disulfuro-reticulada. Hemos demostrado que el uso de DsbC como pareja de fusión para la producción en la cepa BL21 (DE3) pLysS enormemente outproduced (en tanto el rendimiento y el número de proteínas solubles obtenidos) cualquier otra combinación de cepa y la fusión prueba 11. Laresultados de este experimento formaron la base para la adaptación de nuestra tubería original, en general de alto rendimiento (que se ha utilizado para el cribado de expresión de una amplia gama de proteínas) 22,24 en uno más adecuado para la expresión de los objetivos de disulfuro-rica. Proteínas disulfuro ricos procedentes de venenos de animales son de particular interés. Venenos son una mezcla compleja de péptidos y proteínas bioactivos, con valor potencial farmacológicamente y terapéuticamente. Sin embargo, la expresión de proteínas que contienen enlaces disulfuro-no es trivial. Estas proteínas contienen generalmente de uno a siete enlaces disulfuro, y deben ser oxidados con los patrones de disulfuro de unión correctas con el fin de ser activo. Actualmente, la plataforma se está utilizando para la detección de la expresión de un gran número de proteínas de veneno de animales disulfuro-rica como parte del Proyecto VENOMICS Europea 7PM (www.venomics.eu) y la evaluación comparativa de nuevos protocolos para la expresión de alto rendimiento de miles de objetivos . Aquí, un método automatizadose proporciona para la detección de la expresión a pequeña escala de alto rendimiento y purificación (véase la figura 1) aplicada al disulfuro de proteínas ricas en veneno de animales. La estrategia para disulfuro péptidos y proteínas ricas utiliza una etiqueta de His para la purificación y la pareja de fusión redox-activo, DsbC, creando escindibles fusiones SU-DsbC para las proteínas diana (véase la Figura 2). Aunque el foco de los protocolos en el presente documento es la automatización usando un robot de manejo de HTP y electroforesis líquido, estos métodos también son adecuados para un enfoque manual de alto rendimiento, lo que significa que incluso laboratorios con una configuración básica pueden tomar ventaja de los protocolos sin ningún requisito previo para un equipo costoso . Protocolos manuales para la transformación de la purificación y análisis (no específica a las proteínas disulfuro ricos) han sido publicados en otra parte 24 y no se repetirán aquí. El rendimiento del procedimiento manual (del clon de expresión, producido por recombinaciónclonación nacional 25, para análisis de los niveles de proteínas solubles) es 96 (usando la detección de SDS-PAGE) o 384 (4 x 96; utilizando dot blot y SDS-PAGE 26) los cultivos por semana (véase la Figura 1). Esto se puede aumentar si se realiza de una manera semi-automatizado (usando un robot de manejo de líquidos y de transferencia de puntos o electroforesis HTP 26, tal como con un sistema de pinza de GXII LabChip 22 para el análisis de resultados) a un máximo de 1152 (12 x 96) culturas en paralelo más de una semana, tal como se describe en este documento. El cultivo se realiza en pozo profundo 24 Formato (DW24) de manera que las incubadoras temblorosas regulares se pueden usar en contraste con las culturas que crecen en el pozo profundo formato 96 (DW96), que requieren el uso de cortas incubadoras temblorosas alta velocidad orbital para una aireación suficiente (sacudidas a 800 rpm). El uso de los medios de auto-inducción 27 también simplifica la expresión, la eliminación de la etapa de inducción manual. Incluso cuando los laboratorios ya utilizan la expresión y puri predefinidocondiciones ficación, estos pueden ser transferidos directamente en este sistema HTP simplemente para mejorar la eficiencia. Un esquema detallado de la tubería de selección de alto rendimiento para las proteínas disulfuro ricos se proporciona en la Figura 3. Los parámetros de la tubería fueron seleccionados sobre la base de extensos experimentos de cribado 11, 22, lo que nos permitió elegir las condiciones más útiles para la producción de proteínas. Caracterización se puede realizar en las proteínas etiquetadas purificados directamente de expresiones de pequeña escala en los estudios piloto en los que decenas de microgramos de muestra es suficiente, o para ensayos funcionales sensibles y ensayos de unión (por ejemplo, sistemas de bajo volumen de patch clamp HTP 28). Lo mismo incluso se pueden realizar en los objetivos no etiquetadas después de la escisión, siempre la etiqueta y la proteasa se eliminan (por ejemplo, mediante HPLC en fase inversa). El control de calidad también se puede realizar por espectrometría de masas (para confirmar el tamaño esperado y la oxidación Stcomieron) o métodos cromatográficos (para confirmar la pureza o la heterogeneidad) 29. A veces señal de corte es innecesario o incluso indeseable (en particular para las proteínas poco solubles 30,31), lo que en este clivaje protocolo es opcional. Independientemente, en todas las construcciones hay un sitio de escisión de proteasa TEV (ENLYFQ / [G] 32) que precede directamente el gen diana para producir proteína nativa después de la escisión (véase la Figura 2 y Discusión). Si se desea la escisión de la etiqueta de la fusión, la escisión se puede probar (en la fracción de elución o &#39;de la columna&#39;) en la pequeña escala para analizar la eficiencia, optimizar las condiciones en caso necesario y obtener estimaciones fiables de los rendimientos de los experimentos posteriores de escalado. Hay dos opciones para el volumen de los granos utilizados durante la purificación por afinidad, dependiendo de los objetivos y expectativas del experimento. Para poder captar la mayor cantidad de proteínas de lo posible (para purificar para ensayos piloto o MS o para EXTRAPOLcomió para los rendimientos de escala-hasta) un volumen final de 200 l de resina se debe utilizar, que permite la detección de la proteína soluble en el intervalo de 1-100 mg / l de cultivo antes de la saturación del sistema (véase el protocolo (A) en la Sección 8.1) . Sin embargo, si el objetivo del experimento es la detección de bajas cantidades de proteínas solubles entonces un volumen final de 50 l de resina es adecuado, que permite la detección de la proteína soluble en el intervalo de 0,1-25 mg / l de cultivo (véase el protocolo (B ) en la sección 8.2). La producción puede ser ampliado, si es necesario, para obtener cantidades de miligramos de objetivos purificadas para estudios adicionales estructurales y funcionales utilizando las condiciones identificadas para la expresión soluble. Los detalles de los protocolos de escala-up utilizadas en AFMB se han discutido en otra parte 22,24. Más detalles de interés para el montaje experimental, los pasos críticos en el protocolo, modificaciones y resolución de problemas y limitaciones de la técnica se proporcionan en el discoussion. Por favor, lea la discusión antes de comenzar los experimentos. A través de los protocolos que esperamos una tasa de éxito del 90% en cada paso (por ejemplo, al menos el 90% de los cultivos debe crecer en cualquier paso dado). Si la tasa de éxito de cualquier paso en el experimento cae por debajo del 90% de las muestras se descartan y el experimento se repite para la colección completa de las construcciones. Sin embargo, esta tasa de éxito no es aplicable al número de constructos que expresan proteínas solubles o como la proporción de construcciones que escinden con una eficiencia del 100%, ya que este será altamente dependiente de las proteínas de la prueba. Los detalles específicos para la puesta en marcha de la mesa de trabajo del robot se proporcionan para cada protocolo (véase también la Figura 4), ​​sin embargo se pueden adaptar según sea necesario para la mesa de trabajo alternativa set-ups. El hardware del robot (Tecan) consiste en un brazo de 96 multicanal (MCA96), manipulador robótico (Roma) y el jefe de manejo de líquidos de 8 canales (LiHa). Todos los pasos que utilizan el MCA96 también se pueden realizar usando el LiHa si un MCA96 no está disponible, sin embargo, se necesitará más tiempo debido a que el LiHa tendrá que ser lavados entre los pasos. Mientras que el robot no es técnicamente un entorno estéril, la inclusión de antibióticos en general, se asegura de que no hay problemas con la contaminación o la esterilidad.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&#38;ID=5270&#38;Menu=1&#38;Item=21.1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR (PCR96) plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>652270</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 &#176;C. Use a 1 in 1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>780270</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the expression of target constructs. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) pLysS competent cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or alternative E. coli expression strain of the user&#39;s choice. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathseal breathable adhesive film</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine with 96-well plate block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well sterile tissue culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662165</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l sterile disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 617</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw</td>
			<td>Infors</td>
			<td>AJ103</td>
			<td>Not essential, a regular shaking incubator can also be used. 
			http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For glycerol stocks and elution using purification protocol B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the preparation of glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 616</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape pads&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td> 
			http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactinyl</td>
			<td>Orapi Group</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent microbial disinfectant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYP-5052 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for recipes of components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7701-5102</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed, clear microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance readings. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reading spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional. For measuring OD600nm of cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with rotor for deep well plates&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for 3800 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mg/ml in water. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole ACS grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IX0005-1</td>
			<td>A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates)</td>
			<td>Misonix Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2M stock in water, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE or Caliper sample buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Receiver/Filter Plate 20 &#181;m, 1.8 ml capacity</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740686.4</td>
			<td> 
			http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable wide bore tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 050 348</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose 6 Fast Flow resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5318-02</td>
			<td>For purification of target fusion proteins. Store at 4 &#176;C. Wash and equilibrate before use. 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 0.22 &#181;m filter plate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSGV N22 10</td>
			<td>Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. 
			http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user&#8217;s discretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer and cuvettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip pipette tips</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Optional. The type of ZipTip is at the user&#39;s discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. 
			http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author&#8217;s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in e. coli

Escherichia coli (E. coli) es el sistema de expresión más ampliamente utilizado para la producción de proteínas recombinantes para estudios estructurales y funcionales. Sin embargo, la purificación de proteínas a veces es difícil, ya que muchas proteínas se expresan en una forma insoluble. Cuando se trabaja con objetivos difíciles o múltiples por lo tanto se recomienda el uso de alto rendimiento (HTP) de detección de expresión de proteínas en una escala pequeña (1-4 ml de cultivos) para identificar rápidamente las condiciones para la expresión soluble. Para hacer frente a los diversos programas de genómica estructural de laboratorio, una cuantitativa (en un rango de 0,1 a 100 mg / L de la cultura de la proteína recombinante) y protocolo de detección de expresión de proteínas HTP fue implementado y validado en los miles de proteínas. Los protocolos fueron automatizadas con el uso de un robot de manejo de líquidos, pero también se pueden realizar de forma manual sin equipo especializado. Proteínas del veneno disulfuro ricos están ganandoCada vez se reconoce por su potencial como clientes potenciales terapéuticos de la droga. Ellos pueden ser altamente potente y selectivo, pero sus complejas redes de enlace disulfuro que sean difíciles de producir. Como miembro del proyecto FP7 Venomics Europea ( <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ), nuestro reto es desarrollar estrategias de producción con éxito con el objetivo de producir miles de proteínas del veneno novedosas para la caracterización funcional. Con la ayuda de las propiedades redox del enlace disulfuro isomerasa DsbC, adaptamos nuestra línea de producción HTP para la expresión de oxidados, los péptidos del veneno funcionales en el E. citoplasma coli. Los protocolos también son aplicables a la producción de diversas proteínas disulfuro-rica. Aquí demostramos nuestra línea aplicada a la producción de proteínas del veneno animal. Con los protocolos descritos en la presente memoria es probable que las proteínas disulfuro-rica solubles se obtienen en tan poco como una semana. Incluso desde una pequeña escala, existe el potencial de utilizar ªe purificado proteínas para validar el estado de oxidación por espectrometría de masas, para la caracterización de los estudios piloto, o de micro-ensayos sensibles.

Los resultados representativos se muestran en la Figura 6 para la detección de expresión de 96 proteínas disulfuro-rica de la tubería VENOMICS. Las proteínas se disponen mediante el aumento de número de enlaces disulfuro a continuación, el aumento de número de residuos. Los péptidos se expresan en el citoplasma con una cola de His y compañero de fusión DsbC. Al utilizar las condiciones de cultivo recomendadas, una DO 600 de 12 se logra normalmente. Los péptidos se purificaron usando el protocolo 8.2-B con un volumen final de 50 l de resina de afinidad de níquel, por lo que un máximo de proteína de ~ 25 mg / L de fusión podría ser detectada en este experimento. La Figura 6A muestra el resultado de electroforesis desde el sistema de pinza de LabChip (mostrando la fusión antes de la escisión) y el sistema de puntuación basado en la extrapolación para producir en mg / l de cultivo de la proteína de fusión (en niveles de 0,1 a 2 cultura mg / L, 2 a 10 mg / l de cultivo, 10 a 25 mg / L de la cultura y sin<html> t detecte.) Tenga en cuenta que la etiqueta DsbC escinde normalmente se ejecuta en torno a 32 kDa, en lugar de 27 kDa como se esperaba. Del mismo modo, las fusiones DsbC también corren alrededor de 5 kDa más altos de lo esperado. Para muchos de los objetivos que no sólo vemos la fusión intacta (banda superior), pero también la pareja de fusión solo (banda inferior). Para algunos de estos objetivos la optimización de las condiciones de cultivo puede mejorar la relación de la fusión intacta (banda superior) en comparación con solo DsbC lo que permite un aumento de la producción final. La puntuación se basa sólo en el nivel de fusión intacta. Sólo 16 de las 96 proteínas no podrían ser detectados en el nivel de fusión. Esto corresponde a un nivel general de éxito del 83%. De los 80 proteínas que podrían ser detectados, 45 de ellos se detectaron niveles mayores que 2 mg / l de cultivo (56%). Dependiendo de objetivo y de la fusión, los rendimientos de proteínas son por lo general en el intervalo de 2-100 mg / l de cultivo (aunque en este ejemplo utilizando el protocolo 8.2 B un máximo de ~ proteína de 25 mg / L de fusión puede ser detectado). t &quot;&gt; Un análisis del éxito por número de enlaces disulfuro presentes (que se muestra en la Figura 6B) muestra el éxito razonable para todos los números de enlaces disulfuro ensayadas (entre 1 y 7), con el nivel de éxito más bajo con un 66% para los objetivos que contienen 6 disulfuro bonos. Un análisis de la distribución de la expresión de éxito basada en el punto isoeléctrico y número de residuos (que se muestra en la Figura 6C) no muestra sesgo particular para la técnica, con los dos objetivos y metas que no se detectaron dispersos por toda la parcela expresadas con éxito. La figura 6D muestra un ejemplo de los resultados de la espectrometría de masas obtenidos a partir de la espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) para un único objetivo, antes y después de la reducción de la muestra con DTT. Normalmente, no sería necesario un análisis de espectrometría de masas tales exhaustiva a realizar (no necesitaría una muestra reducida a ser analizada), sin embargo, para los propósitos de demonstratio completan hemos demostrado ambos resultados. El objetivo que se muestra es una proteína de veneno de disulfuro-rica 5,7 kDa con 4 enlaces disulfuro. El espectro de la izquierda muestra los resultados para la proteína antes de la reducción con DTT, ya que era después de la escisión y desalación sin más intervención. El espectro en el lado de la derecha muestra la proteína después de la reducción con DTT seguido de desalación para eliminar cualquier exceso de DTT. Los iones que corresponden a las masas experimentales están marcados con flechas en el espectro y la designación para cada ion se muestra en verde. Las masas de padres experimentales calculados para estos iones (para la proteína antes de la reducción (TDT) y después de la reducción (+ DTT)) se muestran en la tabla. Las masas (5709,6 Da para la muestra antes de la reducción y 5717,6 Da para la muestra reducida) presentan una diferencia de masa de 8 Da. Una diferencia de masa de 2 Da corresponde a la presencia de 1 enlace disulfuro oxidado, por lo tanto, una diferencia de masa de 8 Da indica la presencia de 4 enlaces de disulfuro (como se esperaba) enla muestra no reducida. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Representación esquemática del protocolo de detección de expresión de alto rendimiento. Usando este protocolo, 96-384 condiciones pueden ser probados por una sola persona en una semana utilizando métodos manuales, o hasta 1152 condiciones con el equipo semi-automatizado descrito. Los plásmidos de expresión se construyen utilizando una tecnología de clonación de recombinación de manera que numerosos objetivos pueden ser sub-clonaron en un momento. Una vez que las condiciones de expresión solubles han sido identificados y la escisión realizada, si se desea, la proteína puede proceder al control de calidad para comprobar la oxidación y la pureza, microassays y / o la producción a gran escala. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 2. Esquema para la clonación de recombinación universal y la construcción de diseño. De los clones entrada de destino, múltiples vectores de expresión pueden ser sub-clonaron en un único experimento de una manera el rendimiento de alta (hasta 6 x 96 clones de entrada en una semana). La proteína expresada codifica una etiqueta HIS para la purificación de afinidad de níquel. El DsbC (que carece de su secuencia de señal periplásmica para la expresión citoplásmica) pareja de fusión se utiliza para aumentar la solubilidad y / o la ayuda de plegado y correcta oxidación de la proteína diana. Tenga en cuenta que la secuencia de codificación de destino debe contener un sitio de proteasa TEV N-terminal (ENLYFQ) si se desea la señal de corte. El recuadro en la parte superior izquierda muestra la producción de los clones de entrada utilizando un vector donante y las secuencias diana, que puede ser obtenido por PCR o la síntesis de genes. Entrada clones también se pueden obtener de colecciones de clones de entrada comerciales. Múltiples sistemas de clonación de recombinación están disponibles, sin embargo, utilizamos el syste de Gatewaym, como se muestra en el esquema. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Tubería cribado de alto rendimiento para múltiples objetivos disulfuro-rica. Los objetivos se expresan inicialmente como fusiones SU-DsbC en el citoplasma de las células BL21 (DE3) pLysS de E. coli a 37/17 ° C utilizando un medio de auto-inducción (ZYP-5052). La purificación se lleva a cabo en resina de níquel seguido por la detección de construcciones solubles por electroforesis HTP (o con el punto de transferencia / SDS-PAGE). Si la primera ronda de selección de expresión no tiene éxito, se prueban las condiciones de cultivo alternativos. Si constructos producen proteínas solubles en los rendimientos suficientemente altos, microassays y control de calidad puede llevar a cabo y, en caso necesario, la producción a gran escala puede ser perseguido. Para los destinos donde los rendimientos solubles no son lo suficientemente altos, la detección de expresión puede continuar con estra alternativains y las temperaturas luego otra socios de fusión y expresión periplásmico. Los pasos opcionales se indican mediante cajas de trazos. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Configuración Robot Mesa de trabajo para la plataforma de HTP. Se muestra el diseño de nuestro manejo robot mesa de trabajo líquido, a pesar de las mesas de trabajo alternativos también pueden ser utilizados siempre hay sitios equivalentes disponibles. La instalación consta de una estación de lavado (WS) para el (la cabeza de 8 canales de manejo de líquidos (LiHa)), dos soportes para microplacas con 4 posiciones cada uno (MP4, las posiciones 1-4 y 5-8), una estación de vacío con 2 posiciones (Te-VACS, las posiciones 9 y 10), un portador de microplacas con 3 posiciones (MP3, posiciones 11-13), dos agitadores de la placa con 2 posiciones cada uno (Te-Shaker, posiciones 14-15 y 16-17) y un vehículo para puntas desechables con 3 posiciones (DITI, las posiciones 18 a 20). Además, lare son dos portadores de hoteles para placas de pocillos profundos y uno para microplacas (no mostrado). El hardware instalado en el robot de manejo de líquidos es un brazo de 96 multicanal (MCA96) para puntas desechables, un niño de 8-canal de la cabeza de tratamiento de líquidos (LiHa) con puntas fijas y un manipulador robótico (Roma) que mueve las placas / equipos en torno a la mesa de trabajo. La numeración de las posiciones se hace referencia a todo el protocolo. <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Esquema para la transferencia de una sola placa de 96 pozos en cuatro placas de 24 pocillos. <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Los resultados representativos se muestran para la pantalla de expresión de 96 disulfuro-rica veneno Proproteínas. Las proteínas se expresan como fusiones HIS-DsbC en el citoplasma y se purificó utilizando 50 l de resina de níquel (Protocolo 8.2-B). A) Expresión de cribado resultados, que muestran gel virtual y de puntuación para el rendimiento de expresión. El contraste en el gel virtual se ha ajustado-lane-al carril para compensar bandas muy tenues o intensos. Tenga en cuenta que para algunos objetivos dos bandas se pueden ver, la banda superior correspondiente a la proteína de fusión intacta y la banda inferior correspondiente a la etiqueta de fusión solo. B) La proporción de proteínas expresadas en cada nivel de expresión en comparación con el número de enlaces disulfuro en la proteína. El número real de proteínas en cada grupo se superpone en el gráfico. C) La distribución de los niveles de expresión basado en el punto isoeléctrico (pI) y el número de residuos. D) Un ejemplo de los resultados de la espectrometría de masas para un disulfuro-rica veneno de 5,7 kDa proteína con 4 enlaces disulfuro. El espectro enel lado izquierdo muestra la proteína antes de la reducción con DTT y el espectro en el lado de la derecha muestra la proteína reducida con DTT y luego se desaló. Los iones correspondientes a las masas experimentales están marcados con flechas y sus asignaciones se muestran en verde. Las masas experimentales para la proteína antes de la reducción y después de la reducción se muestran en la tabla y muestran una diferencia de masa de 8 Da, que corresponde a la presencia de proteína oxidada antes de la adición del agente reductor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Receta </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 ml 10 g de triptona 5 g de extracto de levadura 925 ml de agua </td><td> Mezclar y esterilizar en autoclave para esterilizar. </td></tr&gt; <tr><td> 2 M MgSO4 </td><td> 100 ml 49,3 g MgSO4 · 7 H2O ~ 60 ml de agua </td><td> Revuelva hasta que se disuelva y luego en autoclave para esterilizar. </td></tr><tr><td> 50x 5052 </td><td> 1 L 250 g de glicerol 730 ml de agua 25 g de glucosa 100 g de α-lactosa </td><td> Añadir en secuencia, revuelva a fuego lento hasta que todo se disuelve entonces en autoclave para esterilizar. </td></tr><tr><td> 20x NPS </td><td> 1 L 900 ml de agua 66 g (NH 4) 2 SO 4 136 g de KH 2 PO 4 142 g de Na 2 HPO 4 </td><td> Añadir en secuencia y revuelva hasta que todo se disuelve entonces autoclave para esterilizar. </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Receta para componentes del medio ZYP-5052.

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High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Un protocolo para el cuantitativa, de alta expresión rendimiento de la detección y purificación analítico de proteínas de fusión a partir de cultivos a pequeña escala de Escherichia coli se describe y se aplica a la expresión de dianas proteicas veneno de animales disulfuro-rica.

High Throughput Screening Expresión cuantitativa y Purificación Aplicada a Recombinante Disulfide ricos en proteínas del veneno Producido en<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

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High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

23.9K vistas.  Aix-Marseille Université.  Un protocolo para el cuantitativa, de alta expresión rendimiento de la detección y purificación analítico de proteínas de fusión a partir de cultivos a pequeña escala de Escherichia coli se describe y se aplica a la expresión de dianas proteicas veneno de animales disulfuro-rica. 