Este trabalho foi apoiado pelo projeto VENOMICS, Europeu N ° 278346 subvenção de projecto através do Sétimo Programa-Quadro (FP7 SAÚDE 2011-2015). O projeto VENOMICS é uma colaboração entre várias instituições de pesquisa e empresas na Europa: AFMB, Aix-Marseille Université (França), CEA Saclay (França), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (Espanha), Universidade de Liege (Bélgica), VenomeTech (França), Vitamib (França), Zealand Pharma (Dinamarca) Este trabalho foi apoiado pela infra-estrutura francês de Biologia Estrutural Integrado (Frisbi) ANR-10-InSb-05-01. Os autores também gostariam de agradecer ao Sr. Jeremy Turchetto para ajudar com os preparativos para a filmagem do vídeo.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Não existe um protocolo universal único para a expressão de dobradas, as proteínas solúveis, funcionais. Para ser eficiente em termos de custos e de tempo, a maioria dos laboratórios ou instalações de centrais de proteínas que trabalham com múltiplos alvos, portanto, usar a expressão da proteína de alta throughput screening para encontrar a melhor combinação &quot;genérico&quot; de variáveis ​​para se obter uma proteína solúvel ativo para a maioria dos alvos. Identificámos DsbC como sendo um parceiro de fusão de aplicação geral para a expressão solúvel de péptidos e proteínas 11 rico em dissulfureto. Utilizando fusões DsbC e métodos de elevada capacidade, dentro de uma semana a expressão solúvel de alvos múltiplos pode ser observado 11 e, em seguida, as variáveis ​​adicionais, tais como os discutidos na introdução, pode ser rastreada em ciclos subsequentes sobre os alvos que requerem uma maior optimização. Os protocolos aqui descritos destinam-se a expressão de proteínas e péptidos ricos em disulfureto. No entanto, para os usuários que desejam expas proteínas não-reticuladas ress em uma forma de alto rendimento, os protocolos correspondentes têm sido publicados anteriormente e pode ser encontrado em outros lugares 22,24. A instalação de alto rendimento é ideal para um número de aplicações, incluindo o rastreio de um grande número de proteínas diferentes para a expressão solúvel em água ou o rastreio de um grande número de construções de expressão (incluindo as etiquetas de fusão diferentes) para os vários genes-alvo, ao mesmo tempo ( ou expressão múltipla constrói para um único alvo), a fim de melhorar as taxas de sucesso. A plataforma também pode ser utilizada para avaliação dos desempenhos e validação de novos protocolos de um grande número de alvos. Outras aplicações incluem o rastreio de variantes de um único alvo difícil, por exemplo, todos os ortólogos ou membros da mesma família, ou para testar o sucesso da produção de um painel de mutantes de um único alvo no um experimento. Este protocolo tem também sido utilizado em combinação com a co-expressão de vectores (with uma proteína marcado apenas) para permitir que o empuxo para baixo e caracterização preliminar dos complexos proteína-proteína, seguido de análise biofísica mais minuciosa para confirmar a formação do complexo de estequiometria correcta e 33. A quantidade de proteína purificada é por vezes adequado para micro-ensaios (ensaios funcionais, proteína-ADN 34 ou ensaios de interacção proteína-proteína). Existem várias vantagens para a estratégia de expressão rastreio de alto rendimento: (i) a capacidade para testar um grande número de alvos, ou um grande número de variáveis ​​em uma única experiência, (ii) limitada de variação de lote para lote, (iii) o simplicidade e facilidade de trabalhar em uma escala menor usando poços profundos, (iv) a escalabilidade e reprodutibilidade em maior escala, (v) o potencial de automação, e (vi) a simplicidade de controle e manipulação (sem rotulagem de tubos individuais, menos os erros introduzidos quando se utiliza o formato de placa que com o tratamento de tubos individuais na mistura ou troca dos clones). <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; Embora não discutidos na secção de protocolo, há várias considerações importantes para a preparação do ensaio, que serão discutidas brevemente abaixo. Para uma discussão mais completa, por favor ver a publicação anterior 24. Para uma eficiência máxima, é vantajoso ter um sistema adequado para a clonagem de alto rendimento, para simplificar a sub-clonagem de um grande número de alvos. Para a fase inicial do projecto VENOMICS, que utilizam o sistema de recombinação versátil gateway 25, que permite a subclonagem em qualquer vector de destino a um ritmo de centenas de clones por semana. Protocolos para gateway recombinação clonagem podem ser encontradas no site da Invitrogen. Outras alternativas para alto rendimento clonagem incluem independente de ligadura de clonagem (LIC) 35,36 e sem restrição (RF) clonagem 37. Existem várias maneiras de obter os genes-alvo para a expressão, inclusive por PCR a partir de DNA modelo, a partir de coleções de clones de entrada ou comogenes sintéticos, o que é a estratégia escolhida para o projeto VENOMICS. Os genes sintéticos podem ser ordenados com locais de recombinação em cada extremidade da síntese do gene e gene permite a optimização de codões fácil da sequência do gene alvo (a excluir codões raros E. coli). Isto é recomendado, mas não essencial. Para objectivos de optimização sem codão que contêm um elevado número de codões raros, 2 Rosetta (DE3) pLysS (o qual transporta para tRNAs raros codões que não são altamente expressas em E. coli) pode ser mais adequada do que se BL21 (DE3) pLysS. Embora existam disponíveis estirpes que limitar a redução de pontes dissulfeto no ambiente redutor normalmente do citoplasma, nas nossas mãos, não foram tão bem sucedidos como E. regulares coli 11. A purificação por afinidade escala analítica é realizada a partir das culturas de expressão de teste, a fim de recuperar as proteínas de fusão solúveis e quantificar os rendimentos. Os dados quantitativos podem ser obtidas no the rendimentos solúveis de proteínas de fusão expressas dentro de uma gama de 0,1 - 100 mg / L de cultura. Se um alvo não é solúvel, expressão e indução temperaturas, estirpes ou mídia alternativa podem ser testados antes de diferentes parceiros de fusão são perseguidos. Para a expressão solúvel de proteínas ricas em dissulfeto, que anteriormente classificou o efeito de parceiros de fusão como DsbC&gt; DsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; HIS-tag para a expressão citoplasmática 11. Expressão periplasmática é uma outra possibilidade que pode ajudar a dobragem de sucesso de alvos ricos em disulfureto. O periplasma é um ambiente menos do que a redução do citoplasma e contém chaperonas redox úteis para auxiliar a ligação dissulfureto. DsbC, DsbA, e MBP proteínas estão normalmente localizados para o periplasma por suas sequências de sinal periplásmicas. Isto proporciona a oportunidade para tirar partido destas marcas para dirigir os alvos ricos em disulfureto para o espaço periplasmático, a fim de auxiliar dobrável. Para alvos difíceis, o próximo passo seria a de purify o insolúvel alvo HIS-marcado a partir de corpos de inclusão, solubilizar e redobre (isso está fora do âmbito deste protocolo e não será discutido aqui 3 9). Isso pode ser bastante simples para alvos com apenas uma ou duas pontes dissulfeto, mas se torna cada vez mais difícil, pois o número de pontes dissulfeto aumenta. Em alternativa, e em especial para as proteínas e péptidos com quatro ou mais ligações dissulfureto, pode ser benéfico para tentar sistemas de produção mais complexos, tais como leveduras, de insectos ou de expressão de mamífero. Com os avanços na miniaturização e automação, HTP eletrofisiologia lab-on-a-chip tecnologias 28 será sem dúvida o caminho do futuro para análises funcionais. Prevemos que, para a maioria dos fins (talvez com a exceção de estudos estruturais) isso vai negar a necessidade de culturas em grande escala. Culturas em pequena escala, não só será útil para o rastreio de condições de expressão, mas também de ser capaz de fornecer sufciente quantidades de amostra para estes ensaios funcionais miniaturizados. A capacidade de produzir vários alvos em paralelo, em quantidades suficientes para a caracterização funcional irá reduzir os custos de cultura e utilizar este tipo de plataformas, expressão e caracterização de proteínas recombinantes irão tornar-se mais o custo e tempo eficaz. Os protocolos aqui foram aplicadas para a expressão de péptidos e proteínas ricas em dissulfureto na fase inicial do projecto europeu FP7 VENOMICS. Venenos são uma excelente fonte de peptídeos bioativos que muitas vezes têm potencial farmacológico interessante. No entanto, a sua produção é um desafio devido a seus padrões de dissulfeto por entrelaçamento complexos e tamanho pequeno. Usando plataformas de alto rendimento, como o aqui descrito, o projecto VENOMICS pretende gerar uma biblioteca de 10.000 novos peptídeos do veneno de reproduzir a diversidade observada na natureza. Esta biblioteca vai ser explorada para a caracterização de dissulfureto-rpeptídeos ich com potencial farmacológico ou aplicações terapêuticas com o objetivo de desenvolver novos medicamentos. A plataforma está sendo usada para aferir e validar novos protocolos para uso no projeto VENOMICS.

Motivados pelo avanço da genômica e ritmo acelerado de descoberta de novas proteínas, dutos de alto rendimento têm sido desenvolvidas para paralelizar as abordagens tradicionais para a triagem e identificação de estratégias de produção de proteína ideal. Variáveis ​​potenciais que ser optimizados incluem, mas não estão limitadas a, estirpes de expressão que varia de 1,2, 3,4 temperatura, meios de 2,3, 5-alvo variantes, 6-13, parceiros de fusão de co-expressão com o acompanhante 14,15, citoplasmática ou periplasmáticas expressão 16-18, e tampão de purificação de componentes 3. Com a implementação de abordagens de alto rendimento, muitas variáveis ​​ou muitos alvos podem ser testadas em paralelo com um alto nível de eficiência, enquanto limita a variação de lote para lote. Em nossa experiência, a estratégia também dá uma boa reprodutibilidade após scale-up usando a mesma cultura (temperatura, meios de comunicação, aeração, etc) e as condições de purificação (mesmo resin, tampões, etc). Várias plataformas de alto rendimento tem sido utilizado na última década para identificar as condições para a expressão de proteínas solúveis, isto é, através de parâmetros variáveis, tais como parceiros de fusão, as estirpes de expressão ou a temperatura 19-23. Recentemente utilizado nossa abordagem de triagem de alto rendimento para a expressão de proteínas ricas em dissulfureto solúveis 11. As proteínas foram selecionados não só a partir de fontes venenosas, mas também incluiu inibidores da enzima rica em dissulfeto de uma grande variedade de espécies, incluindo plantas, porcos, vacas e seres humanos. O ensaio comparou os efeitos de 12 parceiros de fusão diferentes e três estirpes diferentes de expressão em que a solubilidade e dobragem de 28 proteínas reticuladas por dissulfureto. Nós demonstramos que o uso DsbC como um parceiro de fusão para a produção no BL21 (DE3) pLysS vastamente outproduced (tanto em rendimento e número de proteínas solúveis obtidos) qualquer outra combinação de tensão e fusão testadas 11. Oresultados desta experiência formou a base para a adaptação a tubagem originais geral de alto rendimento (que foi utilizado para o rastreio de uma grande variedade de proteínas de expressão) 22,24 para um mais adequado para a expressão de alvos ricos em disulfureto. Proteínas ricas em dissulfureto de venenos de animais, são de particular interesse. Venenos são uma mistura complexa de peptídeos e proteínas bioativas, com valor potencial farmacologicamente e terapeuticamente. No entanto, a expressão de proteínas dissulfureto contendo ligação não é trivial. Estas proteínas contêm geralmente entre 1-7 ligações dissulfureto, e deve ser oxidado com os padrões de ligação dissulfureto-correcção, a fim de ser activo. Atualmente, a plataforma está sendo usado para o rastreio a expressão de um grande número de proteínas do veneno de animais ricos em dissulfeto, como parte do Projeto VENOMICS europeu FP7 (www.venomics.eu) e aferição de novos protocolos para a expressão de alta taxa de transferência de milhares de alvos . Aqui, um método automatizadoé fornecido para a produção elevada de pequena escala de triagem expressão e purificação (ver Figura 1) aplicado a proteínas do veneno de animais dissulfureto-rico. A estratégia para o dissulfureto péptidos e proteínas ricas utiliza uma cauda de His para purificação e o parceiro de fusão redox-activo, DsbC, criando cliváveis ​​fusões HIS-DSBC para as proteínas-alvo (ver Figura 2). Embora o foco dos protocolos aqui é automatização usando um manuseamento electroforese robô e HTP líquido, estes métodos são também adequados para uma abordagem manual de alto rendimento, o que significa que mesmo os laboratórios com uma configuração básica podem tirar vantagem dos protocolos sem qualquer pré-requisito para o equipamento caro . Protocolos manuais para a transformação para a purificação e análise (não específica a proteínas ricas em dissulfeto) ter sido publicado anteriormente 24 e não será repetida aqui. A taxa de transferência do procedimento manual (do clone de expressão, produzidos por recombinaçãoclonagem nacional 25, para análise de níveis de proteína solúvel) é de 96 (utilizando a detecção de SDS-PAGE) ou de 384 (4 x 96, utilizando dot blot e SDS-PAGE 26) culturas por semana (ver Figura 1). Este pode ser aumentado se for realizado de forma semi-automatizada (utilizando um robot de manuseamento de líquidos e dot blot 26 ou electroforese HTP, tal como com um sistema Caliper GXII LabChip 22 para análise de resultados) a até 1152 (12 x 96) culturas em paralelo mais de uma semana, tal como aqui descritos. A cultura é realizada em poço profundo 24 format (DW24) para que as incubadoras agitação regulares pode ser usado em contraste com as culturas cultivadas no poço profundo 96 format (DW96), que exigem o uso de incubadoras orbitais curtos agitação de alta velocidade para arejamento suficiente (agitação a 800 rpm). O uso de meios de auto-indução 27 também simplifica a expressão, eliminando a etapa de indução manual. Mesmo onde os laboratórios já usam expressão e puri pré-definidoficação condições, estes podem ser transferidos directamente para o sistema HTP simplesmente para melhorar a eficiência. Um esquema detalhado da alta gasoduto throughput screening para proteínas ricas em dissulfeto é fornecido na Figura 3. Os parâmetros no pipeline foram selecionados com base em extensas experiências de rastreio 11, 22, o que nos permitiu escolher as condições mais úteis para a produção de proteínas. Caracterização pode ser realizada sobre as proteínas marcadas são purificadas directamente a partir de expressões de pequena escala em estudos-piloto onde dezenas de microgramas de amostra é suficiente, ou para ensaios funcionais sensíveis e ensaios de ligação (por exemplo, sistemas de baixo volume do patch HTP braçadeira 28). O mesmo pode ainda ser realizada sobre os alvos não marcados depois da clivagem, desde que a etiqueta e a protease são removidos (por exemplo, por HPLC de fase inversa). O controle de qualidade pode também ser realizada por espectrometria de massa (para confirmar o tamanho esperado e oxidação rcomi) ou métodos cromatográficos (para confirmar a pureza ou a heterogeneidade) 29. Às vezes, marcar a clivagem é desnecessário ou até mesmo indesejável (particularmente para as proteínas pouco solúveis 30,31), por isso, esta clivagem protocolo é opcional. Independentemente disso, em todas as construções existe um sítio de clivagem de protease de TEV (ENLYFQ / [L] 32) precedendo directamente o gene alvo para a produção de proteína nativa após clivagem (ver Figura 2 e Discussão). Se a clivagem da marca de fusão é desejada, a clivagem pode ser testado (na fracção de eluição ou &#39;na coluna&#39;) em pequena escala para analisar a eficiência, a optimização das condições exigidas e, se obter estimativas fiáveis ​​de rendimentos para experiências subsequentes de aumento de escala. Há duas opções para o volume de esferas utilizadas durante a purificação por afinidade, de acordo com os objectivos e as expectativas do experimento. Para ser capaz de captar tanta proteína quanto possível (para purificar por ensaios-piloto ou MS, ou para extrapolComemos por rendimentos de aumento de escala) num volume final de 200 ul de resina deve ser utilizado, permitindo a detecção de proteína solúvel no intervalo de 1-100 mg / L de cultura antes da saturação do sistema (ver protocolo (A) no ponto 8.1) . No entanto, se o objectivo da experiência é a detecção de pequenas quantidades de proteínas solúveis, em seguida, num volume final de 50 ul de resina é adequada, permitindo a detecção de proteína solúvel no intervalo de 0,1-25 mg / l de cultura (ver protocolo (B ) na Seção 8.2). A produção pode ser aumentado, se necessário, para obter quantidades de miligrama de alvos purificadas para estudos estruturais e funcionais, utilizando as condições estabelecidas para a expressão solúvel. Os detalhes de protocolos de scale-up usados ​​no AFMB foram discutidas em outros lugares 22,24. Mais detalhes relevantes para a configuração experimental, etapas críticas no âmbito do protocolo, modificações e resolução de problemas e limitações da técnica são fornecidos no discoussion. Por favor, leia a discussão antes de iniciar os experimentos. Durante os protocolos que esperar uma taxa de sucesso de 90% em cada passo (por exemplo, pelo menos 90% das culturas devem crescer em qualquer etapa). Se a taxa de sucesso de qualquer passo na experiência cai abaixo de 90%, as amostras são descartados e a experiência é repetida para a recolha completa de construções. No entanto, esta taxa de sucesso não é aplicável ao número de construções que expressam proteínas solúveis ou como a percentagem de construções que clivam com uma eficiência de 100%, como este será altamente dependente das proteínas ensaiadas. Os detalhes específicos para o set-up da mesa de trabalho do robô são fornecidas para cada protocolo (ver também Figura 4), ​​porém eles podem ser adaptados conforme necessário para mesa de trabalho alternativa set-ups. O hardware do robô (Tecan) consiste de um braço de 96 multicanal (MCA96), manipulador robótico (Roma) e do chefe de manipulação de líquidos de 8 canais (Liha). Todos os passos que utilizam a MCA96 também pode ser realizada utilizando o LIHA se uma MCA96 não está disponível, no entanto demoram mais tempo porque a LIHA terão de ser lavadas entre as etapas. Enquanto o robô não é tecnicamente um ambiente estéril, a inclusão de antibióticos geralmente assegura que não existem problemas com a contaminação ou a esterilidade.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&#38;ID=5270&#38;Menu=1&#38;Item=21.1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR (PCR96) plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>652270</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 &#176;C. Use a 1 in 1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>780270</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the expression of target constructs. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) pLysS competent cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or alternative E. coli expression strain of the user&#39;s choice. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathseal breathable adhesive film</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine with 96-well plate block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well sterile tissue culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662165</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l sterile disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 617</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw</td>
			<td>Infors</td>
			<td>AJ103</td>
			<td>Not essential, a regular shaking incubator can also be used. 
			http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For glycerol stocks and elution using purification protocol B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the preparation of glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 616</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape pads&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td> 
			http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactinyl</td>
			<td>Orapi Group</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent microbial disinfectant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYP-5052 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for recipes of components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7701-5102</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed, clear microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance readings. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reading spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional. For measuring OD600nm of cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with rotor for deep well plates&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for 3800 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mg/ml in water. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole ACS grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IX0005-1</td>
			<td>A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates)</td>
			<td>Misonix Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2M stock in water, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE or Caliper sample buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Receiver/Filter Plate 20 &#181;m, 1.8 ml capacity</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740686.4</td>
			<td> 
			http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable wide bore tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 050 348</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose 6 Fast Flow resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5318-02</td>
			<td>For purification of target fusion proteins. Store at 4 &#176;C. Wash and equilibrate before use. 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 0.22 &#181;m filter plate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSGV N22 10</td>
			<td>Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. 
			http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user&#8217;s discretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer and cuvettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip pipette tips</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Optional. The type of ZipTip is at the user&#39;s discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. 
			http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author&#8217;s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in e. coli

Escherichia coli (E. coli) é o sistema de expressão mais amplamente utilizado para a produção de proteínas recombinantes para estudos estruturais e funcionais. No entanto, a purificação de proteínas é muitas vezes difícil uma vez que as proteínas são expressas numa forma insolúvel. Quando se trabalha com metas difíceis ou múltiplas é, portanto, recomenda-se usar alto rendimento (HTP) a expressão da proteína de triagem em pequena escala (1-4 ml culturas) para identificar rapidamente as condições para expressão solúvel. Para lidar com os vários programas de genoma estrutural do laboratório, uma quantitativa (em um intervalo de 0,1-100 mg / L cultura de proteína recombinante) e proteína HTP protocolo expressão rastreio foi implementado e validado em milhares de proteínas. Os protocolos foram automatizadas com o uso de um tratamento de robô líquido, mas também pode ser executada manualmente, sem equipamento especializado. Proteínas do veneno rico em dissulfeto estão ganhandocrescente reconhecimento por seu potencial como líderes de drogas terapêuticas. Eles podem ser altamente potente e seletivo, mas suas redes de ligação dissulfeto complexos torná-los difíceis de produzir. Como um membro do projeto FP7 Europeia Venomics ( <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ), o nosso desafio é desenvolver estratégias de produção de sucesso com o objectivo de produzir milhares de proteínas do veneno novas para a caracterização funcional. Ajudado pelas propriedades redox de ligação dissulfeto isomerase DsbC, adaptamos nossa linha de produção HTP para a expressão de oxidados, peptídeos do veneno funcionais no E. citoplasma coli. Os protocolos são também aplicáveis ​​para a produção de diversas proteínas ricas em dissulfureto. Aqui demonstramos nosso pipeline aplicada para a produção de proteínas do veneno de animais. Com os protocolos aqui descritos, é provável que as proteínas ricas em dissulfureto solúveis serão obtidos em tão pouco como uma semana. Mesmo a partir de uma pequena escala, há o potencial para usar the proteínas purificadas para validar o estado de oxidação por espectrometria de massa, para a caracterização em estudos-piloto, ou por micro-ensaios sensíveis.

Os resultados representativos são mostrados na Figura 6, para o rastreio de 96 proteínas ricas em dissulfureto do oleoduto VENOMICS expressão. As proteínas são dispostas pelo aumento do número de ligações de dissulfureto, em seguida, o aumento do número de resíduos. Os péptidos foram expressas no citoplasma com uma cauda de His e DsbC parceiro de fusão. Ao utilizar as condições de cultura recomendados, um OD 600 de 12 é normalmente conseguida. Os peptídeos foram purificados usando o protocolo 8.2-B, com um volume final de 50 ul de resina de afinidade com níquel, de modo que um máximo de ~ proteína de 25 mg / L de fusão podia ser detectado nesta experiência. A Figura 6A mostra o resultado da electroforese de o sistema Caliper LabChip (mostrando a fusão antes de clivagem) e o sistema de classificação baseado na extrapolação para se obter, em mg / L de cultura da proteína de fusão (em níveis de 0,1 a 2 mg / L de cultura, de 2 a 10 mg / L de cultura, 10 a 25 mg / L de cultura e nenhuma<html> t detectado.) Note-se que a etiqueta de DsbC clivados normalmente trabalha a cerca de 32 kDa, em vez de 27 kDa, conforme o esperado. Similarmente, as fusões DSBC também executar cerca de 5 kDa, mais elevados do que o esperado. Para muitas das metas não só ver a fusão intacta (banda superior), mas também o parceiro de fusão sozinho (banda inferior). Para alguns desses alvos optimizar as condições de cultura podem melhorar o rácio de fusão intacta (banda superior) em comparação com DsbC sozinho permitindo um aumento do rendimento final. A pontuação é baseada apenas no nível de fusão intacta. Apenas 16 dos 96 proteínas não pode ser detectada ao nível de fusão. Isto corresponde a um nível de sucesso total de 83%. Dos 80 proteínas que poderiam ser detectados, que 45 destes foram detectados em níveis superiores a 2 mg / l de cultura (56%). Dependendo do alvo e de fusão, rendimentos proteicos são geralmente na gama de 2-100 mg / L de cultura (embora, neste exemplo, usando o protocolo B, no máximo 8,2 de ~ proteína de 25 mg / L de fusão pode ser detectado). t &quot;&gt; Uma análise de sucesso por número de ligações dissulfureto presentes (como mostrado na Figura 6B) mostra sucesso razoável para todos os números de ligações dissulfureto testadas (entre 1 e 7), com o menor nível de sucesso de 66% para ser alvos contendo 6 dissulfureto títulos. uma análise da distribuição de expressão sucesso com base no ponto isoelétrico e número de resíduos (mostrado na Figura 6) mostra nenhum viés particular para a técnica, com ambos os objetivos e metas que não foram detectados espalhados por todo o enredo expressas com sucesso. A Figura 6D mostra um exemplo dos resultados obtidos por espectrometria de massa espectrometria de massa de ionização por electrospray (ESI-MS) para um único alvo, antes e depois da redução da amostra com DTT. Normalmente, este tipo de análise de espectrometria de massa exaustiva não precisa ser realizada (uma amostra reduzida não necessita de ser analisada), no entanto, para os fins de demonstratio completan temos mostrado ambos resultados. A meta apresentada é uma proteína do veneno rico em dissulfeto de 5,7 kDa, com 4 pontes dissulfeto. O espectro da esquerda mostra os resultados para a proteína antes da redução com DTT, como foi depois de clivagem e dessalinização, sem outra intervenção. O espectro do lado direito mostra a proteína depois da redução com DTT, seguido por dessalinização para remover qualquer excesso de DTT. Os íons correspondentes às massas experimentais são marcadas com setas no espectro ea designação para cada íon é mostrado em verde. As massas mãe experimentais calculados para estes iões (para a proteína antes da redução (-DTT) e após redução (+ DTT)) são mostrados na tabela. As massas (5709,6 Da para a amostra antes da redução e 5717,6 Da para a amostra reduzida) exibem uma diferença de massa de 8 Da. A diferença de massa de 2 Da corresponde à presença de uma ligação de dissulfureto oxidado, por conseguinte, uma diferença de massa de 8 Da indica a presença de 4 ligações dissulfureto (como esperado) ema amostra não reduzida. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> Representação Figura 1. Esquemática do protocolo de pesquisa de expressão de alto rendimento. Usando este protocolo, 96-384 condições podem ser testadas por uma única pessoa dentro de uma semana, utilizando métodos manuais, ou até 1152, com as condições do equipamento semi-automatizado descrito. Os plasmídeos de expressão são construídos utilizando uma tecnologia de clonagem de modo a que a recombinação numerosos alvos podem ser sub-clonados de uma só vez. Uma vez que as condições de expressão solúveis têm sido identificados e clivagem realizada, se desejado, a proteína pode proceder a um controlo de qualidade para verificar a pureza e a oxidação, microassays e / ou a produção em grande escala. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 2. Esquema de clonagem recombinacional universal e construir design. Dos clones entrada alvo, vários vetores de expressão pode ser sub-clonado em um único experimento de uma forma de alto rendimento (até 6 x 96 clones de entrada em uma semana). A proteína expressa codifica uma cauda de His para purificação de afinidade de níquel. O DsbC (sem a sua sequência de sinal para a expressão periplasmática citoplasmático) parceiro de fusão é utilizado para aumentar a solubilidade e / ou auxílio de dobragem e oxidação correctas da proteína alvo. Note-se que a sequência de codificação do alvo deve conter um sítio de protease TEV N-terminal (ENLYFQ) se tag clivagem é desejada. A inserção na parte superior esquerda mostra a produção de clones de entrada utilizando um vector dador e as sequências alvo, que pode ser obtido por PCR ou síntese de genes. Clones de entrada também podem ser obtidas a partir de colecções de clones de entrada comerciais. Vários sistemas de clonagem recombinacional estão disponíveis, no entanto, utilizar o syste gatewaym, tal como mostrado no esquema. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> Alta transferência oleoduto rastreio Figura 3. De alvos múltiplos rico em dissulfureto. Alvos são inicialmente expressos como fusões HIS-DSBC no citoplasma das células BL21 (DE3) pLysS de E. coli em 37/17 ° C utilizando um meio de auto-indução (ZYP-5052). A purificação é realizada em resina de níquel, seguido por detecção de construções solúveis por electroforese HTP (ou com dot blot / SDS-PAGE). Se a primeira rodada de expressão rastreio não for bem sucedida, as condições de cultura alternativos são julgados. Se construções produzem proteínas solúveis em altas o suficiente rendimentos, microassays e controle de qualidade pode ser realizada e, se necessário, a produção em larga escala pode ser perseguido. Para alvos onde os rendimentos solúveis não são altos o suficiente, a expressão de triagem pode continuar com stra alternativains e as temperaturas, em seguida, outros parceiros de fusão e de expressão periplasmic. Os passos opcionais são indicados por caixas tracejadas. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> Configuração Figura 4. Robô da mesa de trabalho para a plataforma HTP. A disposição do nosso líquido manuseamento robô mesa de trabalho é apresentado, apesar de mesas de trabalho alternativas também podem ser utilizadas desde há locais equivalentes disponíveis. A instalação consiste em uma estação de lavagem (WS) para o (8 canais cabeça manipulação de líquidos (liha)), dois portadores de microplacas com 4 posições cada (MP4, posições 1-4 e 5-8), uma estação de vácuo com 2 posições (Te-VAC, posições 9 e 10), um portador de microplacas com 3 posições (MP3, posições 11-13), dois shakers placa com 2 posições de cada um (Te-Shakers, posições 14-15 e 16-17) e um transportador para pontas descartáveis ​​com 3 posições (Diti, posições 18-20). Além disso, ore são dois porta do hotel para placas de poços profundos e um para microplacas (não mostrado). O hardware instalado no robô de manipulação de líquidos é um braço de 96 multicanal (MCA96) para uso com pontas descartáveis, uma cabeça de 8 canais de manipulação de líquidos (liha) com pontas fixas e um manipulador robótico (Roma) que se move placas / equipamentos em torno de a mesa de trabalho. A numeração das posições é referida em todo o protocolo. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Esquemático por transferência a partir de uma única placa de 96 poços em quatro placas de 24 poços. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Resultados representativos são mostrados para a tela de 96 rico em dissulfeto de veneno pro expressãoproteínas. As proteínas foram expressas como fusões HIS-DSBC no citoplasma e purificados utilizando 50 mL de resina de níquel (Protocolo 8.2-b). A) Expressão triagem resultados, mostrando gel virtual e marcando para o rendimento expressão. O contraste no gel virtual foi ajustado pista-a-pista para compensar bandas muito fracos ou intensos. Note-se que para alguns alvos duas bandas pode ser visto, a banda superior corresponde à proteína de fusão intacta e a banda inferior correspondente à marca de fusão por si só. B) A proporção de proteínas expressas em cada nível de expressão em comparação com o número de ligações de dissulfureto em a proteína. O número real de proteínas em cada grupo é sobreposto no gráfico. C) A distribuição dos níveis de expressão com base no ponto isoeléctrico (pi) e do número de resíduos. D) Um exemplo dos resultados de espectrometria de massa para um veneno rico em dissulfureto de 5,7 kDa proteína com 4 pontes dissulfeto. O espectro emo lado esquerdo mostra a proteína antes da redução com DTT e o espectro do lado direito mostra a proteína reduzida com DTT e depois dessalinizada. Os íons correspondentes às massas experimentais são marcadas com setas e suas atribuições são mostrados em verde. As massas experimentais para a proteína antes e após a redução da redução são mostrados na tabela e apresentam uma diferença de massa de 8 Da, correspondente à presença de proteína oxidada antes da adição do agente redutor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Receita </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 ml 10 g de triptona 5 g de extracto de levedura 925 ml de água </td><td> Misture e autoclave para esterilizar. </td></tr&gt; <tr><td> 2 M MgSO4 </td><td> 100 ml 49,3 g de MgSO 4 7H 2 O · ~ 60 ml de água </td><td> Mexa até dissolver, em seguida, autoclave para esterilizar. </td></tr><tr><td> 50x 5052 </td><td> 1 L 250 g de glicerol 730 ml de água 25 g de glucose 100 g α-lactose </td><td> Adicionar em seqüência, mexa em fogo até que todos dissolvido depois autoclave para esterilizar. </td></tr><tr><td> 20x NPS </td><td> 1 L 900 ml de água 66 g de (NH 4) 2 SO 4 136 g de KH 2 PO 4 142 g de Na 2 HPO 4 </td><td> Adicionar em seqüência e mexa até ficar tudo dissolvido depois autoclave para esterilizar. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Receita para componentes do meio ZYP-5052.

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High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Um protocolo para o, a expressão elevada rendimento quantitativo de rastreio e purificação de análise de proteínas de fusão em pequena escala a partir de culturas de Escherichia coli é descrita e aplicada para a expressão de proteínas alvo veneno animais ricos em disulfureto.

High Throughput Screening expressão quantitativa e Purificação Aplicada à recombinante Dissulfeto ricos em proteínas veneno produzido em<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

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High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

23.9K visualizações.  Aix-Marseille Université.  Um protocolo para o, a expressão elevada rendimento quantitativo de rastreio e purificação de análise de proteínas de fusão em pequena escala a partir de culturas de Escherichia coli é descrita e aplicada para a expressão de proteínas alvo veneno animais ricos em disulfureto. 