Diese Arbeit wurde von der VENOMICS Projekt, Europäische Projektzuschuss N ° 278346 über das Siebte Rahmenprogramm (RP7 GESUNDHEIT 2011-2015) unterstützt. Die VENOMICS Projekt ist eine Zusammenarbeit zwischen verschiedenen Forschungseinrichtungen und Unternehmen in Europa: AFMB, Aix-Marseille Université (Frankreich), CEA Saclay (Frankreich), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (Spanien), Universität Lüttich (Belgien), VenomeTech (Frankreich), Vitamib (Frankreich), Zealand Pharma (Dänemark) Diese Arbeit wurde von der Französisch-Infrastruktur für integrierte Strukturbiologie (FRISBI) ANR-10-InSb-05 bis 01 unterstützt. Die Autoren möchte auch Herrn Jeremy Turchetto für die Unterstützung bei den Vorbereitungen für die Dreharbeiten des Videos bedanken.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Es gibt kein einziges universelles Protokoll für die Expression von löslichen, gefalteten, funktionellen Proteinen. Um kosten-und zeiteffizient sein, die meisten Labors oder Proteinkern Einrichtungen die Arbeit mit mehreren Zielen verwenden daher einen hohen Durchsatz-Screening-Protein-Expression, um die besten &quot;Generika&quot; Kombination von Variablen, um ein lösliches aktives Protein für die Mehrheit der Ziele zu erhalten finden. Wir haben DsbC als ein allgemein anwendbares Fusionspartner für die lösliche Expression von Disulfid-reichen Peptide und Proteine ​​11 identifiziert. Verwendung DsbC Fusionen und Hochdurchsatzverfahren, innerhalb einer Woche die lösliche Expression mehrerer Ziele beobachtet werden, und dann 11 zusätzliche Variablen, wie sie in der Einleitung erwähnt, kann in nachfolgenden Runden auf die Ziele, die eine weitere Optimierung erforderlich gescreent werden. Die hier beschriebenen Protokolle werden bei der Expression von Disulfid-reiche Proteine ​​und Peptide gerichtet. Für Anwender, die expresse nicht-netzartige Proteine ​​in einem Hochdurchsatz-Art und Weise haben sich die entsprechenden Protokolle zuvor veröffentlicht worden und kann an anderer Stelle 22,24 gefunden werden. Der hohe Durchsatz Aufbau ist ideal für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Screening einer großen Anzahl von verschiedenen löslichen Proteine ​​zur Expression und Screening einer großen Anzahl von Expressionskonstrukten (einschließlich verschiedener Fusions Tags) für mehrere Zielgene gleichzeitig ( oder mehrere Expressionskonstrukte für ein einzelnes Ziel), um die Erfolgsquote zu verbessern. Die Plattform kann auch für den Leistungsvergleich und Validierung neuer Protokolle auf einer großen Anzahl von Zielen verwendet werden. Andere Anwendungen umfassen das Screening von Varianten für eine schwieriges Ziel, z. B. Orthologen oder alle Mitglieder der gleichen Familie oder den Erfolg der Herstellung einer Gruppe von Mutanten von einem einzelnen Ziel in einem Experiment getestet. Dieses Protokoll wurde auch in Kombination mit Co-Expressionsvektoren (wit verwendeth eine einzige markierte Protein), um die Pull-down-und vorläufige Charakterisierung von Protein-Protein-Komplexe, gefolgt von gründlicher biophysikalische Analyse, um die korrekte Stöchiometrie der Komplexbildung und 33 bestätigen lassen. Die Menge an Protein gereinigt ist manchmal für Mikrotests (Funktionstests, Protein-DNA-34 oder Protein-Protein-Interaktionsassays). Es gibt mehrere Vorteile bei der Hochdurchsatz-Screening Strategie Ausdruck: (i) die Fähigkeit, eine Vielzahl von Zielen zu testen, oder eine große Anzahl von Variablen in einem einzigen Experiment, (ii) begrenzt Batch-zu-Batch-Variante (iii) Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit, die an einem kleineren mit Tiefbrunnen, (iv) die Skalierbarkeit und Reproduzierbarkeit bei größeren Maßstab, (v) das Potenzial für die Automatisierung, und (vi) Einfachheit der Verfolgung und Handhabung (keine Kennzeichnung von einzelnen Röhren, weniger Fehler bei der Verwendung der Platten-Format als mit der Handhabung von Einzelrohren in der Misch-oder Austausch von Klonen) eingeführt. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Obwohl in dem Protokollabschnitt erörtert, gibt es mehrere wichtige Überlegungen für die Vorbereitung des Versuchs, die kurz unten beschrieben wird. Für eine ausführliche Diskussion siehe auf der vorherigen Veröffentlichung 24. Für maximale Effizienz, ist es vorteilhaft, ein geeignetes System zur Hochdurchsatz-Klonen haben, um die Unter Klonen einer großen Anzahl von Zielen zu vereinfachen. Für die Anfangsphase des VENOMICS Projekt nutzen wir die vielseitige Gateway-Rekombination System 25, die Subklonierung in einem Tempo, von Hunderten von Klonen pro Woche können in einem beliebigen Ziel-Vektor. Protokolle für die Gateway-Rekombination Klonen auf der Invitrogen Website. Weitere Alternativen für die Hochdurchsatz-Klonen sind Ligation-unabhängigen Klonen (LIC) 35,36 und restriktionsfreie (RF) 37 Klonen. Es gibt mehrere Möglichkeiten, die Zielgene zur Expression von Entry-Klon Sammlungen zu erhalten, auch durch PCR aus DNA-Matrize, oder alssynthetische Gene, die die für das Projekt ausgewählt VENOMICS Strategie ist. Synthetische Gene können mit Rekombinationsstellen an jedem Ende des Gens und Gensynthese bestellen können leicht Codon-Optimierung des Zielgens Sequenz (E. coli seltene Codons auszuschließen). Dies ist empfehlenswert, aber nicht notwendig. Für Ziele ohne Codon-Optimierung, die eine hohe Anzahl von seltenen Codons, Rosetta 2 (DE3) pLysS (die tRNAs für seltene Codons, die nicht hoch in E. coli exprimiert werden, trägt) enthalten kann besser geeignet als BL21 (DE3) pLysS ist. Zwar gibt es Stämme zur Verfügung, die die Reduktion von Disulfidbindungen in der Regel reduzierenden Umgebung des Cytoplasmas zu begrenzen, in der Hand haben sie nicht so erfolgreich gewesen wie normale E. coli-Stämme 11. Analytische Skala Affinitätsreinigung von den Testausdruck Kulturen, um die löslichen Fusionsproteine ​​zu erholen und zu quantifizieren, die Renditen durchgeführt. Quantitative Daten können auf th erhaltene löslich Ausbeuten der Fusionsproteine ​​in einem Bereich von 0,1 ausgedrückt - 100 mg / l Kultur. Wenn ein Ziel nicht löslich ist, können alternative Expression und Induktionstemperaturen, Belastungen oder Medien getestet, bevor verschiedenen Fusionspartnern verfolgt werden. Für lösliche Expression von Disulfid-reiche Proteine, die zuvor den Effekt der Fusionspartner auf Platz wir als DsbC&gt; DsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; HIS-Tag für Cytoplasmaexpression 11. Periplasmatische Ausdruck ist eine weitere Möglichkeit, die die erfolgreiche Faltung von Disulfid-reich Ziele helfen können. Das Periplasma ist eine weniger reduzierenden Umgebung als Zytoplasma und enthält nützliche Redox-Chaperone zu Disulfidbrücken zu unterstützen. DsbC, DsbA und MBP-Proteine ​​werden normalerweise in das Periplasma durch die periplasmatische Signalsequenzen lokalisiert. Dies bietet die Möglichkeit, diese Tags nutzen, um die Disulfid-reich Ziele in den periplasmatischen Raum, um Falten zu unterstützen lenken. Für unlösbare Ziele wäre der nächste Schritt purify des unlöslichen His-markierten Ziel aus Einschlusskörpern, Solubilisierung und Rückfaltung (dies ist aus dem Geltungsbereich dieses Protokoll und wird hier nicht diskutiert werden 3 9). Dies kann ziemlich einfach für Ziele mit nur ein oder zwei Disulfid-Bindungen, aber wird immer schwieriger, da die Anzahl der Disulfidbindungen erhöht. Alternativ und insbesondere für Proteine ​​und Peptide, die mit vier oder mehr Disulfidbindungen, kann es vorteilhaft sein, um komplexere Herstellungssystemen, wie Hefe-, Insekten-oder Säuger-Expressions versuchen. Mit den Fortschritten in der Miniaturisierung und Automatisierung, wird HTP Elektrophysiologie Lab-on-a-Chip-Technologien 28 zweifellos der Weg der Zukunft für funktionelle Analysen sein. Wir sehen, dass für die meisten Zwecke (vielleicht mit Ausnahme der Strukturuntersuchungen), wird dies die Notwendigkeit für große Kulturen zu negieren. Kleinkulturen nicht nur nützlich für das Screening von Expressionsbedingungen, sondern auch in der Lage, suf bereitzustellenchend Probenmengen für diese miniaturisierten Funktionstests. Die Möglichkeit, mehrere Ziele parallel in ausreichenden Mengen für die funktionelle Charakterisierung produzieren wird die Kosten für die Kultivierung und Verwendung dieser Art von Plattformen zu senken, wird die Expression und Charakterisierung von rekombinanten Proteinen mehr kosten-und zeit wirksam. Die Protokolle haben hier auf den Ausdruck von Disulfid-reichen Peptide und Proteine ​​in der Anfangsphase des RP7 Europäischen VENOMICS Projekt angewendet. Gifte sind eine ausgezeichnete Quelle von bioaktiven Peptiden, die oft interessante pharmakologische Potential. Allerdings ist ihre Produktion anspruchs aufgrund ihrer komplexen Disulfid-Bindungsmuster und klein. Mit Hochdurchsatz-Plattformen wie das hier beschrieben wird, zielt das Projekt VENOMICS, um eine Bibliothek von 10.000 neuartige Peptide Gift erzeugen, um die Vielfalt in der Natur beobachtet reproduzieren. Diese Bibliothek wird für die Charakterisierung von Disulfid-R ausgenutzt werden,ICH Peptide mit potentiellen pharmakologischen oder therapeutischen Anwendungen mit dem Ziel der Entwicklung neuer Medikamente. Die Plattform wird derzeit für das Benchmarking und Validierung neuer Protokolle für die Verwendung in der VENOMICS Projekt verwendet.

Durch die Weiterentwicklung der Genomik und Beschleunigung des Entdeckung neuer Proteine ​​motiviert, haben eine hohe Durchsatzrohrleitungen entwickelt, um traditionelle Ansätze für das Screening und die Identifizierung der optimalen Proteinproduktionsstrategien parallelisieren. Potential Variablen optimiert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf unterschiedlichen Expressionsstämme 1,2, Temperatur 3,4, 2,3 Medien, Ziel Varianten 5, 6-13 Fusionspartner, die Co-Expression mit Chaperonen 14,15 cytoplasmatische oder periplasmatischen Expression 16-18, und Reinigungspuffer 3 Komponenten. Durch die Implementierung von Hochdurchsatz-Methoden, viele Variablen oder viele Ziele können parallel mit einem hohen Maß an Effizienz getestet werden, bei gleichzeitiger Begrenzung von Charge zu Charge Variation. Nach unserer Erfahrung gibt die Strategie auch eine gute Reproduzierbarkeit auf Scale-up mit der gleichen Kultur (Temperatur, Medien, Belüftung, etc.) und Reinigungsbedingungen (gleiche Resin, Puffer, etc.). Mehrere Hochdurch Plattformen in den letzten zehn Jahren verwendet worden, um Bedingungen für lösliche Proteinexpression zu identifizieren, und zwar durch Variieren von Parametern wie Fusionspartner Expressionsstämmen oder Temperatur 19-23. Wir haben vor kurzem nutzten unsere Hochdurchsatz-Screening-Ansatz für die Expression von löslichen Disulfid-reiche Proteine ​​11. Die ausgewählten Proteine ​​waren nicht nur aus giftigen Quellen, aber auch eingeschlossen Disulfid-reichen Enzyminhibitoren aus einer Vielzahl von Arten, einschließlich Pflanzen, Schweine, Kühe und Menschen. Das Experiment wurde die Wirkung von 12 verschiedenen Fusionspartnern und drei verschiedenen Expressionsstämme auf die Löslichkeit und Faltung von Disulfid-28 retikuliert Proteinen. Wir haben gezeigt, dass die Verwendung DsbC als Fusionspartner für die Produktion in den Stamm BL21 (DE3) pLysS erheblich outproduced (sowohl in der Ausbeute und der Anzahl der erhaltenen löslichen Proteine) jede andere Kombination von Stamm und Fusion 11 getestet. DieErgebnisse dieses Experiments war die Basis für die Anpassung unserer ursprünglichen allgemeinen Hochdurchsatz-Pipeline (die für die Expression Screening einer Vielzahl von Proteinen verwendet wurde) 22,24 in eine besser geeignet für die Expression von Disulfid-reichen Zielen. Disulfid-reiche Proteine ​​aus Tiergiften sind von besonderem Interesse. Gifte sind eine komplexe Mischung von bioaktiven Peptiden und Proteinen, mit potentiellen Wert pharmakologisch und therapeutisch. Allerdings ist die Expression der Disulfidbindung-enthaltenden Proteinen, die nicht trivial. Diese Proteine ​​enthalten im allgemeinen zwischen 6.59 Disulfidbindungen und muss mit den korrekten Disulfid-Bindungsmuster, um aktiv zu sein, oxidiert werden. Derzeit ist die Plattform für das Screening der Expression einer großen Anzahl von Disulfid-reiche Tiergift-Proteine, die als Teil der Europäischen VENOMICS FP7-Projekt (www.venomics.eu) und Benchmarking-Roman Protokolle für die Hochdurchsatz-Expression von Tausenden von Zielen verwendet . Hier ein automatisiertes Verfahrenist für die Hochdurchsatz-Klein Expressions-Screening und Reinigung (siehe Abbildung 1) vorgesehen angewendet zu Disulfid-reiche Tiergift-Proteine. Die Strategie für die Disulfid-reiche Peptide und Proteine ​​verwendet eine HIS-Tag zur Aufreinigung und der redoxaktiven Fusionspartner, DsbC, die Schaffung spaltbare HIS-DsbC Fusionen an die Zielproteine ​​(siehe Abbildung 2). Während der Schwerpunkt der Protokolle hier ist die Automatisierung mit Hilfe eines Liquid-Handling-Roboter und HTP-Elektrophorese sind diese Methoden auch für einen hohen Durchsatz manuelle Ansatz, was bedeutet, dass auch Laboratorien mit einer Grundeinstellung können die Vorteile der Protokolle ohne Voraussetzung für die teure Ausrüstung zu nehmen . Hand Protokolle für die Transformation, um die Reinigung und Analyse (nicht spezifisch für Disulfid-reiche Proteine) an anderer Stelle 24 veröffentlicht worden und werden hier nicht wiederholt werden. Der Durchsatz der manuellen Verfahren (von Expressionsklon durch Rekombination erzeugtnationalen Klonen 25, um die Analyse der löslichen Protein-Ebene) ist 96 (unter Verwendung von SDS-PAGE-Detektion) oder 384 (4 x 96, mit Dot-Blot und SDS-PAGE 26) Kulturen pro Woche (siehe Abbildung 1). Dies kann erhöht werden, wenn in einer halbautomatischen Weise (unter Verwendung eines Flüssigkeitshandhabungsroboter und Dot-Blot-26 oder HTP-Elektrophorese, wie mit einem Caliper GXII LabChip System 22 durchgeführt werden, für die Analyse der Ergebnisse) auf bis zu 1.152 (12 x 96)-Kulturen, die parallel über eine Woche, wie hierin beschrieben. Die Kultur wird in 24 Tiefbrunnen (DW24)-Format durchgeführt, so dass die regelmäßige Schüttelinkubatoren kann im Gegensatz zu Kulturen in tiefe gut gewachsen 96 (DW96)-Format, das die Verwendung von kurzen Orbital High-Speed-Schüttelinkubatoren für ausreichende Belüftung notwendig (Schütteln verwendet werden bei 800 rpm). Der Einsatz von Auto-Induktion Medien 27 vereinfacht auch Ausdruck, wodurch die manuelle Induktionsschritt. Selbst dort, wo Labors vordefinierten Ausdruck und puri nutzen bereitsfizierung Bedingungen, können diese direkt in diese HTP-System übertragen werden einfach um die Effizienz zu verbessern. Eine detaillierte schematische Darstellung des Hochdurchsatz-Screening-Pipeline für Disulfid-reiche Proteine ​​ist in Fig. 3 vorgesehen. Die Parameter in der Pipeline wurden basierend auf umfangreichen Screening-Experimenten 11, 22, die uns erlaubte, die nützlichsten Bedingungen für die Proteinproduktion zu wählen ausgewählt. Charakterisierung kann auf markierten Proteine ​​direkt aus Klein Ausdrücke in Pilotstudien wo Zehn Mikrogramm Probe genügt, oder für empfindliche funktionelle Assays und Bindungsstudien (zum Beispiel Low-Volume-Patch-Clamp-Systemen HTP 28) gereinigt, durchgeführt werden. Das gleiche kann auch auf den unbezeichnet Ziele nach der Spaltung durchgeführt werden, wenn das Etikett und Protease entfernt werden (z. B. durch Umkehrphasen-HPLC). Die Qualitätskontrolle kann auch durch Massenspektrometrie (um die erwartete Größe und Oxidation st bestätigenate) oder chromatographische Methoden (Reinheit oder Heterogenität bestätigen) 29. Manchmal markieren Spaltung ist unnötig oder sogar unerwünscht ist (besonders für schlecht lösliche Proteine ​​30,31), so dass in diesem Protokoll Spaltung ist optional. Unabhängig davon, in allen Konstrukten gibt es eine TEV Protease-Schnittstelle (ENLYFQ / [G] 32) unmittelbar vor dem Zielgens auf native Protein nach Abspaltung erzeugen (siehe Abbildung 2 und Diskussion). Wenn die Spaltung der Fusions Tag gewünscht wird, kann die Spaltung (in der Elutionsfraktion oder &quot;on column&quot;) im kleinen Maßstab zu analysieren Effizienz getestet werden, Bedingungen zu optimieren, falls erforderlich und erhalten zuverlässige Schätzungen der Erträge für nachfolgende Anlagen Experimenten. Es gibt zwei Optionen für das Volumen der Perlen während der Affinitätsreinigung verwendet werden, abhängig von den Zielen und den Erwartungen des Experiments. Um so viel Protein wie möglich zu erfassen (für Pilottests oder MS zu reinigen, oder Extrapol seinaß für Scale-up-Ausbeuten) ein Endvolumen von 200 &amp;mgr; l des Harzes verwendet werden, die den Nachweis des löslichen Proteins in dem Bereich von 1-100 mg / l Kultur vor der Sättigung des Systems (siehe Protokoll (A) in Abschnitt 8.1) . Wenn das Ziel des Experiments ist die Detektion von geringen Mengen an löslichen Proteinen, dann ist jedoch ein Endvolumen von 50 ul Harz geeignet, die den Nachweis des löslichen Proteins im Bereich von 0,1-25 mg / L Kultur (siehe Protokoll (B ) in Abschnitt 8.2). Die Produktion kann hochskaliert werden, falls erforderlich, auf Milligramm-Mengen gereinigt Ziele für weitere strukturelle und funktionelle Studien mit, die für lösliche Expression identifiziert Bedingungen zu erhalten. Die Details der Scale-up-Protokolle auf AFMB verwendet haben, an anderer Stelle 22,24 diskutiert. Weitere Einzelheiten mit Bezug auf die Versuchsaufbau kritischen Schritte in dem Protokoll sind Modifikationen und Fehlersuche und Grenzen der Technik in der Scheibe vorgesehen istussion. Bitte lesen Sie die Diskussion vor Beginn der Experimente. In den Protokollen erwarten wir eine Erfolgsrate von 90% in jedem Schritt (zum Beispiel mindestens 90% der Kulturen müssen zu einem bestimmten Schritt zu wachsen). Wenn die Erfolgsrate einer Stufe in dem Experiment unter 90% werden die Proben verworfen und das Experiment wird für die vollständige Sammlung von Konstrukten wiederholt. Jedoch ist dieses Erfolgsrate nicht auf die Anzahl der Konstrukte, die als lösliche Proteine ​​oder der Anteil von Konstrukten, die mit 100% Effizienz spalten, zu exprimieren, wie dies in hohem Maße von den getesteten Proteine ​​sein. Die konkreten Details für das Set-up des Roboterarbeitstisch sind für jedes Protokoll vorgesehen ist (Abbildung 4 siehe auch), aber sie können als geeignet für alternative Arbeitstisch-Set-ups erforderlich. Der Roboter-Hardware (Tecan) besteht aus einer 96-Multichannel-Arm (MCA96), Roboter-Manipulator (Roma) und der 8-Kanal-Liquid-Handling-Kopf (LiHa). Alle Schritte Verwendung der MCA96 kann auch über die LiHa wenn ein MCA96 nicht verfügbar ist, aber sie wird länger dauern, weil die LiHa müssen zwischen den Schritten gewaschen werden. Während der Roboter technisch nicht sterilen Umgebung, die Aufnahme von Antibiotika im allgemeinen gewährleistet, dass es keine Probleme mit der Verschmutzung oder Sterilität.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&#38;ID=5270&#38;Menu=1&#38;Item=21.1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR (PCR96) plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>652270</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 &#176;C. Use a 1 in 1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>780270</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the expression of target constructs. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) pLysS competent cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or alternative E. coli expression strain of the user&#39;s choice. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathseal breathable adhesive film</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine with 96-well plate block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well sterile tissue culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662165</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l sterile disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 617</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw</td>
			<td>Infors</td>
			<td>AJ103</td>
			<td>Not essential, a regular shaking incubator can also be used. 
			http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For glycerol stocks and elution using purification protocol B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the preparation of glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 616</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape pads&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td> 
			http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactinyl</td>
			<td>Orapi Group</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent microbial disinfectant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYP-5052 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for recipes of components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7701-5102</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed, clear microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance readings. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reading spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional. For measuring OD600nm of cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with rotor for deep well plates&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for 3800 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mg/ml in water. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole ACS grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IX0005-1</td>
			<td>A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates)</td>
			<td>Misonix Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2M stock in water, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE or Caliper sample buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Receiver/Filter Plate 20 &#181;m, 1.8 ml capacity</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740686.4</td>
			<td> 
			http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable wide bore tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 050 348</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose 6 Fast Flow resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5318-02</td>
			<td>For purification of target fusion proteins. Store at 4 &#176;C. Wash and equilibrate before use. 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 0.22 &#181;m filter plate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSGV N22 10</td>
			<td>Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. 
			http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user&#8217;s discretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer and cuvettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip pipette tips</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Optional. The type of ZipTip is at the user&#39;s discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. 
			http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author&#8217;s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in e. coli

Escherichia coli (E. coli) ist das am weitesten verbreitete Expressionssystem für die Produktion von rekombinanten Proteinen für die strukturelle und funktionelle Untersuchungen. , Reinigung von Proteinen ist jedoch manchmal eine Herausforderung, da viele Proteine ​​in einer unlöslichen Form exprimiert wird. Bei der Arbeit mit schwer oder mehrere Ziele empfiehlt es sich daher um einen hohen Durchsatz (HTP)-Protein-Expression Screening auf einem kleinen Maßstab (1-4 ml-Kulturen) verwenden, um schnell Bedingungen für lösliche Expression zu identifizieren. Um mit den verschiedenen Programmen strukturelle Genomik des Labors, einer quantitativen (in einem Bereich von 0,1 bis 100 mg / L Kultur von rekombinanten Protein) und HTP-Protein-Expression Screening-Protokoll wurde auf Tausenden von Proteinen umgesetzt und validiert bewältigen. Die Protokolle wurden unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitshandhabungsroboter kann aber auch manuell ohne spezielle Ausrüstung durchgeführt werden. Disulfid-reichen Gift Proteine ​​gewinnenzunehmende Anerkennung für ihr Potenzial als therapeutische Leitstrukturen. Sie können sehr potenter und selektiver sein, aber ihre komplexen Disulfidbrücke Netzwerke machen sie schwierig zu produzieren. Als Mitglied des Europäischen Venomics FP7-Projekt ( <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ), ist unsere Herausforderung, erfolgreiche Produktionsstrategien mit dem Ziel, Tausende von neuen Giftproteine ​​für funktionelle Charakterisierung zu entwickeln. Durch die Redox-Eigenschaften der Disulfidbindungsisomerase DsbC unterstützt, passten wir unsere HTP Produktionsrohrleitung für die Expression von oxidierten funktionellen Gift-Peptiden in E. coli Zytoplasma. Die Protokolle sind auch für die Herstellung von verschiedenen Disulfid-reiche Proteine. Hier zeigen wir unsere Pipeline für die Produktion von Tiergift-Proteine ​​angewendet. Mit den hierin beschriebenen Protokollen ist es wahrscheinlich, dass lösliche Disulfid-reichen Proteinen in weniger als einer Woche erhalten werden. Selbst aus einem kleinen Maßstab, gibt es das Potenzial, um th verwendenE gereinigte Proteine ​​für die Validierung der Oxidationszustand durch Massenspektrometrie, zur Charakterisierung in Pilotstudien oder für empfindliche Mikro-Assays.

Repräsentative Ergebnisse sind in Fig. 6 für das Screening von Expressions 96 Disulfid-reiche Proteine ​​vom VENOMICS Pipeline gezeigt. Die Proteine ​​werden durch zunehmende Anzahl von Disulfidbindungen dann zunehmende Anzahl an Resten angeordnet sind. Die Peptide wurden in das Zytoplasma mit einer HIS-tag und DsbC Fusionspartner ausgedrückt. Bei Verwendung der empfohlenen Kulturbedingungen wird eine OD 600 von 12 normalerweise erreicht. Die Peptide wurden unter Verwendung von 8,2-Protokoll-B mit einem Endvolumen von 50 &amp;mgr; l Nickelaffinitätsharz gereinigt, so dass ein Maximum von ~ 25 mg / l Fusionsprotein konnte in diesem Versuch festgestellt werden. Figur 6A zeigt das Ergebnis der Elektrophorese aus dem Bremssattel LabChip System (welches die Fusion vor der Spaltung) und dem Bewertungssystem basierend auf einer Extrapolation in mg / l Kultur des Fusionsproteins zu erhalten (in Anteilen von 0,1 bis 2 mg / l Kultur, 2 10 mg / l Kultur, 10 bis 25 mg / l Kultur und kein<html> t festgestellt.) Beachten Sie, dass die gespaltene DsbC Tag läuft normalerweise bei etwa 32 kDa, 27 kDa anstatt wie erwartet. Ebenso sind die DsbC Fusionen führen auch rund 5 kDa höher als erwartet. Für viele der Ziele, die wir sehen, nicht nur die intakte Fusions (Oberband), sondern auch der Fusionspartner allein (Unterband). Für einige dieser Ziele die Optimierung der Kulturbedingungen kann das Verhältnis des intakten Fusions (Oberband) im Vergleich zu DsbC allein ermöglicht eine Erhöhung der endgültige Ertrag zu verbessern. Das Scoring nur auf der Ebene der intakten Fusions basiert. Nur 16 der 96 Proteine ​​konnten nicht an der Fusionsebene nachgewiesen werden. Dies entspricht einer Gesamterfolg Niveau von 83%. Von den 80 Proteinen, die nachgewiesen werden konnte, 45 von diesen wurden in Konzentrationen von mehr als 2 mg / L Kultur (56%) festgestellt. Je nach Ziel und Fusion werden Proteinausbeuten in der Regel im Bereich von 2-100 mg / L Kultur (obwohl in diesem Beispiel unter Verwendung des Protokolls 8.2 B ein Maximum von ~ 25 mg / l Fusionsprotein detektiert werden kann). t &quot;&gt; Eine Analyse des Erfolgs von Anzahl der vorhandenen Disulfidbrücken (in 6B gezeigt) zeigt angemessenen Erfolg für alle Zahlen der getesteten Disulfidbrücken (zwischen 1 und 7), wobei die niedrigste Erfolgsniveau auf 66% für die Ziele, die 6 Disulfid Bindungen. Eine Analyse der Verteilung der Expressions Erfolg durch isoelektrische Punkt und der Anzahl der Reste (in Fig. 6C gezeigt) zeigt keine besondere Vorliebe für die Technik, mit beiden erfolgreich exprimiert Ziele und Ziele, die nicht erkannt wurden während der Auftragung verstreut. Fig. 6D zeigt ein Beispiel der Ergebnisse der Massenspektrometrie Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (ESI-MS) für ein einzelnes Ziel erhalten wird, vor und nach Reduktion der Probe mit DTT. Normalerweise würde eine solche erschöpfende Massenspektrometrieanalyse nicht durchgeführt werden müssen (eine reduzierte Probe nicht analysiert werden müssen), aber für die Zwecke der gründlichen demonstration wir beide Ergebnisse gezeigt. Die dargestellte Ziel ist ein 5,7 kDa Disulfid-reichen Giftprotein mit 4 Disulfidbrücken. Das Spektrum auf der linken Seite zeigt die Ergebnisse für das Protein vor der Reduktion mit DTT, wie es nach der Spaltung und Entsalzung ohne weitere Eingriffe. Das Spektrum auf der rechten Seite zeigt die Protein nach Reduktion mit DTT, gefolgt von Entsalzen, um überschüssiges DTT zu entfernen. Die, die den experimentellen Massen-Ionen sind mit Pfeilen auf das Spektrum und die Bezeichnung für jedes Ion markiert ist grün dargestellt. Die für diese Ionen berechnet Versuchs den Massen (für das Protein vor der Reduktion (-DTT) und nach Reduktion (+ DTT)) sind in der Tabelle gezeigt. Die Massen (5709,6 Da für die Probe vor der Reduktion und 5717,6 Da für die reduzierte Probe) zeigen eine Massendifferenz von 8 Da. Eine Massendifferenz von 2 Da entspricht der Gegenwart von 1 Disulfidbrücke oxidiert, damit eine Massendifferenz von 8 Da die Anwesenheit von 4 Disulfid-Bindungen (wie erwartet) inder nicht-reduzierten Probe. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> 1. Schematische Darstellung des Expressions-Screening mit hohem Durchsatz Protokoll. Unter Verwendung dieses Protokolls 96-384 Bedingungen können von einer einzigen Person in einer Woche mit manuellen Verfahren getestet werden, oder bis zu 1.152 Bedingungen mit der beschriebenen halbautomatischen Ausrüstung. Expressionsplasmide werden mit einer Rekombination Klonen Technologie, so dass zahlreiche Ziele können auf einmal subkloniert errichtet. Sobald löslichen Expressionsbedingungen wurden identifiziert und Spaltung durchgeführt wird, wenn gewünscht, kann das Protein auf die Qualitätskontrolle gehen, um die Oxidation und Reinheit im Mikro und / oder Großproduktion zu überprüfen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 2. Schematische für den universellen rekombinatorische Klonen und konstruieren Design. Aus den Zieleintrag Klone können mehrere Expressionsvektoren werden in einem einzigen Experiment in einem Hochdurchsatzverfahren (bis zu 6 x 96 Klone Eintrag in einer Woche) subkloniert. Das exprimierte Protein kodiert für ein HIS-Tag für Nickel-Affinitätsreinigung. Die DsbC (fehlt seiner periplasmatische Signalsequenz für Cytoplasmaexpression) Fusionspartner wird verwendet, um die Löslichkeit und / oder Hilfe Faltung und korrekte Oxidation des Zielproteins zu erhöhen. Beachten Sie, dass die Zielkodierungssequenz sollte ein N-terminales TEV-Protease-Erkennungsstelle (ENLYFQ) enthalten, wenn tag Spaltung gewünscht wird. Der Einschub links oben zeigt die Herstellung der Eintrag Klone unter Verwendung einer Donor-Vektor und die Zielsequenzen, die durch PCR oder Gen-Synthese erhalten werden können. Eintrag Klone können auch von kommerziellen Entry-Klon Sammlungen erhalten werden. Mehrere rekombinatorische Klonen Systeme verfügbar sind, aber wir nutzen die Gateway-system, wie in dem Schema gezeigt. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> 3. Hochdurchsatz-Screening-Pipeline für mehrere Disulfid-reiche Ziele. Ziele werden zunächst als HIS-DsbC-Fusionen in das Zytoplasma der BL21 (DE3) pLysS E. ausgedrückt coli bei 37/17 ° C unter Verwendung von Auto-Induktionsmedium (ZYP-5052). Reinigung von Nickel Harz, gefolgt vom Nachweis von löslichen Konstrukte HTP-Elektrophorese (oder Dot-Blot / SDS-PAGE) durchgeführt. Wenn die erste Runde der Expressions-Screening nicht erfolgreich ist, werden alternative Kulturbedingungen versucht. Wenn Konstrukte erzeugen lösliche Proteine ​​in hohen Ausbeuten im Mikro und Qualitätskontrolle durchgeführt werden kann und, falls erforderlich, können die Großproduktion verfolgt werden. Für Ziele, wo die Renditen löslich sind nicht hoch genug ist, können Expressions-Screening mit alternativen stra weiterIns und Temperaturen dann andere Fusionspartner und periplasmatischen Ausdruck. Optionale Schritte sind durch gestrichelte Kästen dargestellt. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Robot Arbeitstisch Setup für die HTP-Plattform. Das Layout der Liquid-Handling-Roboter-Arbeitstisch angezeigt wird, obwohl alternative Arbeitstische können auch verwendet werden, wenn es gleichwertige Sites. Das Setup besteht aus einer Waschstation (WS) für die (8-Kanal-Liquid-Handling-Kopf (LiHa)), zwei Mikroträgern mit jeweils 4 Positionen (MP4, Positionen 1-4 und 5-8), eine Vakuumstation mit 2 Positionen (Te-Sauger, Positionen 9 und 10), ein Mikroträger mit 3 Positionen (MP3, Positionen 11-13), zwei Plattenschüttler mit 2 Positionen jeweils (Te-Shakers, Positionen 14-15 und 16-17) und ein Träger für Einwegspitzen mit 3 Positionen (DiTi, Positionen 18-20). Neben derre sind zwei Hotel-Träger für Deep Well Platten und eine für Mikroplatten (nicht gezeigt). Die auf der Liquid-Handling-Roboter installierte Hardware ist ein 96-Mehrkanal-Arm (MCA96) zur Verwendung mit Einwegspitzen, einem 8-Kanal-Liquid-Handling-Kopf (LiHa) mit festen Spitzen und einem Roboter-Manipulator (Roma), die Platten / Geräte herum bewegt der Arbeitstisch. Die Nummerierung der Positionen ist in der gesamten Protokoll bezeichnet. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Schema für die Übertragung von einer einzigen 96-Well-Platte in vier 24-Well-Platten. <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6. Repräsentative Ergebnisse sind für den Ausdruck Bildschirm von 96 Disulfid-reich pro Gift gezeigtProteine. Die Proteine ​​wurden als HIS-DsbC Fusionen im Zytoplasma exprimiert und mit 50 ul Nickel Harz (Protokoll 8.2-B) gereinigt. A) Expression Screening-Ergebnisse und zeigt virtuelle Gel und erzielte für die Expressionsausbeute. Der Kontrast in der virtuellen Gel Spur-zu-Spur angepasst, um für sehr schwache oder starke Bänder zu kompensieren. Beachten Sie, dass für einige Ziele zwei Bänder zu sehen ist, die obere Bande, die dem intakten Fusionsprotein und der unteren Bande, die dem Fusions Tag allein. B) der Anteil der Proteine ​​in jedem Expressionsniveau exprimiert, verglichen mit der Anzahl der Disulfidbindungen in das Protein. Die tatsächliche Anzahl von Proteinen in jeder Gruppe auf dem Graphen. C) überschichtet Die Verteilung der Expressionslevel basierend auf isoelektrischen Punkt (pI) und die Anzahl von Resten. D) ein Beispiel für die Massenspektrometrie-Ergebnisse für ein 5,7 kDa Disulfid-reichen Gift Protein mit 4 Disulfidbrücken. Das Spektrum aufdie linke Seite zeigt das Protein vor der Reduktion mit DTT und das Spektrum auf der rechten Seite zeigt das Protein mit DTT reduziert und dann entsalzt. Die, die den experimentellen Massen-Ionen sind mit Pfeilen markiert und deren Zuordnungen sind in grün dargestellt. Die experimentellen Massen für das Protein vor der Reduktion und nach der Reduktion sind in der Tabelle dargestellt und zeigen eine Massendifferenz von 8 Da, entsprechend der Anwesenheit von oxidierten Protein vor Zugabe des Reduktionsmittels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur sehen .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Rezept </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 ml 10 g Trypton 5 g Hefeextrakt 925 ml Wasser </td><td> Mischen und dann im Autoklaven zu sterilisieren. </td></tr&gt; <tr><td> 2 M MgSO 4 </td><td> 100 ml 49,3 g MgSO 4 · 7H 2 O ~ 60 ml Wasser </td><td> Rühren, bis gelöst, dann im Autoklaven zu sterilisieren. </td></tr><tr><td> 50x 5052 </td><td> 1 L 250 g Glycerin 730 ml Wasser 25 g Glukose 100 g α-Lactose </td><td> In der Reihe über Hitze rühren, bis alle gelöst und dann im Autoklaven zu sterilisieren. </td></tr><tr><td> 20x NPS </td><td> 1 L 900 ml Wasser 66 g (NH 4) 2 SO 4 136 g KH 2 PO 4 142 g Na 2 HPO 4 </td><td> In der Reihe und rühren, bis alles gelöst und dann im Autoklaven zu sterilisieren. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Rezept für Komponenten ZYP-5052 Medium.

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High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Ein Protokoll für die quantitative, Expressionsscreening mit hohem Durchsatz und analytischen Reinigung von Fusionsproteinen aus kleinen Escherichia coli-Kulturen beschrieben und auf die Expression von Disulfid-reichen Tiergift-Protein-Targets aufgebracht.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

24.0K Aufrufe.  Aix-Marseille Université.  Ein Protokoll für die quantitative, Expressionsscreening mit hohem Durchsatz und analytischen Reinigung von Fusionsproteinen aus kleinen Escherichia coli-Kulturen beschrieben und auf die Expression von Disulfid-reichen Tiergift-Protein-Targets aufgebracht. 

Serie: High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Expression von rekombinanten Proteinen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine Venom Produziert in Applied

Zusammenfassung

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Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

Expression von rekombinanten Proteinen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli

High-throughput Reinigung von Affinity-markierter rekombinanter Proteine

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied

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Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in

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