The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.

1. Preparación de muestras <ol><li> Preparación de B. Las células subtilis for Imaging <ol><li> Inocular 10 ml de Caldo Penassay (PAB, también conocido como Medio Antibiótico 3) con una sola colonia de B. subtilis SU570 cepa (168 trpC2 FtsZ :: FtsZ-GFP-spec) 16. Crecer durante la noche en una velocidad baja (100 rpm) agitador a 30 ° C. </li><li> Diluir el cultivo durante la noche a 0,05 A 600 (absorbancia medida a 600 nm) en PAB fresca a 30 ° C con alta velocidad (215 rpm) agitando y crecer hasta la fase exponencial media (A 600 ~ 0,4). </li><li> Añadir 2 g de agarosa de electroforesis grado en 100 ml 1x medio de crecimiento (PAB) en una botella de vidrio con tapón de rosca. Disolver la agarosa mediante tratamiento en autoclave. Esto se puede almacenar a 4 ° C durante unos pocos meses, y calentados para fundir la agarosa cuando sea necesario. Deje reposar a temperatura ambiente. </li><li> Fije un marco de adhesivo (65 l de capacidad, véase la Tabla de Materiales) a un gla estándarss portaobjetos de microscopio. Para ello, retire la hoja delgada de poliéster (cada marco de adhesivo se coloca entre dos láminas de poliéster, uno fino y uno grueso, y tiene el centro eliminado cuadrado) y aplicar la superficie adhesiva expuesta de la trama a la superficie del portaobjetos de microscopio. Esto crea efectivamente un pozo cuadrado en la parte superior de la corredera. Dejar la lámina de poliéster de espesor unida al bastidor ya que esto evitará que el cubreobjetos se pegue a la misma en pasos posteriores. </li><li> Derretir la solución de agarosa en el microondas hasta que hierva y pipeta de 67 l en el marco de adhesivo. Inmediatamente colocar un cubreobjetos en la parte superior para crear una superficie plana y dejar a temperatura ambiente durante 5-10 min. Retire el cubreobjetos durante 1-2 minutos mientras que la muestra se cosecha. </li><li> Cosecha de una alícuota de 1 ml de la muestra y se centrifuga a 5900 xg durante 30 seg. Decantar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 200 l fresco PAB. </li><li> Tomar 2,5 l de la muestra concentrada y una pipeta en un pre-prepacojín de agarosa rojo. Extender la muestra uniformemente a lo largo de la superficie plana de la almohadilla de agarosa. Retire el marco de adhesivo del portaobjetos usando pinzas sin tocar la almohadilla de agarosa. </li><li> Transferir el pad de agarosa del portaobjetos de microscopio a una placa de 35 mm de diámetro Petri con fondo cubreobjetos de vidrio. Invertir la almohadilla de agarosa de manera que la suspensión de células y el cubreobjetos de la placa de Petri están en contacto directo uno con otro. La parte inferior de la placa de Petri tiene un índice de refracción de 1,525 para imágenes de alta resolución. </li></ol></li><li> Preparación de S. vivo Las células aureus for Imaging <ol><li> Inocular 10 ml de caldo L con una sola colonia de S. aureus cepa SA94 (SH1000 contiene arado-FtsZ-GFP y pGL485; Ehh r, r Cm) 25. Crecer durante la noche en una velocidad baja (100 rpm) agitador rotatorio a 37 ° C. </li><li> Diluir el cultivo durante la noche a 0,05 A 600 (absorbancia medida a 600 nm) en caldo L fresco con 0,05 mM de IPTG (isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido) para inducir la producción de la proteína de fusión. </li><li> Se incuba a 37 ° C con alta velocidad (215 rpm) a temblar y crecer hasta mediados exponencial fase (A 600 ~ 0,4). </li><li> Siga los pasos 1.1.3 - 1.1.8 se ha descrito para B. preparación de células vivas subtilis. Nota: Añadir la concentración apropiada de inductor a la solución de agarosa en el paso 1.1.3 para las cepas que expresan una proteína de fusión fluorescente bajo control inducible. </li></ol></li></ol> 2 Preparación del Microscopio Este método utiliza un sistema de imágenes 3D-SIM DeltaVision OMX (microscopio óptico, eXperimental) equipado con un módulo de Blaze. Para los experimentos descritos, se utilizan sólo un láser y una cámara. La iluminación y la trayectoria de la luz se describen en la Figura 1. Este método asume que el microscopio tiene una calibración adecuada, la función de transferencia óptica (OTF)archivos y la luz de mantenimiento colimación realizan. <ol><li> Para los experimentos de imágenes de células vivas, asegúrese de que la etapa de calentamiento se fija a la fase cerámica y el collar objetivo de calentar se une al objetivo (60X 1,42 objetivo aceite NA). </li><li> Encienda los objetivos y etapas calentadores por lo menos 4 horas antes de la proyección de imagen y poco a poco la temperatura de la rampa hasta el nivel deseado a una velocidad máxima de 5 ° C / hr. Se recomienda iniciar este proceso la noche antes de la proyección de imagen y la rampa a 3 ° C / 4 hr. Para los experimentos de células vivas con B. subtilis, la mayoría de los experimentos se llevan a cabo a 30 ° C. Para S. aureus, todos los experimentos se llevan a cabo a 37 ° C. </li><li> En el día del experimento, encienda el sistema por lo menos 1 hora antes de la formación de imágenes para permitir que el sistema y láseres para estabilizar plenamente. Cargue el pequeño inserto etapa plato al escenario calienta a precalentar. <ol><li> Encienda la estación de trabajo del controlador maestro. </li><li> Encienda el workstat procesamiento de imágenesde iones. </li><li> Encienda el enfriador de cámara situada en el suelo fuera del recinto microscopio. </li><li> A su vez en todas las cámaras sCMOS (a pesar de que no van a ser usados). </li><li> Dentro del recinto del láser y la electrónica, pone en marcha: <ol><li> Chasis del controlador del instrumento. </li><li> Chasis Nanomotion. </li><li> Controlador de Jena para Z piezo. </li><li> Todos los controladores de motor 4 galvo. </li><li> Módulo de control de láser primaria. </li><li> Módulo de control de láser secundaria. </li><li> Todas las estaciones de trabajo de la cámara. </li><li> Estación de trabajo OMXIC. </li></ol></li><li> En la estación de trabajo del controlador maestro, abra el software OMX haciendo clic en el icono. Establezca la ruta de archivo para guardar los datos en una carpeta de datos apropiada. </li><li> Para inicializar el hardware, vaya al menú Herramientas, seleccione Hardware y haga clic en el botón Reiniciar Hardware. Cerrar ventana. </li><li> Iniciar el SoftWorx software.Turn en los láseres requeridos para los experimentos (488 nm). </li><li> Encienda el interruptor de la llave para el bloqueo de seguridad láser. </li><li> Asegúrese de insertar el cajón del filtro dicroico correcta por debajo del objetivo. Para GFP, que es el estándar (o fijo) cajón. </li><li> En OMX SF, vaya al menú Archivo, seleccione Configuración y seleccione el cajón fijo en el menú desplegable de cajón. Cerrar ventana. </li><li> Haga lo siguiente en la pantalla principal del software, en la sección Parámetros de luz: <ol><li> Active la cámara adecuada para el láser de excitación y un filtro de emisión (FITC) de la cámara de la selección de canal. </li><li> Compruebe el modo de imagen está configurado en secuencial. </li><li> Compruebe la ruta de luz se ajusta SI. </li><li> Compruebe el modo se ajusta a 95 MHz. </li><li> Compruebe se selecciona el láser 488 en excitación. </li><li> Establezca el <strong&gt; Tamaño de 512 x 512 para el tamaño de la ventana y la Agrupación de 1 x 1. </li></ol></li><li> En la pestaña Experiment, asegúrese de Tipo se establece en SI en el menú desplegable. </li><li> Asegúrese de seccionamiento se activa y que la sección de separación óptica se establece en 0.125. </li><li> Asegúrese de Punto de enfoque cuando comenzar el análisis es medio. </li></ol></li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Aplicar una gota de aceite a la parte superior del objetivo. Por 37 ° C, el aceite inicial recomendada tiene un índice de refracción de 1,518 a adaptarse mejor a la del índice de refracción de la almohadilla de gel utilizado para montar las células bacterianas a 37 ° C (consulte el paso 1.1.3). </li><li> Coloque la placa de Petri muestra que contiene las células preparadas en el recuadro escenario y cubrir con la tapa de calefacción circular. Baje la etapa hasta que el aceite toque el fondo della placa de Petri muestra. </li><li> Dejar que la cápsula para calentar-equilibre durante 15 min en la etapa. El uso de un bajo valor Exposición de 5 ms o menos (que se encuentra en la sección Parámetros de luz), se centran en la muestra utilizando los controles de la etapa de posicionamiento nano (DZ, ubicado en la sección Nano posicionamiento). Enfoque hacia arriba y abajo a través de la muestra para determinar si la luz se distribuye uniformemente por encima y por debajo del plano focal de la muestra. Si la función de dispersión de punto es ni siquiera (aberración esférica), limpiar el fondo del plato de la muestra y el objetivo con cloroformo. Cambiar el aceite y repetir este paso hasta que se encuentra una coincidencia adecuada entre el índice de refracción del aceite y de la muestra para minimizar la aberración esférica. </li><li> El uso de 0,5 micras tamaños de paso dZ, marcar la parte superior e inferior de la pila de imágenes. Volver a la mitad de la muestra. Haga clic en el botón Grosor Entra en la pestaña Experimente para establecer el grosor de obtención de muestras. Keep la altura de la chimenea a un mínimo mientras que teniendo cuidado de no cortar la parte superior e inferior de los Z-anillos. Los espesores típicos para B. muestras subtilis son 2-3 micras. </li><li> Determinar el valor de intensidad máxima (Max) de la imagen de la muestra con los ajustes de exposición y% T actuales. Este valor se encuentra por debajo de la ventana de la imagen. Para time-lapse, ajustar la exposición y el% T para obtener una intensidad máxima de 1.100-1.400 fondo por encima de la imagen. Se necesita un mínimo de intensidad de fondo 1000 anteriormente para obtener reconstrucción de la imagen. Para una imagen de una sola vez, aumentar la intensidad máxima a 4.000-5.000. </li><li> Active la sección Time-lapse en la pestaña Experimento. Ajuste la velocidad de fotogramas requerido y el tiempo total. En los datos de archivo, escriba un nombre de archivo adecuado. Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar la adquisición de la imagen. Nota: La adquisición de imágenes se completa cuando el gbar reen Progreso está terminado y un archivo de registro aparece en el conjunto de datos en la carpeta de datos apropiado. </li></ol> 4. Comprobación de la calidad de datos <ol><li> Al comienzo de la adquisición de la imagen, tenga en cuenta el valor máximo de intensidad de la imagen en el comienzo de la adquisición de la imagen para el primer fotograma de la serie temporal. Al final de la adquisición de la primera trama, compruebe que no ha sido más que una disminución del 10% en la intensidad de la señal a través de la pila Z para este primer marco. Si ha habido más de este nivel de photobleaching en el primer punto de tiempo, los datos a través de la serie de tiempo serán de calidad insuficiente para el análisis y la adquisición de series de tiempo se pueden detener. </li><li> Al final de la adquisición de las series de tiempo, abra el archivo de imagen en bruto resultante con .dv sufijo y determinar la disminución de la intensidad de señal máxima desde el inicio de la serie de tiempo a la imagen final. Deseche todos los puntos de tiempo donde no tiene abejan más de 30% fotoblanqueo. </li></ol> 5. imágenes Reconstructora 3D-SIM <ol><li> En el menú Proceso, activar la ventana SI Reconstrucción. Utilice la configuración de pre-existentes para todos los parámetros. </li><li> Active el botón OTF Uso específico de canal, y seleccione el conjunto de filtros estándar. Activar el uso específico de canal botón KO ángulos y establecida en el conjunto de filtro estándar. </li><li> Arrastre y suelte el (.dv) archivo RAW en el espacio de archivos de entrada. Haga clic en Adelante. El archivo de salida tendrá el mismo nombre que el archivo de entrada con _SI añade al final. Nota: Este proceso de reconstrucción se puede ejecutar como una tarea utilizando la función Generador de tareas desde el menú Proceso, si hay varios archivos a procesar. </li></ol> 6. Exportar datos y análisis <ol><li> Utilice Imaris para visualizar imágenes en 3D en el modo y ex superardatos de imagen del puerto como tiff (300 dpi) o archivos avi (sin compresión). Mediciones de tamaño en Imaris se pueden realizar utilizando la herramienta de mediciones en el modo de superar. </li><li> La generación de parcelas de intensidad en 3D del anillo Z de los datos de imágenes en 3D-SIM: <ol><li> Examinar la distribución de FtsZ alrededor del anillo y Z para crear parcelas de intensidad 3D <ol><li> Abra un archivo de imagen en 3D para ver las z cortes individuales. Utilice la herramienta de visor de volumen situado en la pestaña Vista menú para recortar una región de interés. </li><li> Introduzca el número de la ventana de esta imagen 3D en la ventana de entrada e introduzca un nuevo y sin número de la ventana en la ventana de salida. El botón de selección de región estará disponible para recortar un anillo Z individual de interés desde el 40 × 40 m campo de vista original. </li><li> Ajustar el eje deseado y el grado de rotación en la pestaña de rotación. Haga clic en el botón Iniciar. Desplácese por el volumen para obtener la perspectiva deseada del anillo Z. </li><li> Utilice la herramienta de inspector de datos y ajuste tque las dimensiones de columna / fila para crear una nueva región de interés en torno a un anillo Z individual. Haga clic en el centro de la imagen para colocar esta nueva región de interés. Los datos de imagen de texto es una tabla generada automáticamente que muestra la intensidad de fluorescencia de cada píxel dentro de la región de interés. </li><li> Haga clic en el botón gráfico 3D para ver inicialmente la trama intensidad. </li><li> Alternativamente, los datos de la imagen de texto se pueden exportar haciendo clic en el botón de guardar datos de la tabla en el menú archivo. </li><li> Copie los datos de la imagen desde el archivo de texto guardado en una nueva hoja de cálculo. Seleccione todas las celdas dentro de la hoja de cálculo y cree un nuevo gráfico en 3D de superficie. Dar formato al gráfico de la intensidad solar en 3D para su publicación. </li></ol></li><li> Para la repetición de datos time-lapse pasos 6.2.1.1 - 6.2.1.7 en cada uno de los diferentes puntos de tiempo desde el archivo de imagen en 3D. </li></ol></li><li> Seguimiento de Intensidad Media fluorescencia con el tiempo <ol><li> Utilice los datos de la imagen de texto para realizar un seguimiento de los fluorescence intensidad con el tiempo en una región de interés. </li><li> Seleccione las celdas que corresponden a la región de interés. </li><li> Calcular la intensidad media de fluorescencia en cada punto de tiempo para esta región de interés. </li><li> Usar los valores medios de intensidad de fluorescencia para generar un gráfico de línea separado. </li></ol></li></ol>

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This publication is sponsored by GE Healthcare.

Imágenes de células vivas fluorescente es una poderosa herramienta que permite la observación de los cambios dinámicos dentro de las células a través del tiempo. Formación de imágenes en vivo de la biología de la célula bacteriana ha sido difícil debido al tamaño de células pequeñas y la capacidad de las células bacterianas para resistir la exposición repetida a la luz de excitación reducida. F3D-SIM ha ampliado las herramientas disponibles para interrogar a toda la biología celular, pero es necesario realizar cuidadosamente esta técnica como artefactos se pueden introducir si se aplican mal. Hay un número de consideraciones importantes para el uso exitoso de esta técnica. Como se trata de un método de imagen de fluorescencia de campo amplio que se basa en el uso de la función de dispersión de la luz de la emitida, desajuste del índice de refracción y la aberración esférica de la luz emitida deberá evitarse para permitir la reconstrucción precisa de la imagen. El uso de cubreobjetos de 0,17 mm de espesor de una alta calidad para evitar la variación de la intensidad de la señal debido a la variabilidad en el espesor de vidrio de las cubiertasSe recomienda encarecidamente el labio. Es sumamente importante evaluar cuidadosamente la aberración esférica de la luz emitida durante las etapas iniciales de todos los experimentos y ajustar el índice de refracción del aceite de inmersión, según sea necesario. Esto puede variar de día a día, ya que depende tanto de la temperatura y el montaje de los medios de comunicación / sustrato de la muestra. El uso del aceite incorrecto resultará en la reconstrucción inferior de las imágenes con artefactos tales como halos y señales de eco. Al final del proceso de reconstrucción de la imagen, para cada fase de una medida de la calidad de la reconstrucción se puede conseguir por la &quot;mejor ajuste para el ángulo de KO&quot; para cada fase / ángulo de la iluminación. Si este valor está por debajo de 1 para cada ángulo, entonces la calidad de la reconstruida será probablemente alta. Si este valor está por encima de 6, lo más probable es que la imagen reconstruida contendrá artefactos. Artefactos comunes incluyen i) la aparición de rayas en la imagen que correspondea uno de los ángulos de la cuadrícula. Esto puede resultar de la señal más baja de ese ángulo de la parrilla; ii) formación de halos alrededor de las estructuras. Esto puede ser el resultado de niveles muy desiguales de señal desde estructuras brillantes en comparación con las estructuras circundantes, un desajuste del índice de refracción del aceite y la muestra o puede ser debido a las estructuras en la imagen que se está demasiado amorfo y que no contiene suficiente &quot;estructura&quot; para ser reconocido por el algoritmo; iii) &quot;panal de abeja&quot;, que resulta de una baja relación señal ruido en la imagen, por lo general debido a la alta señal de fondo; iv) las estructuras que se estiran / alargadas en xy que pueden ser debidas a falta de coincidencia de índice de refracción del aceite y de la muestra. Este artefacto es difícil discernir por un usuario inexperto. Se recomienda que los nuevos usuarios consulten a un investigador experimentado SIM para el asesoramiento en la interpretación y análisis de imágenes cuando se empieza a utilizar esta técnica. Al igual que con todos los experimentos de imagen en vivo de células fluorescentes, es de importaciónANT para equilibrar cuidadosamente la entrada de energía de excitación con el fin de minimizar el grado de photobleaching y fototoxicidad de las células con suficiente señal de emisión necesaria para reconstruir imágenes con artefacto mínimo. Photobleaching excesiva (mayor de 30% a través de una sola adquisición z-stack) dará lugar a un patrón de creación de bandas en la imagen reconstruida. Con el uso de cámaras sCMOS, imágenes super-resolución puede ser reconstruido con éxito a partir de imágenes en bruto con la señal de emisión tan bajo como 1.000 conteos por encima del fondo. Esto puede permitir que para tiempos de exposición muy cortos reduciendo de este modo photobleaching y que permite la captura rápida para cada trama. También aumenta la cantidad de tiempo entre tramas para que las células se recuperan de la entrada de energía de excitación. Además, como el tiempo de captura para cada marco individual puede ser muy corto, el grado de artefacto introducido por &quot;desenfoque de movimiento &#39;durante una captura individuo se reduce con el uso de este método. Esta Variación de 3D-SIM ofrece una serie de ventajas sobre otras tecnologías disponibles supermercados y de imagen de alta resolución de imágenes en vivo de los biólogos celulares bacterianas. El aumento de 2 veces en la resolución en las 3 dimensiones y la capacidad de imagen de hasta 30 micras en una muestra permite obtener imágenes de las células bacterianas (y de mamíferos) enteros durante un experimento. Técnicas como la de una sola molécula de localización que se realizan habitualmente en la onda evanescente no pueden alcanzar la profundidad de penetración en una muestra y no ofrecen información sobre las células enteras. Los últimos avances que permiten mayores profundidades de muestreo para esta técnica puede resultar en una mejor resolución axial de células enteras. Además, las técnicas de localización de una sola molécula que requieren miles de imágenes en bruto para ser adquiridos también están limitados en la velocidad de fotogramas que se pueden capturar y puede requerir compromiso entre velocidad de fotogramas de captura y la última resolución espacial alcanzada, como la resolución espacial depende de la número de vísperants grabadas dentro de un espacio definido. Disminuir el número de fotogramas capturados se traducirá en una resolución espacial inferior, pero puede ser suficiente para lograr la resolución temporal requerida para el proceso biológico de interés. La cantidad de tiempo de recuperación entre los marcos también puede ser necesario un aumento de minimizar fototoxicidad en células vivas, limitando así la duración y la frecuencia con la que se puede obtener de series de tiempo. Técnicas de alta resolución como la microscopía electrónica (EM) o electrones cryotomography (ECT) ofrecen gran resolución en 3D-SIM (y otras técnicas de microscopía óptica super-resolución), pero se deben realizar en muestras fijadas. La fijación y el procesamiento pueden introducir artefactos y la falta de etiquetado pueden dificultar la interpretación. -Label libre de ECT tiene un contraste pobre y pueden alcanzar profundidades de penetración de la muestra de alrededor de 500-200 nm 24, por lo que incluso si la proteína de interés puede ser identificado, la estructura de la proteína en una célula bacteriano entero no puede ser observada.Incluso cuando el etiquetado puede ser utilizado en EM, tal como con inmunomarcaje, la imagen sólo se realiza en 2D. 3D es sólo alcanzable con seccionamiento fino y reconstrucción computacional de las secciones. El seccionamiento delgada requiere un técnico con experiencia, pero puede ser problemático y provocar artefacto. Con células vivas o fijas, 3D-SIM no necesita ser incrustado en una manera específica y las células se pueden preparar rápidamente para formación de imágenes en un estado nativo cercano. Este método es relativamente fácil de implementar por los investigadores con un mínimo de experiencia en microscopía de fluorescencia. Los experimentos se pueden realizar en los medios de comunicación que apoyan la función saludable de las células, siempre que no se muestra fluorescente o generar la señal de fondo excesiva. Para las células bacterianas, esto puede permitir el uso de muchos tipos de complejos y medios mínimos o el uso de medios sólidos o semi-sólidos para controlar la motilidad celular bacteriana. Muchos biólogos que ya han ingeniería proteína fluorescente (FP) fusiones y probado la funcionalidad deestas fusiones pueden ocupar esta tecnología rápidamente sin más ingeniería y validación con nuevas fusiones FP fotoactivables. Nos encontramos, como observación general, que S. aureus fue más susceptible a fotoblanqueo cuando se toman imágenes con fusiones de PF que B. subtilis. Utilizando nuestros métodos 3D-SIM original, en el que el patrón de cuadrícula se generó por una rejilla física, no fue posible realizar imágenes de células vivas con un número de S. fusiones aureus FP. Sin embargo, con este método F3D-SIM avanzado, hemos sido capaces de imagen estas fusiones FP y realizada de series de tiempo corto para capturar la dinámica de estas proteínas etiquetadas. Esto es más probablemente debido a los tiempos de exposición necesarios para la reducción de formación de imágenes y el aumento de tiempo entre tramas para la recuperación celular. OMX Blaze 3D-SIM es una tecnología disponible en el mercado que puede ser relativamente fácil de implementar en un solo laboratorio o un centro de formación de imágenes del núcleo. Se debe tener cuidado para realizar la técnica para evitar artihechos debido a la mala preparación de la muestra o pobre de captura de imagen. Una vez que la técnica se domina, estudios de la estructura y la dinámica de la proteína en pequeños organismos tales como bacterias se pueden realizar en la fluorescencia simple o multi-color.

Un número de diferentes tecnologías de imagen se han utilizado durante años para estudiar bacterias incluyendo varios electrónica y técnicas de microscopía óptica. Mientras microscopía electrónica ofrece una resolución extremadamente alta, hasta el nanómetro, la necesidad de un vacío y el uso de agentes de contraste ha limitado esta técnica para las muestras fijadas y embebidas. Los artefactos también pueden ser introducidos por una larga preparación de la muestra y se necesita un experto en la técnica para preparar las muestras, y para analizar e interpretar las imágenes resultantes. Microscopía óptica ofrece los beneficios de la simple preparación de la muestra y la aplicación de múltiples etiquetas con relativa facilidad en comparación con la microscopía electrónica. El uso de proteínas fluorescentes y conjugados de tinte, la posibilidad de estudiar las células vivas con un microscopio de fluorescencia también es posible. Con las mejoras en la estabilidad fluoróforo y proteína fluorescente tamaño / estructura que reduzca la toxicidad celular, así como los avances en la cámara de detección de tecnlogía, la microscopía de fluorescencia utilizando sistemas de imagen confocal de gran campo y se ha ampliado significativamente nuestra comprensión de la dinámica espacial de las células. Utilizando estas técnicas, nuestro conocimiento de la célula bacteriana en los últimos 20 años ha progresado en gran medida a una visión mucho más detallada que revela un alto nivel de organización estructural y de la proteína dentro de la célula bacteriana 1. Sin embargo, los métodos convencionales de microscopía óptica son de difracción limitada, lo que significa que la resolución inherente es aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz de excitación utilizado. Por consiguiente, incluso con el sistema de microscopía óptica convencional más óptima, la mejor resolución lateral es de aproximadamente 220-250 nm y la resolución axial es de aproximadamente 500 nm (para una revisión ver Schermelleh et al. 2). Para los biólogos de células bacterianas en particular, esto todavía limita seriamente nuestra comprensión de la organización espacial de estas células diminutas; siendo sólo 1-2 micras de diámetroeter y 1-10 micras de longitud. También existe la necesidad de técnicas de mayor resolución que se pueden realizar en las células vivas donde el comportamiento espacial dinámica de una proteína puede ser analizada para complementar los datos in vitro. Durante la última década, se han desarrollado varias técnicas de imagen de fluorescencia super-resolución. Super-resolución microscopía describe técnicas de imagen que por lo menos el doble de la resolución lateral se puede obtener con microscopía de luz convencional, superando así la barrera de difracción. Estas técnicas de manipular la iluminación y / o el análisis de la luz emitida para crear aumentos reales en la resolución aparente. Actualmente hay tres tipos principales de técnicas de super-resolución - i) estimuló la microscopía agotamiento de emisión 3 (STED); ii) la microscopía de una sola molécula de localización, incluyendo técnicas como la microscopía de localización fotoactivación 4,5 (PALMA), microscopía óptica reconstrucción estocástico <sarriba&gt; 6 (STORM), STORM directa 7 (dSTORM), y el agotamiento del suelo estatal con molécula individual de retorno 8 (GDSIM); y iii) microscopía de iluminación estructurada 9-12 (SIM). Técnicas de localización de una sola molécula ofrecen los mayores incrementos en la resolución lateral, frente a entre 10 a 40 nm en muestras biológicas. En muchas implementaciones de microscopía de localización de moléculas individuales, la profundidad de muestreo se limita a la onda evanescente y las implementaciones iniciales de STED también estaban limitados en la profundidad de muestreo. Mejoras Sin embargo, los avances recientes, como el uso de óptica adaptativa, la explotación del astigmatismo en la función de dispersión en diferentes puntos focales, detección multi-plano y el uso de dos objetivos para inferir la posición axial de la luz emitida se han visto tanto en el axial resolución y muestreo profundidades en tanto molécula STED y única localización 13,14. Tasas de adquisición de datos para STED y técnicas de localización de una sola moléculaTambién son relativamente lento debido a la gran cantidad de imágenes que necesitan ser adquiridos para la resolución máxima (hasta 50.000 para las técnicas de localización). Esta adquisición de datos es lenta no se presta a la obtención de imágenes de muestras vivas sin modificaciones personalizadas que son a menudo bastante caros. Estas dos técnicas son actualmente óptimamente adecuados para muestras fijas (para revisión ver 2,15), sin embargo, mucho se está trabajando para hacer frente a esta limitación. Tres dimensiones de la microscopía de iluminación estructurada (3D-SIM) es una técnica de campo amplio que mejora tanto la resolución lateral y axial resultante en las resoluciones de aproximadamente 110 y 280 nm, respectivamente. Profundidad de muestreo es de hasta 30 m desde el cubreobjetos, lo que permite formación de imágenes de células enteras. La variación de 3D-SIM desarrollado por Sedat, Agard, y en el Gustaffsson (OMX) Microscopio óptico plataforma eXperimental implican la iluminación de la muestra con un patrón de rejilla conocido que se mueve en 15 diferentesposiciones en cada plano z 11.9. Las franjas en los patrones de moiré resultantes que se crean en el espacio de frecuencia fuera de la región observable se miden. La información del espacio de frecuencia es computacionalmente reconstruido para generar una imagen visible de super-resolución 10,11. La velocidad relativa a la que las imágenes en bruto pueden ser adquiridos mediante esta técnica permite obtener imágenes de células vivas. Sin embargo, es importante señalar que para los procesos biológicos que se producen en una escala de tiempo de segundos, la tasa de adquisición de las imágenes en bruto es todavía demasiado lenta para capturar cambios dinámicos. Para series de tiempo con una velocidad de captura de segundos, la adquisición repetida sin suficiente tiempo de recuperación puede conducir a la fototoxicidad y fotoblanqueo, especialmente cuando se toman imágenes en directo de pequeñas células bacterianas. Para superar estos problemas, se han desarrollado los recientes avances para una rápida 3D-SIM (SIM-F3D). Aquí describimos una conocida como OMX Blaze 16 que era introduced a finales de 2011 Esta tecnología crea la iluminación modelado sin el uso de una rejilla física como se utiliza en los sistemas anteriores. El uso de haces de luz de interferencia y la nueva tecnología de obturación permite la creación de la luz modelada sobre la muestra de una manera muy rápida. La velocidad de adquisición de la imagen se mejora aún más con la introducción de científica semiconductor de óxido metálico complementario (sCMOS) cámaras, especialmente en comparación con las cámaras EMCCD existentes. Estos cambios dieron lugar a una posible tasa de adquisición de la imagen de un fotograma por segundo para una profundidad de muestreo de 1 m (512 x 512 píxeles, 9 z rebanadas), lo que permite el seguimiento de los cambios dinámicos dentro de las células que se producen dentro de 16 segundos. La disminución en la exposición (excitación) veces aparentes para vivir células utilizando este método permite que cualquiera de la serie de tiempo prolongado para ser capturado o un aumento en la tasa de captura. Aquí se describe la aplicación de la microscopía F3D-SIM para examine la estructura y el movimiento dinámico del anillo cytokinetic Z en las células de dos especies bacterianas: los organismo modelo de Bacillus subtilis en forma de varilla y el patógeno humano cocoides Staphylococcus aureus. FtsZ es una proteína del citoesqueleto-tubulina como que juega un papel clave en la división celular en bacterias 17,18. Se localiza en el sitio de división para reclutar al menos otras 20 proteínas de división, que forman el aparato de división de 17,18, y se cree que para proporcionar la fuerza de constricción de células 19-23. Este método revela que FtsZ se distribuye heterogéneamente alrededor del anillo Z en ambos organismos en una disposición de cordón; la solución del problema de larga data de si el anillo Z es un cinturón continuo y uniforme alrededor de la célula, como se visualizó por microscopía de fluorescencia de campo amplio convencional, o una estructura discontinua según lo sugerido por crio-tomografía de electrones (TEC) 24. Mostramos cómo la capacidad de 3D-SIM puede mejorar enormemente el examen espacial de pequeña (1diámetro m) células redondas como S. aureus que dividen en tres planos perpendiculares consecutivos (x, y, z). Estudios con lapso de tiempo utilizando estas técnicas muestran que la estructura del anillo Z es dinámica, con cambios brutos organización dentro del anillo, en lugar de moléculas de FtsZ en movimiento dentro y fuera de un andamio fijo 24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Agarose I (Biotecnology grade)</td>
			<td style="width:161px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">0710-500G</td>
			<td style="width:167px;">Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64)</td>
			<td style="width:161px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T-13320</td>
			<td style="width:167px;">Lipophylic dye used for staining cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">1.5 ml microtube, graduated Natural</td>
			<td>Scientific specialties Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1210-00</td>
			<td style="width:167px;">Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Luria broth base, Miller&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">241420</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions. Add 2%?? after autoclaving&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">210932</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Adhesive frame</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ABGAB-0577</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microscope cover glass</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">111512-9</td>
			<td style="width:167px;">22x22 No 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom</td>
			<td style="width:161px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:119px;">FD35-100</td>
			<td style="width:167px;">Known as FluoroDish with this company. Dish: &#216;35mm, Glass: &#216; 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0378-25G</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lincomycin hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L6004-5MU</td>
			<td style="width:167px;">Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Erythromycin&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Boehringer Mannheim GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12390120-14</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Combined Orbital/Linear Shaking waterbath&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Grant scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">OLS-200</td>
			<td style="width:167px;">Shaking speed used for cultures: 215 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">UV visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">UV-1601</td>
			<td style="width:167px;">600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415R</td>
			<td style="width:167px;">Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15502-10G</td>
			<td style="width:167px;">Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">softWoRx software</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;">version 5.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris data analysis software</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td>
			<td style="width:119px;">version 7.0.0</td>
			<td style="width:167px;">Matlab XTensions included</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Blaze module fitted on OMX V3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss Axioplan 2&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)

Obtención de imágenes de muestras biológicas utilizando microscopía de fluorescencia ha avanzado sustancialmente con las nuevas tecnologías para superar la barrera de resolución de la difracción de la luz permitiendo de super-resolución de muestras vivas. Actualmente hay tres tipos principales de técnicas de super-resolución - agotamiento emisión estimulada (STED), microscopía de localización de una sola molécula (incluyendo técnicas como la palma, TORMENTA, y GDSIM), y microscopía iluminación estructurada (SIM). Si bien las técnicas de localización STED y única molécula muestran los mayores incrementos en la resolución, que han sido más lentos para ofrecer mayores velocidades de adquisición de imágenes. SIM tridimensional (3D-SIM) es una técnica de microscopía de fluorescencia de campo amplio que ofrece una serie de ventajas con respecto a la localización tanto de una sola molécula y STED. Resolución se mejora, con las resoluciones típicas laterales y axiales de 110 y 280 nm, respectivamente y la profundidad de muestreo de hasta 30 m desde el cubreobjetos, lo que permiteobtención de imágenes de células enteras. Los avances recientes (rápida 3D-SIM) en la tecnología de aumento de la tasa de captura de imágenes en bruto permite la captura rápida de los procesos biológicos que ocurren en cuestión de segundos, al tiempo que reduce significativamente la foto-toxicidad y fotoblanqueo. Aquí se describe el uso de uno de tales métodos a la imagen las células bacterianas que albergan la proteína marcada con fluorescencia cytokinetic-FtsZ para mostrar cómo se analizan las células y el tipo de información única que esta técnica puede proporcionar.

En este estudio se visualizó la proteína de división celular bacteriana FtsZ, expresado en células vivas como una fusión-FtsZ GFP, para ilustrar las poderosas ventajas de F3D-SIM en microscopía de fluorescencia convencional para el estudio de la localización de proteínas bacteriana y la dinámica. FtsZ es una proteína del citoesqueleto-tubulina como que polimeriza en una estructura de anillo dinámico alrededor de la circunferencia de la célula. El anillo Z tiene una función importante en la división celular: su montaje marca la futura sede de la división, que recluta a todas las proteínas de la división celular a este sitio, y la constricción de anillo Z parece proporcionar la fuerza para permitir el movimiento hacia dentro de la envoltura celular durante la citocinesis 17 , 18. Cuando se visualizó por microscopía de fluorescencia de campo amplio convencional, el anillo Z aparece como una sola banda transversal de la fluorescencia en las bacterias en forma de barra, incluyendo los organismos más bien estudiadas, tales como B. subtilis (Figura 2A), &lt;em&gt; E. coli y C. Crescentus. Es importante destacar que la intensidad de fluorescencia a lo largo de esta banda parece ser más o menos uniforme, y el patrón de localización ofrece muy poca información sobre la organización estructural y la distribución de polímeros de FtsZ dentro del anillo Z. Cuando las mismas células se examinan mediante el método F3D-SIM se describe aquí (Figura 2B), sin embargo, las ventajas de esta técnica son inmediatamente evidentes. En primer lugar, la rotación de la imagen en 3D-SIM alrededor del eje z permite la visualización del anillo Z como una estructura de anillo genuina en un espacio tridimensional (Figuras 2C y 3A). Junto con el aumento en la resolución, esto revela que la distribución de FtsZ en el anillo Z es de hecho altamente heterogénea (Figura 3). La mejora en la resolución también nos permite ver los anillos Z que han iniciado el proceso de constricción para formar un tabique de división (indicado por la invaginación de la membrana celular en &lt;strong&gt; Figura 2C y 2D). Los ejemplos adicionales de B. anillos de Z subtilis visualizados mediante esta técnica se muestran en la Figura 3Bi - 3Biv e ilustran cómo la intensidad de fluorescencia alrededor del anillo Z nunca es el mismo. Por otra parte, las regiones de muy baja intensidad de fluorescencia se observan a menudo. Nos referimos a estas regiones como las lagunas (puntas de flecha blancas). Observamos estas brechas en el 15% de todos los anillos de Z examinadas (n = 84) y predominantemente en los anillos de Z con un diámetro de 800 a 900 nm (93%). Para cuantificar estas observaciones, las parcelas de intensidad 3D fueron creados del anillo Z y se muestran en la Figura 3Ci y 3CII usando los anillos Z mostradas en las Figuras 3Biii y 3Biv. Las parcelas de intensidad muestran que normalmente la cantidad de fluorescencia en el anillo Z puede variar hasta 3 - 4 veces en diferentes regiones del B. anillo Z subtilis. Además las parcelas intensidad 3D muestran que la gaps de la fluorescencia en el interior del anillo Z casi leer los niveles basales de fluorescencia de fondo (flecha negro en la figura 3Ci). Estos ejemplos anteriores muestran buenos reconstrucciones del anillo Z y dependen de suficiente luz que se emite desde la muestra sin photobleaching significativo. Esto se logra mediante el brillo de la fluoróforo GFP fusionada a FtsZ y su abundancia en la célula bajo estas condiciones (alta relación señal a ruido). En otras células, donde la relación señal a ruido es bajo la reconstrucción de la imagen es pobre. Para simular esta ocurrencia con FtsZ-GFP, la cantidad de señal de emisión obtenida de la B. subtilis células se redujo mediante la reducción de la energía de excitación. Como se muestra en la Figura 3D una reducción de 100 veces de los resultados de la energía de excitación en una imagen del anillo Z que tiene artefactos significativos. Esto se produce como consecuencia de la insuficiente contraste local entre la señal de FtsZ-GFP y el fondo que lleva a cacar reconstrucción de la imagen. Curiosamente, B. anillos de Z subtilis mostraron brechas más pronunciadas y la heterogeneidad en las regiones superior e inferior del anillo, pero no en los lados del anillo (Figura 3B). Esto ocurre debido a la diferencia en la resolución alcanzada por esta variación de 3D-SIM en el plano lateral con respecto al plano axial. Esto se traduce en las regiones superior e inferior del anillo Z (plano lateral) se va a examinar con la resolución óptima. Las lagunas en el anillo Z son demasiado pequeños para ser detectados en los lados del anillo Z como se visualiza en el plano axial, que tiene aproximadamente la mitad de la resolución del plano lateral. Las bacterias que tienen una morfología cocoides, tales como S. aureus, tiene anillos Z que se colocan en todos los planos. Así imagen del anillo Z cuando se encuentra en el plano lateral (o cerca de ella) proporciona la capacidad de la imagen de todas las regiones del anillo con la resolución óptima. Aprovechando esto, se analizó la estructura deel anillo Z en S. vivo células aureus, utilizando una cepa que contiene un plásmido de soporte de una fusión GFP-FtsZ. La producción de esta fusión está bajo el control de un promotor inducible P spac (ver paso 1.2.1). Cuando fotografiado con en el plano axial, S. anillos de Z aureus parecía idéntica a B. Z subtilis anillos que están presentes en el mismo plano (Figura 4ai). Sin embargo, los anillos de imágenes Z en el plano lateral confirmaron que todo el anillo Z apareció tanto como bead-y heterogénea. Alrededor del 26% de estos anillos también mostró al menos una &quot;brecha&quot; visible de fluorescencia (Figura 4Aii, 4B). Similar a B. subtilis FtsZ, parcelas de intensidad de fluorescencia muestran que la intensidad de fluorescencia en el anillo Z varía tanto como 4 - 6 veces en diferentes áreas de la S. aureus Z anillo (Figura 4C). La longitud y anchura de las perlas se pueden medir (consulte esquemática en la Figura 4D). Esto demostró que el 80% de los anillos de Z (n = 43) que se examinaron tenía una longitud de cordón de 200 nm, alcanzando una longitud máxima de 400 nm. La anchura de los granos, por otra parte, mide hasta 200 nm. Hubo un promedio de 12 ± 2 (SEM) cuentas FtsZ por anillo Z. Se observó datos de localización similares cuando FtsZ nativa se visualizó con estos métodos utilizando microscopía de inmunofluorescencia (IFM) que muestran que este patrón de localización heterogénea y de cordón era genuino y no un artefacto causado por la expresión de FtsZ-gfp además de FtsZ nativa (datos no se muestra). Este avance de 3D-SIM es capaz de demostrar que el anillo Z aparece como una estructura heterogénea y es posiblemente discontinua en la naturaleza. Para abordar la cuestión de cómo esta estructura de anillo Z heterogénea sufre constricción y facilita la división celular, un time-lapse análisis de la dinámica del anillo Z se puede realizar. Uno de los principales retos conestudios de time-lapse microscopía de fluorescencia es en la minimización de fotoblanqueo muestra y fototoxicidad durante la exploración. 3D-SIM requiere un gran número de imágenes en bruto que se obtiene lo que significa que photobleaching de una muestra con el tiempo resultará en una mala relación señal-ruido de la señal que conduce a insuficiente para permitir reconstrucciones imagen correspondiente. La aplicación de la nueva tecnología minimiza la cantidad de energía de excitación utilizada en cada exposición y por lo tanto una disminución en la energía que entra en las células vivas. Esto se hace mediante una combinación de interferometría haz de luz para crear el patrón estructurado sobre la muestra y el uso de cámaras CMOS científicos que aumentan la sensibilidad y la eficiencia cuántica. Esta combinación resulta en la adquisición z-pila de 1 m por segundo (512 × 512 pixels x 8 z rodajas) en comparación con 1 m por 5-8 seg (512 x 512 pixels x 8 rebanadas z) obtenido con nuestra iteración anterior de 3D-SIM (descrito en Riglar et al. 26).Disminuir el tiempo de adquisición de imágenes y ajustes de exposición también puede ayudar a minimizar la fototoxicidad de células vivas que es particularmente relevante en los estudios de time-lapse. La nueva tecnología se presenta aquí también aborda otro problema en imágenes de células vivas que nos referimos como &quot;motion blur&quot;, que en este contexto se refiere a la localización de las proteínas que cambian durante la adquisición de imágenes. Al disminuir el tiempo de adquisición de la imagen de la cantidad de &quot;motion blur&quot; se minimiza creando así una reconstrucción de la imagen más precisa. Estudios anteriores que han abordado cómo FtsZ se organiza en el anillo Z no han sido capaces de mostrar cómo la estructura de anillo Z cambia con el tiempo. Para investigar este aspecto se realizó un lapso de tiempo utilizando F3D-SIM. Esta adquisición permitido de una imagen 3D-SIM del anillo Z en B. subtilis cada 5-10 segundos durante un período de 50 segundos, que anteriormente no era posible en esta escala de tiempo. Se muestra en la figura 5A es una example de los rápidos cambios en la distribución de FtsZ en el anillo Z con el tiempo (diámetro de 890 nm). Otros anillos Z que eran visiblemente en el proceso de constricción también mostraron tener una dinámica similar que afectaron a la distribución de FtsZ alrededor del anillo Z (no mostrados). Parcelas de intensidad 3D también se pueden generar para cada uno de los puntos de tiempo para cuantificar y valorar los cambios de intensidad de fluorescencia continua y de este modo la abundancia relativa de FtsZ en diferentes regiones del anillo Z en una escala de tiempo de segundos (Figura 5B). Las regiones de interés pueden ser identificados a partir de estas parcelas de intensidad para realizar un seguimiento de las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia (Figura 5C). El seguimiento de estos cambios en la estructura de anillo Z en estas condiciones sería prácticamente imposible sin la tecnología F3D-SIM avanzada. Además, este trabajo reveló que en S. aureus el movimiento dinámico de FtsZ es similar a la observada en B. subtilis. S. células aureus RN4220 producing FtsZ-GFP fueron imágenes de 50 segundos a 10 segundos intervalos de tiempo. Cambios a la heterogeneidad del anillo Z en S. aureus con F3D-SIM también fueron similares a B. subtilis (ver puntas de flecha y flechas en la Figura 6). Estos estudios de lapso de tiempo apoyan un modelo de constricción del anillo Z (el modelo de pellizco iterativo) que se predijo a través del examen de C. fijo células crescentus, pero no se pudo demostrar, debido a la necesidad de examinar la dinámica del anillo Z en células vivas 27. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. esquemática de la configuración óptica de la F3D-SIM utilizada en este estudio. La luz del láser de la tabla de láser se dirige a través de una fibra de SIM a un lente de colimación y se fija rejilla, a continuación, en el módulo de control de fase que crea tanto la longitud de onda específica espaciamiento óptimo of las vigas ± 1 ° de orden de la viga central de orden cero y los saltos de fase para la recogida SIM. Los haces entonces entran en el módulo de control de ángulo donde los haces se reflejan a los 3 grupos diferentes para crear los 3 ángulos de iluminación. Las vigas entran entonces en el microscopio y trayectoria de la luz, como se muestra (Modificado con permiso de Paul Goodwin, API). <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2: Comparación de la fluorescencia de campo amplio convencional y las imágenes 3D-SIM de B. subtilis células que expresan FtsZ-GFP. (A) en todo el ámbito convencional de imágenes de fluorescencia de B. subtilis células que expresan FtsZ-gfp (SU570; verde) en una sola copia también se tiñeron con el colorante de la membrana FM4-64 (rojo). Barra de escala = 5 m. La imagen se adquirió usando un microscopio de fluorescencia en posición vertical.(B) de imágenes 3D-SIM de la misma B. cepa subtilis expresar FtsZ-GFP, se tiñeron con FM4-64. Las regiones de interés de la imagen se pueden seleccionar (cuadro de líneas discontinuas) para acercar la imagen. La imagen también se puede girar alrededor del eje z para ver anillos 3D FtsZ en el plano axial. (C, D) La eliminación de Fuera de la enfocar la luz y una mejor resolución de imagen proporcionado por 3D-SIM permite una visualización clara de los anillos de Z (incluidos los que se constriñe) y la membrana interna de la célula durante la división (indicado por flechas blancas). Tenga en cuenta que el texto protocolo describe la visualización de un solo fluoróforo. Sin embargo, el procedimiento puede ser adaptado para la adquisición de hasta cuatro longitudes de onda diferentes al mismo tiempo. Esta cifra se ha reproducido de Strauss et al 16. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Imágenes representativas del anillo Z en células bacterianas en forma de barra en vivo (B. subtilis) expresando FtsZ-GFP usando 3D-SIM. (Ai) El anillo Z se observa como una banda de fluorescencia perpendicular al eje longitudinal de la célula que está en el plano xy. (Aii) La imagen se ha girado alrededor del eje x z usando software de visualización 3D Imaris (consulte protocolo paso 6.1) de modo que uno está mirando a través de la estructura de anillo para ver claramente cómo FtsZ se distribuye dentro del anillo Z. Esta imagen, ahora en el plano zx muestra que el anillo tiene una distribución heterogénea de FtsZ con las regiones de ninguna o muy poca fluorescencia (puntas de flecha blancas). La imagen debe ser girado para observar estas regiones &quot;brecha&quot; de la fluorescencia. Bi-Biv muestran otros ejemplos de anillos Z rotados que ahora se encuentran en el plano ZX. Anillos de Z en (Bi-iii) tiene un diámetro de ~ 0,9 m. (Biv) muestra un anillo de Z con un diámetro de ONLy 0,65 m de someterse a las diferencias en FtsZ-GFP alrededor del anillo Z tiene un diámetro de 0,85 m (consulte los pasos 6.1 a 6.3 protocolo) constricción. (Ci) Este perfil de intensidad típica 3D ilustra la intensidad de fluorescencia (es decir, concentración). El nivel de fluorescencia en estas lagunas es baja y se acerca niveles de fluorescencia de fondo (flecha negro). (CII) un perfil de intensidad 3D similar de un anillo Z en el proceso de la constricción. Concentración FtsZ-GFP es también no uniforme; de diámetro, 0,65 m. Los paneles A, B, CI y CII se han reproducido de Strauss et al 16. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. imágenes Representante 3D-SIM de S. células aureus productores de FtsZ-GFP. Puesto que estas células son redondas (cocos), el anillo Z se have diversas orientaciones. Las células que muestran una banda de fluorescencia en la orientación de la visión normal (es decir, en el plano xy) como se muestra en (Ai), son muy similares a los de las células con forma de bastón cuando se hace girar alrededor del eje Z como para la Figura 1Ai. En (Aii) el anillo Z ya está en el plano xy; la orientación y la resolución lateral es máxima en todo el anillo que da ahora una estructura de cordón (B). (C) Una parcela intensidad 3D de la abundancia relativa de FtsZ-GFP en el anillo Z. (D) Representación esquemática de la S . anillo Z aureus. Las flechas rojas indican la longitud del talón y dimensiones de anchura (consulte paso protocolo 6.1). Esta cifra ha sido modificado de Strauss et al 16. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig5highres.jpg" width="500" /> &lt;strong&gt; Figura 5. F3D-SIM permite el análisis rápido de FtsZ localización en el tiempo en 3D-SIM. (A) Los cambios en la distribución de FtsZ-GFP dentro del anillo Z en forma de varilla B. subtilis células se pueden visualizar para indicar la dinámica del anillo. Tiempo (seg) se indica en la esquina superior izquierda de cada imagen. (B) parcelas de intensidad de fluorescencia 3D muestran la no uniforme y la distribución dinámica de FtsZ en el anillo Z. (C) de dinámica de FtsZ (FtsZ-GFP cambios de fluorescencia en el anillo) también puede ser examinada con más detalle mediante la cuantificación de la intensidad de fluorescencia con el tiempo en dos regiones de interés. Esta cifra se ha reproducido de Strauss et al 16. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. F3D-SIM imágenes time-lapse muestran cambios en FtsZ localización dentro del anillo con el tiempo en S. unureus. Una punta de flecha blanca indica una brecha cuando se detectó inicialmente en el anillo Z. La aparición y desaparición de las brechas en la misma posición (como marcado por la punta de flecha blanca) con el tiempo FtsZ ilustra cómo se redistribuye alrededor del anillo Z. Las flechas blancas indican la formación de lagunas en el anillo Z en momentos posteriores. Tiempo (s) se muestra en la parte superior izquierda de las imágenes. Esta cifra ha sido modificado de Strauss et al 16.

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Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-resolución de imagen del anillo Z cytokinetic en bacterias vivas Utilizando 3D-estructurado Fast Iluminación Microscopía (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

19.8K vistas.  University of Technology, Sydney. Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring. 

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Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualización de las bacterias en los nematodos mediante microscopía de fluorescencia

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Investigación

Biología

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-resolución de imagen de la maquinaria de división bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

La proyección de imagen de resolución súper Estado de agotamiento de la tierra en células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Aplicación de la microscopía de resolución súper alta velocidad velocidad en vivo cilio primario

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Etiquetado específico de nucleoides mitocondriales para microscopía de iluminación estructurada de lapso de tiempo

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...