Reconocemos la financiación del programa de la Oficina Nacional de Medición del Reino Unido y Metrología Química Biológica. Damos las gracias a Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi y Eric Rees consejos técnicos y sugerencias. Agradecemos a Miklos Erdelyi, Eric Rees y Max Ryadnov útil para los comentarios y discusiones sobre este manuscrito.

No tenemos nada que revelar.

Se demuestra con algunas muestras de prueba simples y la libre disposición de procesamiento temporal de lluvia software es posible optimizar STORM imágenes de super-resolución. Estas herramientas y métodos proporcionarán puntos de partida útiles para los nuevos usuarios y los modos para los usuarios con experiencia para aumentar la confianza en sus microscopios y su uso de ellos para estudiar las estructuras biológicas y celulares con un detalle sin precedentes. Mediante el uso de una combinación de muestras con estructuras conocidas o bien entendidas y un algoritmo que puede producir una serie de indicadores de calidad de imagen de utilidad, como las estimaciones de precisión media, el número de localización e histogramas mostrando que es posible mejorar la calidad de la imagen y para tener una mayor confianza en el proceso de formación de imágenes TORMENTA. No hay una talla única aproximación a la adquisición de los datos, ya que hay un número de diferentes configuraciones de microscopio comerciales y de construcción propia que se puede utilizar. Por otra parte, hay muchos de preparación y de imágenes de ejemplo pasos de adquisición que puede influirEnce la imagen final, por tanto, contar con herramientas de software y muestras de prueba es fundamental para la comprensión y la optimización de la calidad de imagen TORMENTA. Además, estos protocolos pueden proporcionar formas útiles y menos ambiguas de la solución de cualquier problema que pueda surgir. Por ejemplo, la muestra de dextrano es una manera muy útil para identificar si hay cualquier desalineación del haz láser o iluminación desigual de la muestra. Si existen dudas de que el búfer de conmutación puede no estar funcionando una prueba visual muy simple para ver si hay alguna &#39;parpadear&#39; ayudará. Los filamentos de actina son una forma útil de medir la resolución utilizando comparaciones FWHM así como destacar la deriva y mislocalization artefactos. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que a medida que los métodos de super-resolución basada en la localización puede ser la densidad fluoróforo sensible, a pesar de los otros factores que contribuyen, como los tiempos de exposición, velocidades, potencias de láser y la forma en que la imagen se procesa, es imposible asignar una resolución para unparticular, microscopio y asumir que todas las imágenes tengan esa resolución. Lo que es posible, sin embargo, es la medición de diversos aspectos de la resolución, como precisiones de localización media, número de la localización y de la deriva 27. Incluso si los marcadores de referencia no se pueden incorporar en cada experimento que pueden, al menos, ser utilizado para caracterizar un sistema de microscopio, su entorno y comprender mejor las consideraciones operativas, tales como cómo se requiere mucho tiempo para alcanzar el equilibrio térmico después del arranque. Además de la corrección de la deriva lateral, marcadores de referencia pueden ser utilizados para caracterizar y corregir la deriva axial, aunque esto requiere el uso de una lente astigmática y un mecanismo de retroalimentación para corregir la posición de la muestra, mientras que las imágenes están siendo adquiridas 43. Sistemas de super-resolución comerciales por lo general incluirán algún tipo de control de estabilidad o de bloqueo de enfoque mecanismo, que puede ser una solución más práctica para corregir el enfoque deriva. Hay unre alternativas a recubrir de forma no específica el cristal con dextrano, tales como el uso de colorantes directamente u otras moléculas conjugadas, tales como anticuerpos secundarios. Una limitación de estos enfoques es que el número de moléculas unidas al vidrio no se conoce. Estructuras filamentosas alternativos que se han utilizado incluyen los microtúbulos 28 y el ADN 21. Sin embargo, la combinación de muy pequeño tamaño y convenientes reactivos disponibles comercialmente hacer actina una alternativa atractiva, especialmente en lo que la distancia de separación de los filamentos divergentes o ramificados que también puede ser una medida útil de rendimiento del sistema 27. Hay espacio para un mayor desarrollo de las muestras de ensayo, a pesar de los recientes avances en esta área 28,29,46,47. En particular, formación de imágenes de varios colores presenta un número de retos en todos los 3 aspectos principales de la formación de imágenes, el etiquetado de la muestra, de adquisición de imágenes (de hardware), y el software (procesamiento de imágenes y la alineación). Ha sido ununa serie de publicaciones que abordan estos aspectos 4-6 y por lo tanto, está claro que las muestras y los métodos de prueba apropiados son fundamentales para generar e interpretar con fiabilidad de este tipo de imágenes. De hecho, recientemente se ha demostrado que dSTORM se podría utilizar para tomar dos imágenes en color de, y resolver, la naturaleza altamente simétrico del complejo del poro nuclear y los autores sugirieron que esto sería una forma ideal para evaluar el desempeño de las correcciones de aberración cromática 45. Otro enfoque interesante es el uso de origami de ADN para crear un nanoruler, lo que crea la posibilidad de fluoróforos posicionamiento a distancias específicas sub-difracción de distancia 46. Esto proporciona una manera de evaluar la resolución y haciendo mediciones de distancia. Sin embargo, el objetivo final es aplicar estas técnicas de super-resolución para muestras no idealizados, como las células, que son estructuras tridimensionales complejas. En este caso, una combinación de comprensión más completa de Tque técnica combinada con herramientas de software que ayudan al usuario en la adquisición de datos, su procesamiento de manera apropiada, y proporcionar mediciones de la imagen es probable que sea la última respuesta. 28,29,47,48

Recientemente se han desarrollado una serie de técnicas de microscopía óptica, normalmente se conoce como microscopia de super-resolución o nanoscopía, que puede pasar por alto el límite de difracción y generar imágenes con resoluciones de 100 nm o mejor 1,2. Desde el anuncio de super-resolución de la microscopía como el método de Nature Methods del año en 2008, ha habido un gran desarrollo de los microscopios basados ​​en la localización. Por ejemplo, hay aplicaciones multi-color de 3-6, 7-12 implementaciones 3D, y aplicaciones de células incluso en vivo 5,13-17. Por otra parte, ya que estos sistemas están siendo comercializados y ahora están haciendo su manera de salir de los laboratorios de óptica en manos de los biólogos celulares no es probable que sea un nuevo aumento en su uso y aplicación a las cuestiones biomédicas. Una rama de esta familia son los métodos basados ​​en la localización que trabajan por la construcción de una molécula de molécula-por-imagen. Yoorden n para hacer esto, la mayoría de las moléculas fluorescentes dentro de la muestra se debe desconectar de manera que sólo unas pocas moléculas separadas espacialmente-están activos en un momento dado. Estas moléculas se conmutan a continuación, rápidamente del apagado y se toman muchas imágenes de manera que una parte significativa de la población se forma la imagen para reflejar la estructura subyacente con precisión de sub-difracción. Un número de enfoques han sido publicados incluyendo GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, STORM 21 y RESOLFT 22. Los algoritmos que miden la posición de una sola molécula de detección se pueden utilizar para localizar la posición real de la molécula con precisiones mejores que 20 nm utilizando apropiado gaussiana 23, por ejemplo rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, palm3d 12 y tormenta de lluvia 27. Cuando imágenes de células u otras muestras biológicas, que tienen una alta densidad de molécula, que por lo tanto es necesario tener muchos miles de marcos deEl parpadeo, espacialmente separada, de la señal con el fin de imagen una proporción significativa de las moléculas marcadas. Microscopía estocástico reconstrucción óptica (TORMENTA) y el dSTORM altamente relacionados y métodos GSDIM son métodos de super-resolución basada en la localización, que se han demostrado para trabajar con tintes orgánicos disponibles en el mercado 21. Desde entonces, han demostrado ser aplicable a un número de diferentes colorantes 28-30, lo que hace que la metodología particularmente atractiva debido a la especificidad y la comodidad relativa de enfoques immunolabeling bien establecidos para llevar a cabo la microscopía de fluorescencia. En consecuencia, no es fácil acceso a una amplia gama de conjugados colorante-anticuerpo-colorante y biomolécula, que tienen el potencial de ser utilizado en formación de imágenes de super-resolución basada en la localización. Mientras que los principios generales de la tormenta y enfoques similares son relativamente simples, ya primera vista la preparación del hardware y de la muestra parecen relativamente straightforward, hay una serie de pasos en el proceso que son críticos para el logro de alta calidad, libres de artefactos, imágenes de super-resolución. Al igual que con todas las técnicas de microscopía el proceso se puede considerar en 3 pasos principales: primero, la preparación de muestras, segundo, la adquisición de imágenes y, tercero, procesamiento de imágenes y / o análisis de imágenes y la interpretación. El poder de resolución adicional y método de generación de imágenes de super-resolución utilizando un enfoque basado en la localización introduce algunos nuevos problemas y consideraciones 31-33. A partir de la preparación de la muestra, cuando se realiza inmunomarcaje, particularmente inmunofluorescencia indirecta cuando se utiliza una combinación de anticuerpos primaria y secundaria, hay que señalar que el colorante fluorescente puede ser de hasta 20 nm de distancia de la molécula de interés. En el caso de los microtúbulos, esto se traduce en diámetros de 35-50 nm en comparación con un diámetro de microtúbulos esperado de 25 nm 28,30. Además, la densidad de etiquetado debe mEEG, el criterio de Nyquist a fin de generar una imagen de alta calidad 14. Por ejemplo, para una resolución de imagen prevista de 20 nm a lo largo de una estructura filamentosa no debe haber una molécula de colorante por lo menos cada 10 nm 27. Mientras que muchos colorantes se han publicado a trabajar para los enfoques basados ​​en la localización de los resultados globales del colorante es una mezcla de por lo menos cuatro criterios importantes, a saber, los fotones detectados por evento de conmutación (el brillo de cada parpadeo - más brillante es mejor), el equilibrio en -off ciclo de trabajo (la relación de contraste de tintes en el off contra el Estado - más fuera es generalmente mejor), la fracción de supervivencia (una tasa de blanqueo bajo es mejor) y el número de ciclos de conmutación (el número de parpadeos por fluoróforo - más es mejor para alta resolución, aunque 1 parpadeo por fluoróforo puede ser una ventaja para los propósitos de recuento de molécula). La situación se complica aún más por el hecho de que estas propiedades para cualquier tinte dado pueden variar en diferentes condiciones de tampón ycon 28,29 potencia del láser. Además, así como estas consideraciones STORM únicas, la calidad de imagen puede mejorarse mediante la optimización de la preparación de muestras de la misma manera como técnicas de microscopía de fluorescencia más tradicionales, por ejemplo, reduciendo al mínimo la autofluorescencia por modificación de las condiciones de fijación y el uso de reactivos de enfriamiento. También, minimizando fluoróforos unidos de forma no específica es importante, lo que puede hacerse mediante el ajuste de las concentraciones de etiquetas, los tiempos de incubación y etapas de bloqueo y lavado. El segundo paso de adquisición de la imagen también es crítica. Los ajustes óptimos en el microscopio dependerán del colorante, condiciones de tampón, la densidad de etiquetado, y el tipo de muestra, por ejemplo, monocapas sobre el vidrio, células o muestras de tejido. Las principales consideraciones son el tiempo de exposición de la cámara, número de cuadro, ángulo de iluminación (TIRF, HILO, Epi) y la potencia del láser. El objetivo es recoger la mayor cantidad de brillantes parpadeos separados espacialmente lo más rápido posible. Si el fondo is muy altos o los parpadeos no son muy brillantes, en otras palabras, la relación señal a ruido es pobre, el algoritmo de reconstrucción no será capaz de localizar las posiciones con la mayor precisión. Así como maximizar la precisión de localización, es decir, la precisión con la posición de cada molécula se puede medir, calidad de la imagen depende también de un elevado número de localizaciones. Si son expuestas un número insuficiente de las moléculas de interés, ya sea debido a la falta de etiquetado de eficiencia, fotoblanqueo excesiva o un número de cuadro inadecuada, entonces la imagen de super-resolución resultante será punteada y discontinua ya que no se han cumplido los criterios de Nyquist 14,27 . Y, por último, el tercer paso, el procesamiento de imágenes, es particularmente importante en comparación con técnicas de microscopía de fluorescencia estándar. Hay una variedad de forma libre y comercialmente disponibles algoritmos, que es a la vez una ventaja, en términos de elección, y una desventaja, ya que puede ser confuso saber which es el más apropiado para usar. Si, por ejemplo, los datos en bruto tiene bien espaciados espacialmente distintas parpadea entonces un algoritmo de ajuste de una sola molécula puede ser muy precisa y eficiente, por ejemplo, por los algoritmos de ajuste escasos disponibles en Rainstorm 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 y el software QuickPALM 26 . Si los datos en bruto contiene una gran cantidad de superposición de señales a continuación algoritmos que pueden ser más apropiado incluir DAOSTORM 34, 35 y 3B deconSTORM 36. Por otra parte, estos algoritmos contienen umbrales para diversos criterios tales como recuentos de señal, o fotones por abrir y cerrar, así como distintas opciones de visualización de imágenes diferentes, tales como la visualización con funciones gaussianas suavizadas o como histogramas con rejillas de píxel, donde el tamaño de píxel de super-resolución puede ser seleccionado por el usuario. Todas estas opciones de cambiar el aspecto de la imagen final y tienen implicaciones para la interpretación y análisis de imágenes. <p class="jove_content"&gt; Por lo tanto, presentamos 3 muestras de prueba que constituya el nuevo usuario con un punto de partida para los experimentos a base de colorantes basados ​​en localización de super-resolución, que en aras de la claridad, nos referiremos como tormenta, y los usuarios más experimentados, la oportunidad de optimizar aún más sus experimentos. En primer lugar, es posible recubrir la superficie de vidrio con una capa fluorescente de dextrano-colorante conjugado. Esto proporciona una forma rápida y simple para establecer que el microscopio, tinte y tampón están trabajando para generar el parpadeo de la señal fluorescente. El método puede ser extendido mediante la comparación de las métricas media de precisión de localización y número generados por temporal de lluvia para optimizar las condiciones de tampón, la configuración de adquisición de imágenes y probar diferentes tintes. En segundo lugar, se presenta un protocolo sencillo para la preparación de los filamentos de actina en el vidrio que puede ser etiquetada fácilmente utilizando conjugados phalloidin-dye. Estos proporcionan estructuras ideales para tomar mediciones de la resolución 27 y por lo general el ancho medio máximo (FWHM)de un filamento se da como una estimación empírica de la resolución 37. Cabe señalar que la resolución varía entre las muestras y entre las imágenes dentro de la misma muestra porque la resolución en super-resolución de la microscopía basada en la localización es una función del brillo fluoróforo, ruido de fondo y la densidad de localización 27 y estos no son necesariamente constantes en todo el espécimen. Los filamentos de actina se utilizan para demostrar posibles artefactos tales como mislocalizations y la deriva y cómo pueden ser identificadas con las características del software dentro de tormenta. Por otra parte, se describe el uso de marcadores de referencia fluorescentes tanto a medida y la deriva correcta. Y en tercer lugar, se describe la tinción de las células con factor de crecimiento epidérmico (EGF) conjugados de tinte. EGF proporciona un indicador útil de la calidad de la imagen de super-resolución, porque una proporción del receptor en la superficie celular experimenta endocitosis a través de vesículas, que son estructuras de tamaño sub-difracción de aproximadamente 50-150 Nm de diámetro 27,38,39.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labtek Imaging chamberglass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CBR-166-390E</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF Objective Lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>640 nm laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iBEAM-SMART-640-S</td>
			<td>*150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>*Acquisition software (controlling hardware)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>Dell</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Image analysis and processing <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rainSTORM</td>
			<td>Laser Analytics Group (Cambridge) software</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Running rainSTORM</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Example of self-built STORM/PALM microscopes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Also see reference 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Materials &amp; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX70013065</td>
			<td>1; 2; 3; 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td>1.1; 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-22914</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General actin buffer</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>BSA01</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preformed-actin filaments</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>AKF99</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phallodin-Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres (0.1 micron)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-7279</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX31966021</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX10500064</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Step</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dishes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>734-0006</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF - Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E35351</td>
			<td>4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>4.3, 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde - 10% solution EM grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>04018-1</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C100</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4706</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93352</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7528</td>
			<td>5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6500</td>
			<td>5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2289</td>
			<td>5.1; 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Reagents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

test samples for optimizing storm super-resolution microscopy

STORM es una técnica de microscopia de super-resolución de reciente desarrollo con hasta 10 veces mejor resolución que las técnicas de microscopía de fluorescencia estándar. Sin embargo, como la imagen se adquiere de una manera muy diferente de lo normal, mediante la creación de una molécula de molécula-por-imagen, hay algunos desafíos significativos para los usuarios para tratar de optimizar su adquisición de la imagen. Con el fin de ayudar a este proceso y obtener una visión más clara de cómo funciona STORM presentamos la preparación de 3 muestras de prueba y la metodología de adquisición y procesamiento de imágenes STORM super-resolución con las resoluciones típicas de entre 30 a 50 nm. Mediante la combinación de las muestras de ensayo con el uso del software de procesamiento de tormenta libremente disponible, es posible obtener una gran cantidad de información acerca de la calidad y la resolución de la imagen. El uso de estos indicadores es entonces posible para optimizar el procedimiento de imagen de la óptica, para la preparación de muestras, selección de colorantes, condiciones del tampón y los ajustes de adquisición de imágenes. Tenemos unmuestran ejemplos de lso de algunos problemas comunes que dan lugar a la mala calidad de imagen, como la deriva lateral, donde los movimientos de la muestra durante la adquisición de imágenes y la densidad relacionadas problemas derivados del fenómeno &#39;mislocalization&#39;.

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Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Se describe la preparación de tres muestras, y cómo pueden ser utilizados para optimizar y evaluar el desempeño de los microscopios TORMENTA. El uso de estos ejemplos nos muestran la forma de adquirir los datos en bruto y luego procesarla para obtener imágenes de super-resolución en las células de aproximadamente 30 a 50 nm de resolución.

Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

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JoVE Journal

Biology

30.9K vistas.  National Physical Laboratory.  Se describe la preparación de tres muestras, y cómo pueden ser utilizados para optimizar y evaluar el desempeño de los microscopios TORMENTA. El uso de estos ejemplos nos muestran la forma de adquirir los datos en bruto y luego procesarla para obtener imágenes de super-resolución en las células de aproximadamente 30 a 50 nm de resolución. 