Reconocemos la financiación del programa de la Oficina Nacional de Medición del Reino Unido y Metrología Química Biológica. Damos las gracias a Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi y Eric Rees consejos técnicos y sugerencias. Agradecemos a Miklos Erdelyi, Eric Rees y Max Ryadnov útil para los comentarios y discusiones sobre este manuscrito.

No tenemos nada que revelar.

Se demuestra con algunas muestras de prueba simples y la libre disposición de procesamiento temporal de lluvia software es posible optimizar STORM imágenes de super-resolución. Estas herramientas y métodos proporcionarán puntos de partida útiles para los nuevos usuarios y los modos para los usuarios con experiencia para aumentar la confianza en sus microscopios y su uso de ellos para estudiar las estructuras biológicas y celulares con un detalle sin precedentes. Mediante el uso de una combinación de muestras con estructuras conocidas o bien entendidas y un algoritmo que puede producir una serie de indicadores de calidad de imagen de utilidad, como las estimaciones de precisión media, el número de localización e histogramas mostrando que es posible mejorar la calidad de la imagen y para tener una mayor confianza en el proceso de formación de imágenes TORMENTA. No hay una talla única aproximación a la adquisición de los datos, ya que hay un número de diferentes configuraciones de microscopio comerciales y de construcción propia que se puede utilizar. Por otra parte, hay muchos de preparación y de imágenes de ejemplo pasos de adquisición que puede influirEnce la imagen final, por tanto, contar con herramientas de software y muestras de prueba es fundamental para la comprensión y la optimización de la calidad de imagen TORMENTA. Además, estos protocolos pueden proporcionar formas útiles y menos ambiguas de la solución de cualquier problema que pueda surgir. Por ejemplo, la muestra de dextrano es una manera muy útil para identificar si hay cualquier desalineación del haz láser o iluminación desigual de la muestra. Si existen dudas de que el búfer de conmutación puede no estar funcionando una prueba visual muy simple para ver si hay alguna &#39;parpadear&#39; ayudará. Los filamentos de actina son una forma útil de medir la resolución utilizando comparaciones FWHM así como destacar la deriva y mislocalization artefactos. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que a medida que los métodos de super-resolución basada en la localización puede ser la densidad fluoróforo sensible, a pesar de los otros factores que contribuyen, como los tiempos de exposición, velocidades, potencias de láser y la forma en que la imagen se procesa, es imposible asignar una resolución para unparticular, microscopio y asumir que todas las imágenes tengan esa resolución. Lo que es posible, sin embargo, es la medición de diversos aspectos de la resolución, como precisiones de localización media, número de la localización y de la deriva 27. Incluso si los marcadores de referencia no se pueden incorporar en cada experimento que pueden, al menos, ser utilizado para caracterizar un sistema de microscopio, su entorno y comprender mejor las consideraciones operativas, tales como cómo se requiere mucho tiempo para alcanzar el equilibrio térmico después del arranque. Además de la corrección de la deriva lateral, marcadores de referencia pueden ser utilizados para caracterizar y corregir la deriva axial, aunque esto requiere el uso de una lente astigmática y un mecanismo de retroalimentación para corregir la posición de la muestra, mientras que las imágenes están siendo adquiridas 43. Sistemas de super-resolución comerciales por lo general incluirán algún tipo de control de estabilidad o de bloqueo de enfoque mecanismo, que puede ser una solución más práctica para corregir el enfoque deriva. Hay unre alternativas a recubrir de forma no específica el cristal con dextrano, tales como el uso de colorantes directamente u otras moléculas conjugadas, tales como anticuerpos secundarios. Una limitación de estos enfoques es que el número de moléculas unidas al vidrio no se conoce. Estructuras filamentosas alternativos que se han utilizado incluyen los microtúbulos 28 y el ADN 21. Sin embargo, la combinación de muy pequeño tamaño y convenientes reactivos disponibles comercialmente hacer actina una alternativa atractiva, especialmente en lo que la distancia de separación de los filamentos divergentes o ramificados que también puede ser una medida útil de rendimiento del sistema 27. Hay espacio para un mayor desarrollo de las muestras de ensayo, a pesar de los recientes avances en esta área 28,29,46,47. En particular, formación de imágenes de varios colores presenta un número de retos en todos los 3 aspectos principales de la formación de imágenes, el etiquetado de la muestra, de adquisición de imágenes (de hardware), y el software (procesamiento de imágenes y la alineación). Ha sido ununa serie de publicaciones que abordan estos aspectos 4-6 y por lo tanto, está claro que las muestras y los métodos de prueba apropiados son fundamentales para generar e interpretar con fiabilidad de este tipo de imágenes. De hecho, recientemente se ha demostrado que dSTORM se podría utilizar para tomar dos imágenes en color de, y resolver, la naturaleza altamente simétrico del complejo del poro nuclear y los autores sugirieron que esto sería una forma ideal para evaluar el desempeño de las correcciones de aberración cromática 45. Otro enfoque interesante es el uso de origami de ADN para crear un nanoruler, lo que crea la posibilidad de fluoróforos posicionamiento a distancias específicas sub-difracción de distancia 46. Esto proporciona una manera de evaluar la resolución y haciendo mediciones de distancia. Sin embargo, el objetivo final es aplicar estas técnicas de super-resolución para muestras no idealizados, como las células, que son estructuras tridimensionales complejas. En este caso, una combinación de comprensión más completa de Tque técnica combinada con herramientas de software que ayudan al usuario en la adquisición de datos, su procesamiento de manera apropiada, y proporcionar mediciones de la imagen es probable que sea la última respuesta. 28,29,47,48

Recientemente se han desarrollado una serie de técnicas de microscopía óptica, normalmente se conoce como microscopia de super-resolución o nanoscopía, que puede pasar por alto el límite de difracción y generar imágenes con resoluciones de 100 nm o mejor 1,2. Desde el anuncio de super-resolución de la microscopía como el método de Nature Methods del año en 2008, ha habido un gran desarrollo de los microscopios basados ​​en la localización. Por ejemplo, hay aplicaciones multi-color de 3-6, 7-12 implementaciones 3D, y aplicaciones de células incluso en vivo 5,13-17. Por otra parte, ya que estos sistemas están siendo comercializados y ahora están haciendo su manera de salir de los laboratorios de óptica en manos de los biólogos celulares no es probable que sea un nuevo aumento en su uso y aplicación a las cuestiones biomédicas. Una rama de esta familia son los métodos basados ​​en la localización que trabajan por la construcción de una molécula de molécula-por-imagen. Yoorden n para hacer esto, la mayoría de las moléculas fluorescentes dentro de la muestra se debe desconectar de manera que sólo unas pocas moléculas separadas espacialmente-están activos en un momento dado. Estas moléculas se conmutan a continuación, rápidamente del apagado y se toman muchas imágenes de manera que una parte significativa de la población se forma la imagen para reflejar la estructura subyacente con precisión de sub-difracción. Un número de enfoques han sido publicados incluyendo GSDIM 18, PALM 19, fPALM 20, STORM 21 y RESOLFT 22. Los algoritmos que miden la posición de una sola molécula de detección se pueden utilizar para localizar la posición real de la molécula con precisiones mejores que 20 nm utilizando apropiado gaussiana 23, por ejemplo rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, palm3d 12 y tormenta de lluvia 27. Cuando imágenes de células u otras muestras biológicas, que tienen una alta densidad de molécula, que por lo tanto es necesario tener muchos miles de marcos deEl parpadeo, espacialmente separada, de la señal con el fin de imagen una proporción significativa de las moléculas marcadas. Microscopía estocástico reconstrucción óptica (TORMENTA) y el dSTORM altamente relacionados y métodos GSDIM son métodos de super-resolución basada en la localización, que se han demostrado para trabajar con tintes orgánicos disponibles en el mercado 21. Desde entonces, han demostrado ser aplicable a un número de diferentes colorantes 28-30, lo que hace que la metodología particularmente atractiva debido a la especificidad y la comodidad relativa de enfoques immunolabeling bien establecidos para llevar a cabo la microscopía de fluorescencia. En consecuencia, no es fácil acceso a una amplia gama de conjugados colorante-anticuerpo-colorante y biomolécula, que tienen el potencial de ser utilizado en formación de imágenes de super-resolución basada en la localización. Mientras que los principios generales de la tormenta y enfoques similares son relativamente simples, ya primera vista la preparación del hardware y de la muestra parecen relativamente straightforward, hay una serie de pasos en el proceso que son críticos para el logro de alta calidad, libres de artefactos, imágenes de super-resolución. Al igual que con todas las técnicas de microscopía el proceso se puede considerar en 3 pasos principales: primero, la preparación de muestras, segundo, la adquisición de imágenes y, tercero, procesamiento de imágenes y / o análisis de imágenes y la interpretación. El poder de resolución adicional y método de generación de imágenes de super-resolución utilizando un enfoque basado en la localización introduce algunos nuevos problemas y consideraciones 31-33. A partir de la preparación de la muestra, cuando se realiza inmunomarcaje, particularmente inmunofluorescencia indirecta cuando se utiliza una combinación de anticuerpos primaria y secundaria, hay que señalar que el colorante fluorescente puede ser de hasta 20 nm de distancia de la molécula de interés. En el caso de los microtúbulos, esto se traduce en diámetros de 35-50 nm en comparación con un diámetro de microtúbulos esperado de 25 nm 28,30. Además, la densidad de etiquetado debe mEEG, el criterio de Nyquist a fin de generar una imagen de alta calidad 14. Por ejemplo, para una resolución de imagen prevista de 20 nm a lo largo de una estructura filamentosa no debe haber una molécula de colorante por lo menos cada 10 nm 27. Mientras que muchos colorantes se han publicado a trabajar para los enfoques basados ​​en la localización de los resultados globales del colorante es una mezcla de por lo menos cuatro criterios importantes, a saber, los fotones detectados por evento de conmutación (el brillo de cada parpadeo - más brillante es mejor), el equilibrio en -off ciclo de trabajo (la relación de contraste de tintes en el off contra el Estado - más fuera es generalmente mejor), la fracción de supervivencia (una tasa de blanqueo bajo es mejor) y el número de ciclos de conmutación (el número de parpadeos por fluoróforo - más es mejor para alta resolución, aunque 1 parpadeo por fluoróforo puede ser una ventaja para los propósitos de recuento de molécula). La situación se complica aún más por el hecho de que estas propiedades para cualquier tinte dado pueden variar en diferentes condiciones de tampón ycon 28,29 potencia del láser. Además, así como estas consideraciones STORM únicas, la calidad de imagen puede mejorarse mediante la optimización de la preparación de muestras de la misma manera como técnicas de microscopía de fluorescencia más tradicionales, por ejemplo, reduciendo al mínimo la autofluorescencia por modificación de las condiciones de fijación y el uso de reactivos de enfriamiento. También, minimizando fluoróforos unidos de forma no específica es importante, lo que puede hacerse mediante el ajuste de las concentraciones de etiquetas, los tiempos de incubación y etapas de bloqueo y lavado. El segundo paso de adquisición de la imagen también es crítica. Los ajustes óptimos en el microscopio dependerán del colorante, condiciones de tampón, la densidad de etiquetado, y el tipo de muestra, por ejemplo, monocapas sobre el vidrio, células o muestras de tejido. Las principales consideraciones son el tiempo de exposición de la cámara, número de cuadro, ángulo de iluminación (TIRF, HILO, Epi) y la potencia del láser. El objetivo es recoger la mayor cantidad de brillantes parpadeos separados espacialmente lo más rápido posible. Si el fondo is muy altos o los parpadeos no son muy brillantes, en otras palabras, la relación señal a ruido es pobre, el algoritmo de reconstrucción no será capaz de localizar las posiciones con la mayor precisión. Así como maximizar la precisión de localización, es decir, la precisión con la posición de cada molécula se puede medir, calidad de la imagen depende también de un elevado número de localizaciones. Si son expuestas un número insuficiente de las moléculas de interés, ya sea debido a la falta de etiquetado de eficiencia, fotoblanqueo excesiva o un número de cuadro inadecuada, entonces la imagen de super-resolución resultante será punteada y discontinua ya que no se han cumplido los criterios de Nyquist 14,27 . Y, por último, el tercer paso, el procesamiento de imágenes, es particularmente importante en comparación con técnicas de microscopía de fluorescencia estándar. Hay una variedad de forma libre y comercialmente disponibles algoritmos, que es a la vez una ventaja, en términos de elección, y una desventaja, ya que puede ser confuso saber which es el más apropiado para usar. Si, por ejemplo, los datos en bruto tiene bien espaciados espacialmente distintas parpadea entonces un algoritmo de ajuste de una sola molécula puede ser muy precisa y eficiente, por ejemplo, por los algoritmos de ajuste escasos disponibles en Rainstorm 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 y el software QuickPALM 26 . Si los datos en bruto contiene una gran cantidad de superposición de señales a continuación algoritmos que pueden ser más apropiado incluir DAOSTORM 34, 35 y 3B deconSTORM 36. Por otra parte, estos algoritmos contienen umbrales para diversos criterios tales como recuentos de señal, o fotones por abrir y cerrar, así como distintas opciones de visualización de imágenes diferentes, tales como la visualización con funciones gaussianas suavizadas o como histogramas con rejillas de píxel, donde el tamaño de píxel de super-resolución puede ser seleccionado por el usuario. Todas estas opciones de cambiar el aspecto de la imagen final y tienen implicaciones para la interpretación y análisis de imágenes. <p class="jove_content"&gt; Por lo tanto, presentamos 3 muestras de prueba que constituya el nuevo usuario con un punto de partida para los experimentos a base de colorantes basados ​​en localización de super-resolución, que en aras de la claridad, nos referiremos como tormenta, y los usuarios más experimentados, la oportunidad de optimizar aún más sus experimentos. En primer lugar, es posible recubrir la superficie de vidrio con una capa fluorescente de dextrano-colorante conjugado. Esto proporciona una forma rápida y simple para establecer que el microscopio, tinte y tampón están trabajando para generar el parpadeo de la señal fluorescente. El método puede ser extendido mediante la comparación de las métricas media de precisión de localización y número generados por temporal de lluvia para optimizar las condiciones de tampón, la configuración de adquisición de imágenes y probar diferentes tintes. En segundo lugar, se presenta un protocolo sencillo para la preparación de los filamentos de actina en el vidrio que puede ser etiquetada fácilmente utilizando conjugados phalloidin-dye. Estos proporcionan estructuras ideales para tomar mediciones de la resolución 27 y por lo general el ancho medio máximo (FWHM)de un filamento se da como una estimación empírica de la resolución 37. Cabe señalar que la resolución varía entre las muestras y entre las imágenes dentro de la misma muestra porque la resolución en super-resolución de la microscopía basada en la localización es una función del brillo fluoróforo, ruido de fondo y la densidad de localización 27 y estos no son necesariamente constantes en todo el espécimen. Los filamentos de actina se utilizan para demostrar posibles artefactos tales como mislocalizations y la deriva y cómo pueden ser identificadas con las características del software dentro de tormenta. Por otra parte, se describe el uso de marcadores de referencia fluorescentes tanto a medida y la deriva correcta. Y en tercer lugar, se describe la tinción de las células con factor de crecimiento epidérmico (EGF) conjugados de tinte. EGF proporciona un indicador útil de la calidad de la imagen de super-resolución, porque una proporción del receptor en la superficie celular experimenta endocitosis a través de vesículas, que son estructuras de tamaño sub-difracción de aproximadamente 50-150 Nm de diámetro 27,38,39.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labtek Imaging chamberglass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CBR-166-390E</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 X TIRF Objective Lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UAPON 100XOTIRF</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>* See below for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>640 nm laser</td>
			<td>Toptica</td>
			<td>iBEAM-SMART-640-S</td>
			<td>*150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>*Acquisition software (controlling hardware)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC</td>
			<td>Dell</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Image analysis and processing <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rainSTORM</td>
			<td>Laser Analytics Group (Cambridge) software</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources" target="_blank">http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Running rainSTORM</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/" target="_blank">http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Example of self-built STORM/PALM microscopes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Also see reference 29 <a href="http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope" target="_blank">http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Materials &amp; Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX70013065</td>
			<td>1; 2; 3; 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td>1.1; 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-22914</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General actin buffer</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>BSA01</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preformed-actin filaments</td>
			<td>Cytoskeleton Inc</td>
			<td>AKF99</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phallodin-Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres (0.1 micron)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-7279</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX31966021</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>VX10500064</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Step</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070063</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dishes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>734-0006</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF - Alexa fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E35351</td>
			<td>4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>4.3, 4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde - 10% solution EM grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>04018-1</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C100</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4706</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93352</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7528</td>
			<td>5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6500</td>
			<td>5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2289</td>
			<td>5.1; 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Reagents</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

test samples for optimizing storm super-resolution microscopy

STORM es una técnica de microscopia de super-resolución de reciente desarrollo con hasta 10 veces mejor resolución que las técnicas de microscopía de fluorescencia estándar. Sin embargo, como la imagen se adquiere de una manera muy diferente de lo normal, mediante la creación de una molécula de molécula-por-imagen, hay algunos desafíos significativos para los usuarios para tratar de optimizar su adquisición de la imagen. Con el fin de ayudar a este proceso y obtener una visión más clara de cómo funciona STORM presentamos la preparación de 3 muestras de prueba y la metodología de adquisición y procesamiento de imágenes STORM super-resolución con las resoluciones típicas de entre 30 a 50 nm. Mediante la combinación de las muestras de ensayo con el uso del software de procesamiento de tormenta libremente disponible, es posible obtener una gran cantidad de información acerca de la calidad y la resolución de la imagen. El uso de estos indicadores es entonces posible para optimizar el procedimiento de imagen de la óptica, para la preparación de muestras, selección de colorantes, condiciones del tampón y los ajustes de adquisición de imágenes. Tenemos unmuestran ejemplos de lso de algunos problemas comunes que dan lugar a la mala calidad de imagen, como la deriva lateral, donde los movimientos de la muestra durante la adquisición de imágenes y la densidad relacionadas problemas derivados del fenómeno &#39;mislocalization&#39;.

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Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Se describe la preparación de tres muestras, y cómo pueden ser utilizados para optimizar y evaluar el desempeño de los microscopios TORMENTA. El uso de estos ejemplos nos muestran la forma de adquirir los datos en bruto y luego procesarla para obtener imágenes de super-resolución en las células de aproximadamente 30 a 50 nm de resolución.

Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

test-samples-for-optimizing-storm-super-resolution-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

31.0K vistas.  National Physical Laboratory.  Se describe la preparación de tres muestras, y cómo pueden ser utilizados para optimizar y evaluar el desempeño de los microscopios TORMENTA. El uso de estos ejemplos nos muestran la forma de adquirir los datos en bruto y luego procesarla para obtener imágenes de super-resolución en las células de aproximadamente 30 a 50 nm de resolución. 

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Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-resolución de imagen de la maquinaria de división bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Investigación

Biología

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-resolución de imagen del anillo Z cytokinetic en bacterias vivas Utilizando 3D-estructurado Fast Iluminación Microscopía (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Escaneado de Protocolos de Microscopía Electrónica (SEM) para la Problemática de la planta, Oomycete, y muestras de hongos

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

La proyección de imagen de resolución súper Estado de agotamiento de la tierra en células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Aplicación de la microscopía de resolución súper alta velocidad velocidad en vivo cilio primario

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.

Corrección de alta precisión de los cambios cromáticos 3D en la era de las imágenes biológicas de superresoría utilizando Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Super-Resolución De Imágenes De Células Vivas De Estructuras Subcelulares

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...