El protocolo permite el etiquetado específico de nucleoides mitocondriales en células vivas y el estudio cuantitativo de su movimiento a alta resolución. La incubación con el tinte fluorescente sólo evita la necesidad de proteína fluorescente sobre la expresión, evitando artefactos y limitaciones relacionados y permitiendo que nuestro protocolo se aplique a células no transfetables. Para lograr la tinción de nucleoides preferencial, uno debe utilizar SYBR Gold y nada más en las condiciones que hemos optimizado.
De lo contrario, el ADN celular total puede estar manchado. Un día antes del procedimiento de etiquetado, cultivo cuatro veces 10 a las quintas células de HeLa en dos mililitros de medio en un plato de Petri de 35 milímetros. A la mañana siguiente, lave las células en dos mililitros de PBS antes de añadir un mililitro de medio de cultivo libre de rojo fenol y un mililitro de la solución de etiquetado 2X adecuada.
Después de 30 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, aspira cuidadosamente el tinte que contiene sobrenadante de cada plato Petri de 35 milímetros y lava las células con dos mililitros de PBS. Luego alimente las células con un medio de cultivo de células libres de rojo fenol fresco y devuelva el cultivo a la incubadora de cultivo celular protegida de la luz hasta que las imágenes vivas. Para la toma de imágenes de células vivas, al menos una hora antes de la sesión de imágenes, coloque la incubadora superior del escenario en la etapa del microscopio de iluminación estructurada de súper resolución y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados y la concentración de dióxido de carbono en 5%Encienda todos los componentes del microscopio, incluidos los láseres, y seleccione un objetivo de inmersión de alta ampliación y alta apertura numérica recomendado para la microscopía de iluminación estructurada de super resolución por el fabricante del microscopio.
Cuando los láseres se hayan calentado, instale la placa Petri de 35 milímetros en la etapa del microscopio y utilice los oculares para localizar un área de interés con las células unidas a la parte inferior del plato. Para adquirir imágenes de microscopía de iluminación estructurada de súper resolución, utilice una cámara de dispositivo acoplada de carga de electrones de extremo alto de extremo posterior. En el software de adquisición de imágenes, establezca una alta ganancia de multiplicación de electrones según lo recomendado para la cámara.
Antes de adquirir la serie de lapso de tiempo para el seguimiento de nucleoides, adquiera una imagen de microscopía de iluminación estructurada de dos colores de super resolución del mismo campo de visión en un canal para la tinción mitocondrial y otro para el oro SYBR. Establezca el canal de color de la imagen mitocondrial en la excitación y emisión adecuadas para la mancha mitocondrial utilizada y establezca el filtro de emisión de excitación y bang Pass adecuado para el tinte de oro SYBR. Establezca la potencia láser más baja posible para ambos canales.
Si el microscopio adquiere canales sólo secuencialmente, apague el canal para la detección de manchas mitocondriales. desmarque la caja de la pila Z en el software para desactivar la adquisición de la pila Z para establecer la adquisición de un solo plano focal y establecer el menor tiempo de exposición posible de la cámara. Establezca tres rotaciones de la red y adquiera imágenes bidimensionales de las celdas etiquetadas a varios valores de potencia láser y varios tiempos de exposición para optimizar la potencia láser en el tiempo de exposición de la cámara.
Seleccione la potencia láser y los tiempos de exposición de la cámara que producen imágenes de microscopía de iluminación estructurada con puntos brillantes en las mitocondrias con poco o ningún artefacto e inicie la adquisición de la serie de lapso de tiempo utilizando los ajustes optimizados. Para el análisis de las imágenes de lapso de tiempo, abra las imágenes de microscopía de iluminación estructurada convertidas y un software de análisis de imágenes adecuado que tenga un módulo de seguimiento de puntos y haga clic en agregar nuevos puntos para iniciar el asistente de creación de puntos. En la pestaña Crear, haga clic en los puntos de seguimiento a lo largo del tiempo y continúe con el segundo paso del asistente.
Establezca el diámetro x-y estimado en 0,1 a 0,15 micrómetros. Haga clic en resta en segundo plano y continúe con el tercer paso del asistente. Arrastre la línea vertical en el histograma para ajustar el umbral del filtro de calidad hasta que la mayoría de los nucleótidos se detecten como puntos en los artefactos no se detectan dentro de cada fotograma.
Continúe con los pasos cuarto y quinto del asistente y seleccione el algoritmo de movimiento autoregresivo. Establezca la distancia máxima en 0,5 micrómetros y el tamaño máximo del espacio en cero. Cuando los parámetros ajustados permiten que el software detecte todos los puntos y cree pistas correctamente, haga clic en el botón de flecha ahora para confirmar la creación de las pistas y haga clic en el icono de estadísticas para extraer las estadísticas de pistas.
A continuación, seleccione los parámetros estadísticos necesarios y haga clic en Guardar como para exportar los valores como archivos CSV de punto para la cuantificación y visualización. El etiquetado con altas concentraciones de oro SYBR o PicoGreen da como resultado una abundante tinción de los núcleos y tinción punctato dentro del citoplasma. A concentraciones más bajas, la señal débil de oro SYBR aparece dentro de los núcleos en un patrón de manchas brillantes se observa dentro del citoplasma.
El etiquetado PicoGreen a bajas concentraciones produce principalmente tinción nuclear. La tinción simultánea con bajas concentraciones de oro SYBR en un tinte mitocondrial rojo lejano revela que casi toda la tinción de oro SYBR se produce dentro de las mitocondrias, mientras que el etiquetado a altas concentraciones da como resultado una tinción significativa de los núcleos y el citoplasma. Las imágenes de lapso de tiempo revelan que después de 45 minutos la tinción nucleoides está cerca de la saturación.
La fijación provoca una ligera redistribución del tinte al núcleo, mientras que la permeablización de las células fijas elimina el patrón de tinción punteada de las mitocondrias y mejora la tinción nuclear. Si se añade oro SYBR a las células después de la fijación y permeablización, entonces el tinte se distribuye uniformemente a través del citoplasma y el núcleo resultando en la pérdida de la especificidad de la tinción. Las imágenes 3D de células vivas por microscopio de iluminación estructurada de súper resolución revelan el nucleoides mitocondrial como puntos brillantes dentro de las mitocondrias.
El seguimiento de las posiciones del nucleoides a una resolución más allá del límite de difracción demuestra que la mayoría de los nucleoides exhiben movimientos aleatorios de corta distancia que probablemente se limitan a la red mitocondrial. Es importante tener en cuenta que este protocolo no es compatible con la fijación de la muestra. Sin embargo, nuestro protocolo debe ser compatible con una amplia gama de ensayos basados en imágenes de células vivas para el estudio de la morfología, la dinámica y las actividades de moléculas y orgánulos.
Nuestro estudio ilustra las ventajas de retargeting de tintes no orgánicos para técnicas basadas en células. Puede inspirar la exploración de otros tintes fluorescentes para su aplicación en estudios celulares.
