Grant: 5RO1GM086447-02.

1. Preparación de la muestra <ol><li> Inocular medio LB con una sola colonia de la cepa JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Crecer durante la noche en un agitador a 37 ° C. </li><li> Se diluye la cultura 1:1,000 a M9 + mínimos medios de comunicación [sales M9, el 0,4% de glucosa, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, ácidos aminoácidos y vitaminas MEM] y crecer hasta la fase logarítmica media (OD 600 = 0,2 a 0,3) en presencia de cloranfenicol (150 ug / ml) a temperatura ambiente (RT). </li><li> Inducir el cultivo con 20 mM IPTG durante 2 horas (véase Nota # 1). </li><li> Pellet cultura en microcentrífuga (8.000 rpm, 1 min) y se resuspenden en un volumen igual de M9 +; repetición. Después de la resuspensión segundo, continuar el crecimiento a temperatura ambiente durante 2 h. </li><li> Fijar cultivo inducido con 4% de paraformaldehído en PBS (pH = 7,4) a TA durante 40 min. Pellet cultura y se resuspende en un volumen igual de PBS; repetición. Si las células de imágenes en vivo, vaya fijación, la cultura pellet y resuspender con un volumen igualde M9 - [Las sales M9, el 0,4% de glucosa, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, ácidos aminoácidos MEM]; repetición. </li><li> Diluir 1:10 cuentas de oro con la cultura resuspendido. Aplique la muestra en la cámara de imagen preparada (ver paso 2.4). </li></ol> [1] Nota: El protocolo de inducción anterior (pasos 1.1-1.3) se ha optimizado para el sistema de expresión de la cepa JB281. Las condiciones detalladas de inducción puede variar para otros sistemas de expresión o proteínas de interés. 2. Asamblea de la Cámara de imágenes <ol><li> Hacer un 3% (w / v) de solución de agarosa en M9 -. Derretir de agarosa a 70 ° C en un bloque de calor de sobremesa durante 40 min. Tienda de agarosa fundida a 50 º C durante un máximo de 5 horas. </li><li> Colocar un portaobjetos limpio microaqueduct en la mitad superior de la cámara de formación de imágenes con los electrodos orientados hacia abajo. Alinee la junta inferior de la diapositiva microaqueduct el fin de cubrir los canales de perfusión. </li><li> Aplicar ~ 50 l de la agarosa fundida al centro del cristaldiapositiva. Inmediatamente encima de la gota de agarosa gel con un cubreobjetos limpio y seco. Permitir que el gel se solidifique a temperatura ambiente durante 30 min. <ol><li> Para limpiar cubreobjetos: organizar cubreobjetos en un soporte de cerámica y sonicar durante 20 min en la rotación de baños de acetona, etanol y KOH 1 M en frascos de vidrio. Repetir el ciclo tres veces, para un total de 9 sonicaciones, seguido de una sonicación sola en dH 2 O. Guarde los cubreobjetos limpios en dH 2 O. fresco Antes de su uso, soplar cubreobjetos secos con aire filtrado. </li></ol></li><li> Retire con cuidado el cubreobjetos, dejando almohadilla de gel en la diapositiva microaqueduct. Añadir inmediatamente 1 l de muestra de cultivo celular (ver paso 1,6) a la parte superior de la almohadilla de gel. Esperar a ~ 2 min, permitiendo que la solución sea absorbida por la almohadilla de gel. Top almohadilla de gel con un nuevo cubreobjetos limpio y seco. Montar la cámara de formación de imágenes todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 3. Adquisición de imágenes <ol><li> Encender el microscopio, cámara y láseres. Abra MetaMorph suaveWare (Molecular Devices). </li><li> Lugar apropiado de excitación / emisión de los filtros en la ruta de formación de imágenes (Figura 1). </li><li> Establecer potencias de láser y la configuración de adquisición en consecuencia. <ol><li> 488-nm láser = 15 mW (ver nota # 2) </li><li> 561-nm láser = 75 mW </li><li> 405-nm láser = 2 mW ± filtro de densidad neutral (Véase la nota n º 3) </li></ol></li><li> Bloqueo de cámara de formación de imágenes en la etapa a través del adaptador etapa complementaria. </li><li> Designar una región de una imagen apropiada (100x100 píxeles) que está homogéneamente iluminado por los tres láseres. </li><li> Identificar un área de la muestra que contiene tanto células como marcadores de referencia (cuentas de oro) en estrecha proximidad, pero no se solapan. </li><li> Centrarse en la superficie de las células más cercanas a la cubreobjetos. Adquirir una imagen de campo claro con 50 ms de tiempo de integración y mover el foco del 0,5 micras en la muestra (Figura 3AI). </li><li> Adquirir conjunto verde imagen de fluorescencia con una excitación de la 488-n<html> m láser utilizando un tiempo de integración 50 ms (Figura 3Aii). </li><li> Adquirir el streaming de vídeo en el canal rojo con iluminación continua de 405-nm y láser 561-nm. Para las células fijas, una tasa de 50 ms trama se utiliza para un total de 20.000 marcos (~ 17 min totales) con la potencia del láser 405-nm en rampa por ~ 10% cada 1.000 marcos (véase la Nota 4). Para las células vivas, una tasa de 10 ms trama se utiliza para un total de 3.000 tramas (~ 30 s en total) a una potencia de láser constante 405-nm. </li><li> Mover el foco de nuevo a la superficie inferior de las células y adquirir otra imagen campo claro como en el paso 3.7. </li></ol> [2] Nota: La intensidad integrada de la fluorescencia verde de una célula es directamente proporcional al número total de FtsZ-mEos2 moléculas expresadas en la célula. La potencia de excitación de 488-nm y la configuración del conjunto de adquisición de fluorescencia se debe mantener constante para todas las células de modo que la relación FtsZ-mEos2 niveles de expresión en células diferentes se pueden comparar. ONTENIDO &quot;&gt; [3] Nota:. Las células fijadas se crean imágenes con la densidad neutra (ND) del filtro (Figura 1, los componentes ópticos # 5) en su lugar a fin de lograr una tasa de activación lenta de modo que cada molécula individual puede ser identificado con precisión los ND filtro es retirado cuando la imagen en vivo células para aumentar la tasa de activación, mientras que el mantenimiento de una baja probabilidad de dos moléculas que se activan simultáneamente en una zona de difracción limitada. El ritmo más rápido aplicado a imagen de células vivas se necesita para disminuir el tiempo total de adquisición, así &quot;congelar&quot; el anillo Z en el tiempo y limitar el efecto de fotodaño a la célula. [4] Nota: Los números de tramas adquiridas fueron optimizados para nuestro sistema y dependen de la estructura celular particular, etiquetado densidad, velocidad de activación y si agotar toda la piscina de fluoróforos es importante para el análisis. En las células vivas, es importante para obtener un número suficiente de localizaciones en un período tan corto de time como sea posible para evitar la borrosidad de la imagen provocada por el movimiento de la estructura celular. 4. PALM construcción de la imagen <ol><li> Determinar la posición del centroide de cada punto detectado. <ol><li> Cargue la pila de imágenes en Matlab (MathWorks, Inc). </li><li> Recortar la pila en la imagen para una región alrededor de una célula que excluye todas las cuentas fiduciarias. </li><li> Seleccione un umbral de intensidad para la detección de punto que está por encima del nivel de fondo, pero por debajo del punto medio de la intensidad. Nos cuenta de la variación en el nivel de fondo a lo largo de un experimento mediante el cálculo de la media móvil de la intensidad máxima utilizando una ventana de marco 150. El umbral de intensidad para cada trama se interpola a partir de los valores medios de funcionamiento. </li><li> Restar el valor umbral respectivo de cada trama. Puntos potenciales se identifican como tres píxeles adyacentes con intensidades por encima del umbral. </li><li> Ajustar la intensidad de la fluorescencia de cada mancha prospectivo a un Gaussia de dos dimensionesfunción de n [Ecuación # 1] usando un algoritmo de mínimos cuadrados no lineal (Figura 2). La precisión de la localización de cada punto se calcula usando el número total de fotones detectados [Ecuación # 2]. Cualquier mancha mal ajuste con una precisión de localización superior a 20 nm (células fijas) o 45 nm (células vivas) se descarta (véase la Nota 5). Cualquier punto con una intensidad mayor que dos veces de la media de intensidad, posiblemente debido a la superposición de emisores, también se descarta. </li><li> Para las células fijas, eliminar observaciones repetidas de la misma molécula haciendo caso omiso de cualquier lugar cuyo centro de gravedad es la posición dentro de los 45 nm de cualquier otro lugar que lo precedió por 6 cuadros o menos. Para las células vivas, todas las manchas se conservan. </li></ol></li><li> Calibrar la deriva de la muestra utilizando el movimiento marcador de referencia. <ol><li> Cultivos a cabo una región de 10x10 píxeles alrededor de un marcador de referencia. </li><li> Restar el valor umbral respectivo determinado en 4.1.3 a partir de cada trama. </li><li> Montar el perfil de intensidad en cadabastidor a través de los mínimos cuadrados algoritmo de ajuste asumiendo una forma gaussiana bidimensional. </li><li> Calcular el desplazamiento entre las posiciones del centroide con respecto al bastidor 1. </li></ol></li><li> Corregir la posición del centroide de cada molécula único identificado en 4.1, con la deriva de la muestra, calculada en 4,2. Compare las imágenes de campo claro adquiridos en 3,7 y 3,10. Si se observan células para moverse con relación a los marcadores de referencia, los datos se lanza hacia fuera. </li><li> Superponer todas las posiciones corregidas centroide sobre una única imagen compuesta de píxeles 15x15 nm. Trace cada molécula única como una unidad de área, de dos dimensiones perfil gausiano centrado en la posición centroide con una desviación estándar igual a la precisión de localización [Ecuación # 2]. Esto da lugar a un mapa de densidad de probabilidad, en donde la intensidad de un píxel es proporcional a la probabilidad de encontrar una molécula de dicho píxel (Figura 3Aiv). </li><li> Comparación de imágenes PALM las imágenes del conjunto. <ol><li> REPLOT el centroposiciones de ID como en 4.4, pero en un plano con 150x150 píxeles nm y una desviación estándar igual a 250 nm. Esto genera una imagen de la palma que imita una imagen de difracción limitada, que puede ser usado para comparar con la imagen de conjunto de difracción limitada, adquirido en 3,8 (Figura 3Aiii). </li><li> Para confirmar que las moléculas detectadas son representativos de toda la población, comparar la imagen reconstruida conjunto (Figura 3Aiii, paso 4.5.1) con la imagen de fluorescencia conjunto experimental (Figura 3Aii, paso 3,8) para confirmar que ambas imágenes muestran estructuras de forma similar , la orientación y la intensidad relativa. </li></ol></li></ol> [5] Nota: La precisión de localización mínimo requerido se determina empíricamente para cada método de formación de imágenes mediante el trazado de las precisiones de todas las moléculas de una muestra dada y la selección de un punto de corte apropiado. 5. PALM Análisis de Imágenes <ol><li> Medición Z-Ring width y diámetro. <ol><li> Girar la imagen de la palma a fin de orientar verticalmente el eje longitudinal de la célula (Figura 4A). </li><li> Crop fuera de la región celular que contiene el anillo Z. </li><li> Calcular la intensidad acumulativa mediante la proyección de un perfil de intensidad a lo largo del eje largo de la célula. </li><li> Montar el perfil de intensidad a una distribución gaussiana. La anchura del anillo se define como la anchura máxima de medio completo (FWHM) de la distribución gaussiana de módulos (Figura 4B). </li><li> Proyectar el perfil de intensidad acumulativa de 5.1.2 a lo largo del eje corto de la célula. El diámetro del anillo se define como la longitud total del perfil de intensidad (Figura 4C). </li></ol></li><li> Trazado Densidad FtsZ (ver Nota 6). <ol><li> REPLOT las posiciones del centroide como en (4,4), pero sin el perfil gaussiano de tal manera que cada molécula única se le da un valor de 1 y se asigna a un único píxel correspondiente a su posición centroide. De esta manera, la intensidad de cada unopíxel representa el número total de moléculas detectadas en ese píxel. La imagen de la palma de densidad también se puede visualizar como un gráfico de contorno (Figura 5E). </li></ol></li><li> Determinación de la resolución espacial. <ol><li> Teóricamente-alcanzable resolución espacial: crear un PSF representante para toda la muestra utilizando el promedio precisión determinada la localización de todas las moléculas detectadas y calcular la FWHM (Ecuación 3). </li><li> Resolución espacial logrado experimentalmente: calcular el desplazamiento medio entre observaciones repetidas de la misma molécula. </li></ol></li></ol> [6] Nota: Se utilizó PALM de reflexión interna total (TIR-PALM, Figura 1 y 5) para restringir la activación y la excitación de una capa delgada (~ 200 nm) por encima de la interfaz célula / vidrio. de modo que sólo las moléculas de FtsZ asociados con la membrana más cercana a la cubreobjetos será detectado.

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

PALM imágenes contienen información acerca de los recuentos y las posiciones de moléculas dentro de una célula, permitiendo un análisis detallado de la distribución y la disposición de las moléculas de proteína diana que es difícil de lograr por otros medios. A continuación detallamos las precauciones que se deben tomar para extraer información cuantitativa precisa, manteniendo la relevancia biológica de las imágenes de palma. También explorar la información que puede obtenerse mejor utilizando células ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 50 x MEM aminoácidos </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x vitaminas MEM </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46 a 102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16% de paraformaldehído </td><td> Electrónica Ciencias Micrsocopy </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG agarosa </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 Cuentas Gold nm </td><td> Microesferas-Nanoesferas </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 imagen Cámara </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Etapa Adaptador </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Invertido </td><td> Olimpo </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1,45 NA, 60x Objetivo </td><td> Olimpo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD Cámara </td><td> Andor Tecnología </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm láser de zafiro </td><td> Coherente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm láser de Zafiro </td><td> Coherente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405-nm láser CUBE </td><td> Coherente </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

La división celular bacteriana requiere el montaje coordinada de más de diez proteínas esenciales en midcell 1,2. Fundamental en este proceso es la formación de una supraestructura de tipo anillo (anillo Z) por la proteína FtsZ en el plan de división de 3,4. El anillo Z se compone de varios monocatenarios protofilamentos FtsZ, y la comprensión de la disposición de los protofilamentos dentro del anillo Z proporcionará información sobre el mecanismo de anillo Z ensamblaje y su función como un generador de fuerza 5,6. Esta información ha permanecido esquiva debido a las limitaciones actuales en la microscopía de fluorescencia convencional y microscopía electrónica. Microscopía de fluorescencia convencional es incapaz de proporcionar una imagen de alta resolución de la Z-ring debido al límite de difracción de la luz (~ 200 nm). Electrónica cryotomographic imágenes ha detectado disperso en pequeñas protofilamentos FtsZ C. células crescentus 7, pero es difícil de aplicar a células más grandes, tales comoE. coli o B. subtilis. Aquí se describe la aplicación de un método de microscopía de super-resolución de fluorescencia, microscopía de localización fotoactivado (palma), para caracterizar cuantitativamente la organización estructural de la E. coli Z-anillo 8. PALM imagen ofrece una alta resolución espacial (~ 35 nm) y el etiquetado específico para permitir la identificación inequívoca de proteínas diana. Hemos marcado FtsZ con la mEos2 proteína fluorescente fotoactivable, que cambia de verde de fluorescencia (excitación = 488 nm) al rojo de fluorescencia (excitación = 561 nm) tras la activación a 405 nm 9. Durante un experimento PALM, solo FtsZ-mEos2 moléculas se activan y estocásticamente las posiciones correspondientes centroides de las moléculas individuales se determinan con precisión &lt;20 nm. Una imagen de super-resolución de la Z-ring se reconstruye mediante la superposición de las posiciones del centroide de todos los detectados FtsZ-mEos2 moléculas. &lt;clase p = &quot;jove_content&quot;&gt; Usando este método, se encontró que el anillo Z tiene un ancho fijo de ~ 100 nm y se compone de un paquete suelto de protofilamentos FtsZ que se solapan entre sí en tres dimensiones. Estos datos proporcionan una plataforma para futuras investigaciones de los cambios del ciclo celular dependientes de la 10 Z-anillo y se puede aplicar a otras proteínas de interés.

Ilustrado en la Figura 3Aiv es una de dos dimensiones, super-resolución de procesamiento de la Z-ring generado a partir del método de obtención de imágenes PALM descrito anteriormente. A continuación, se resume la información cualitativa y cuantitativa que se puede obtener a partir de ellos. Cualitativamente, se observó que el anillo Z es una estructura irregular que adopta varias configuraciones (banda única o arco helicoidal) que no son distinguibles en las imágen...

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Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Se describe un super-resolución método de imagen para sondear la organización estructural de la bacteriana FtsZ-anillo, un aparato esencial para la división celular. Este método se basa en análisis cuantitativos de fotoactivados microscopía de localización (palma) y las imágenes se puede aplicar a otras proteínas del citoesqueleto bacterianas.

Super-resolución de imagen de la maquinaria de división bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

super-resolution-imaging-of-the-bacterial-division-machinery

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K vistas.  The Johns Hopkins University School of Medicine. Se describe un super-resolución método de imagen para sondear la organización estructural de la bacteriana FtsZ-anillo, un aparato esencial para la división celular. Este método se basa en análisis cuantitativos de fotoactivados microscopía de localización (palma) y las imágenes se puede aplicar a otras proteínas del citoesqueleto bacterianas.

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Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Electron Cryotomography de las células bacterianas

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Investigación

Biología

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-resolución de imagen del anillo Z cytokinetic en bacterias vivas Utilizando 3D-estructurado Fast Iluminación Microscopía (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparación, Imaging, y cuantificación de la superficie bacteriana Motilidad ensayos

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

La proyección de imagen de resolución súper Estado de agotamiento de la tierra en células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Aplicación de la microscopía de resolución súper alta velocidad velocidad en vivo cilio primario

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.