Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIDCR) subvención F32 (DE021929) a JLF y una subvención DE016402 NIDCR R01 para RAS

1. Preparar tungsteno Agujas <ol><li> Cortar una varilla de tungsteno en el medio usando cortadores de alambre para que la varilla no se dobla. </li><li> Enrosque la varilla a través del extremo afilado de un pipeta Pasteur de 5 3/4 en vidrio de borosilicato. </li><li> Dejar aproximadamente 3/4 en la adherencia vara del vidrio, adherir la varilla a la punta de la pipeta con una pequeña capa de &quot;adhesivo de fusión en caliente&quot; (HMA), que es la barra de pegamento utilizado para una pistola de pegamento. La HMA debe fundirse rápidamente en una llama de alcohol, teniendo cuidado de no quemar el pegamento y generar humo negro. </li><li> El uso de un par de fórceps, doblar la punta de la varilla de tungsteno (aproximadamente 1/4 desde el extremo superior) hasta que se alcanza un ángulo de 45 °. </li><li> Sujetando la pipeta Pasteur, colocar 1/8 en la punta de la varilla de tungsteno en la llama de un soplete de propano. Mantenga la punta constante y exactamente perpendicular a la llama. </li><li> Retire la aguja de la llama en el momento de una pequeña mancha de color naranja de tungsdiez moscas fuera de la aguja. </li></ol> 2. Preparar Spemann Pipetas <ol><li> El uso de un mechero Bunsen, calentar el extremo estrecho de una pipeta Pasteur hasta que el vidrio poco más allá de la forma cónica comienza a derretirse. Retire del fuego y tirar de la punta hasta que se sella la pipeta. Asegúrese de que queda una porción de la parte ahusada que tiene un diámetro exterior de aproximadamente 0,7-1,0 mm. Romper el extremo sellado a cerca de 4 cm de la puesta a punto. </li><li> Fije unos 2 pies (60 cm) de tubo de goma al extremo ancho (abierta) de la pipeta. Blow en el otro extremo del tubo de goma para asegurar que el aire no puede pasar a través de la parte cónica de la pipeta Pasteur. </li><li> El uso de un cilindro de combustible de propano con una antorcha de llama lápiz adjunta, calentar un área ovalada en un lado de la pipeta justo por debajo del inicio de la conicidad. Soplar aire muy suavemente y constantemente a través del tubo de goma con una ligera cantidad de presión (aproximadamente la cantidad de presión necesaria para decir el comienzo de la Letter &quot;P&quot; a nivel de conversación). Cuando el vidrio se ablanda en un lado y comienza a doblarse hacia afuera, eliminar rápidamente la pipeta de la llama y soplar fuerte y constante a través del tubo de goma. Esto hará que la parte calentada del vidrio para formar una burbuja en forma de salchicha que pueden aparecer, la cual está muy bien. Si la burbuja es demasiado pequeño, trate de fusión y soplando el vidrio de nuevo. La ventana abierta final en el cristal debe estar alrededor de 0,25 in (6,35 mm) de ancho por 0,5 pulgadas (12,7 mm) de largo. </li><li> Señalando el extremo cónico hacia arriba, raspar la burbuja en un recipiente de residuos de vidrio, mientras que sopla suavemente a través de la tubería para evitar que fragmentos de vidrio de entrar en la pipeta. </li><li> Uso de la llama de propano, quemar los bordes restantes de la burbuja y de fuego-pula los lados de la ventana abierta. Tenga cuidado de no derretir el eje de la pipeta. </li><li> Con un lápiz con punta de diamante, anotar el extremo cónico de la pipeta aproximadamente 1.25 in (30 mm) de la ventana y rompa la puntacon pinzas de manera que la abertura de la pipeta se corta limpiamente (pipetas de descarte con puntas rotas o irregulares). </li><li> El uso de pinzas y el borde de una llama de un mechero de alcohol, doblar la parte estrecha de la pipeta en 0.375 (9,5 mm) de la punta a un ángulo de aproximadamente 60 ° de modo que la parte doblada es en un plano vertical cuando la abertura de la ventana está en la posición 1:00 para el uso diestro y 11:00 para el uso de la mano izquierda. Este paso se lleva a cabo mejor en un recinto sin corrientes de aire. </li><li> Fuego-pule la punta utilizando la llama de alcohol con un microscopio de disección. Asegúrese de no cerrar la punta sino más bien mantener la abertura redonda y lisa sin ninguna constricción. </li><li> Corte un 1 en (25 mm) tubo de goma, rociar el trozo de tubo con etanol al 70%, y deslice el tubo sobre el eje de la pipeta hasta que la abertura de la ventana esté completamente cubierto. Esto funciona como el &quot;diafragma&quot; de la pipeta de Spemann. </li><li> Coloque una bombilla ml látex de caucho 2sobre la parte inferior abierta de la pipeta. El bulbo mantiene la presión negativa en la pipeta de Spemann. </li><li> Para practicar el uso de una pipeta de Spemann, transferir perlas de cromatografía de alrededor de 100-200 m de diámetro a partir de una mancha marcada en una placa de Petri a una mancha marcada en otro bajo un microscopio. </li><li> Para limpiar la pipeta Spemann, retire la tapa de goma y el lugar de la pipeta, la punta hacia abajo, en un vaso alto forrada con algodón o gasa en el fondo y llena de agua destilada y detergente cristalería. </li></ol> 3. Esterilizar e incubar los huevos <ol><li> Limpie los huevos con etanol al 70% y colocar los huevos en bandejas de huevos de plástico. </li><li> Establecer los huevos en una incubadora calentada a 37,5 º C y 85-87%. </li><li> Incubar los huevos hasta que alcancen HH9.5, aproximadamente 26 horas para la codorniz y 48 horas para el pato. </li></ol> 4. Ventana Huevos <ol><li> Retirar una pequeña pieza de la carcasa exterior de la parte superior del huevo con unas pinzas, teniendo cuidado de no perforar la cáscara interior membrane. </li><li> Utilizando una jeringa con una aguja de 18 G de 1 pulgada, hacer un agujero en la punta más estrecha del huevo y retirar aproximadamente 1-2 ml de albúmina. </li><li> Coloque cinta adhesiva transparente sobre el agujero y la marca de punción en la cáscara. </li><li> Corte una &quot;ventana&quot; a lo largo de la superficie superior del huevo (a través de la cinta transparente) con unas tijeras curvas. </li></ol> 5. Visualice embriones y prepararse para la cirugía <ol><li> Utilizando una varilla de vidrio, cepillar suavemente una pequeña cantidad de rojo neutro (0,02 g / ml en BSS de Hank) sobre el embrión. </li><li> Cortar la membrana vitelina y tire de ella sobre el embrión utilizando una aguja de tungsteno llama afilada. </li><li> Vuelva a sellar el huevo mediante la colocación de cinta adhesiva transparente sobre la ventana. </li></ol> 6. Separe el tejido donante del embrión del Donante <ol><li> Retire la cinta de la ventana en el huevo del embrión donante. </li><li> Para cortar el pliegue neural del ectodermo adyacente del embrión donante, hacer ranuras en ambos sidES del tubo neural, utilizando una aguja de tungsteno de llama-afilado (fabricado como se describe anteriormente). </li><li> Luego, cortar a través del tubo neural en los planos anterior y posterior deseadas del injerto y separar el injerto del resto del tubo neural. </li><li> Retire el pliegue neural del embrión donante utilizando una pipeta de Spemann u otro tipo de micropipeta. </li><li> A continuación, retire el adhesivo de la ventana en el huevo de acogida y utilizar la pipeta Spemann colocar el pliegue neural donante junto con el embrión de acogida junto a la zona del tubo neural que recibirá el trasplante. </li></ol> 7. Separe el tejido del huésped y el trasplante de tejido del donante <ol><li> Separar el pliegue neural del tubo neural del embrión de acogida, como se hizo con el donante. Tenga cuidado de eliminar un injerto de igual tamaño que el tejido del donante. </li><li> Empuje suavemente este tejido huésped lejos del embrión. </li><li> Luego, con una aguja de tungsteno romo o la punta redondeada de un micropipette, mueva suavemente el neural donante doblez en el tubo neural de acogida, el mantenimiento de las orientaciones antero-posterior y dorso-ventral adecuadas. Asegúrese de que el injerto está escondido en lo largo de los lados, pero asegúrese de no meter o daño a los tejidos subyacentes. Para ayudar a mantener un seguimiento de la nota de la orientación del original cualquier asimetría en el tejido de un donante o de tinción diferencial de la Red Neutral. También foto-documento el embrión donante con el tejido extirpado acompaña, así como la quimera inmediatamente después de la cirugía. </li><li> La solución salina estéril se debe añadir al huevo si el embrión de acogida muestra signos de desecación. </li><li> Ahora, con cuidado volver a sellar y etiquetar el huevo, y suavemente volver a una incubadora de una alta humedad (70-80%), donde el embrión quimérico puede desarrollar a la etapa deseada para su análisis. </li></ol> 8. Colección de quimeras <ol><li> Asegúrese de recoger los embriones quiméricos en recién hecha fijador frío de Serra y colocar inmediatamente en un rocker a 4 ° C para una fijación O / N. Esto permitirá una detección más sensible de células de codorniz con el anticuerpo anti-codorniz. </li><li> Para los análisis de la expresión génica a través de RT-qPCR, congelar embriones directamente en nitrógeno líquido antes de la extracción de ARN. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La cresta neural es una población transitoria de células embrionarias que migra ampliamente en todo el embrión y se diferencia en diversos tipos de células, incluyendo condrocitos y osteoblastos, que contribuyen al esqueleto craneofacial. El trasplante de la cresta neural en el sistema quimérico codorniz-duck ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de las interacciones de tejidos y vías de señalización que regulan el desarrollo del esqueleto craneofacial. Sin embargo, dado el vasto potencial de la cresta neural para generar también las células del músculo liso, adipocitos, melanocitos, células de Schwann, y las neuronas, el sistema quimera codorniz pato tiene un tremendo potencial para futuras aplicaciones, en particular en combinación con el rápido avance de la biología de células madre y la medicina regenerativa. Desde la codorniz y pato son ambas especies criados comercialmente, un suministro de huevos fertilizados relativamente baratos está disponible de una variedad de granjas. Por lo tanto, esta técnica debe ser accesible a researcde ella opera dentro de una amplia gama de presupuestos y el espacio del establecimiento. Aunque esta técnica es muy poderosa, aún quedan varias limitaciones. Al igual que otras técnicas quirúrgicas, la calidad y la viabilidad de las quimeras de codorniz-pato se basan en las habilidades quirúrgicas del investigador, y por lo tanto, habrá mayor variación inter e intra-individual entre los experimentos en comparación con otros modelos, como los que utilizan el ratón genética. Por otra parte, también hay variación en las tasas de desarrollo y etapas de embriones individuales que contribuye a la reproducibilidad y el éxito de cada trasplante. Embriones de aves son también muy susceptibles a la deshidratación y por lo tanto los pasos críticos durante la cirugía incluyen mantener los niveles de luz baja, el tiempo bajo el microscopio a un mínimo, los huevos sellados con cinta tanto como sea posible, y alta humedad en la incubadora después de la operación a evitar la desecación. En cuanto a la viabilidad de las quimeras, usually entre 50-75% sobreviven, aunque estos porcentajes pueden disminuir cuanto mayor la etapa de recolección. En una típica sesión de 4-6 horas de la cirugía, un cirujano experimentado puede generar 10-15 quimeras. El éxito de los trasplantes también depende en gran medida de la calidad de las herramientas. Las buenas herramientas conducen a resultados más consistentes y reproducibles. El uso de un soplete de propano para que las agujas de tungsteno permite agujas muy afiladas para hacerse. El tipo de la antorcha utilizada hace una gran diferencia, ya que controla el tamaño de la llama. Afilar electrolítico también se puede utilizar, pero este enfoque no llega siquiera a acercarse a la producción de agujas como agudo. Utilice barras de tungsteno en vez de alambre de la cola de impresión de manera que las agujas pueden ser enderezados. La micropipeta Spemann, mientras que consume mucho tiempo y es difícil de hacer, es un instrumento ideal para la transferencia de tejido. La pipeta se puede personalizar con diferentes tamaños de aberturas, y se puede utilizar en varias ocasiones. Un factor crítico para usinGA Spemann micropipeta es tener algo de líquido en la pipeta antes de tocar la punta a la superficie del embrión. Parte del líquido siempre fluirá a cabo cuando se hace contacto con el menisco sobre el embrión. Al pulsar sobre el diafragma permite que el tejido fluido y el injerto sea expulsada con gran precisión, mientras que un poco dejando que el diafragma hacia arriba chupa suavemente el donante de tejido de injerto en la pipeta. El mantenimiento de un poco de presión positiva en el diafragma mantiene el tejido del injerto del donante en la punta de la pipeta durante la transferencia, y un poco de presión adicional sobre la membrana permite que el tejido del injerto donante para ser colocado deliberadamente en el huésped. Para la protección de la pipeta Spemann durante el almacenamiento y la esterilización, retire la bombilla del extremo ancho e inserte con cuidado la punta cónica en el bulbo. Coloque la pipeta Spemann en un tubo de ensayo de vidrio, cubrir la parte superior con papel de aluminio, y el autoclave antes de la cirugía. Después de varias pipetas son ready a esterilizar de nuevo para la cirugía, invertir las pipetas, calentar ellos casi a ebullición en la misma solución de agua destilada y detergente artículos de vidrio, y luego enjuagar varias veces con agua destilada. Pipetas Autoclave en sus tubos individuales. El tubo de goma que forma el diafragma y la pera de goma debe ser reemplazado después de varias esterilizaciones o cuando se convierten oscurecida y rígido. Muchos de los componentes de este protocolo involucran equipo peligroso. Por ejemplo, el procedimiento para hacer una Spemann Micropipeta implica tres tipos de llamas, así como calefacción, tirando, soplado, de flexión, corte y pulido de vidrio. Por lo tanto, el uso de equipo de protección personal (PPE), que aumenta la seguridad, tales como gafas y una bata de laboratorio es crítica. Además, debido a que muchas personas sufren de, o tienen el potencial de desarrollarse, alergia al huevo, siempre use guantes al manipular los huevos. Con estas precauciones en mente, el sistema quimérico codorniz pato iSA método seguro, eficaz, y relativamente accesible que tiene muchas aplicaciones futuras.

El esqueleto facial se desarrolla a partir del crecimiento y fusión de múltiples procesos faciales que se componen de la cresta neural y el mesénquima mesodérmico rodeado por ectodérmico y endodérmico 1-11 capas epiteliales. Eventos morfogenéticos dentro de cada proceso se rigen por las interacciones de señalización claras entre el mesénquima y el epitelio que rodean 12-16. Las alteraciones en estas interacciones de señalización y / o de sus efectores contribuyen a fenotipos de la enfermedad y también pueden ser relevantes para la evolución del esqueleto craneofacial 17, 18. Por lo tanto, dilucidar el momento y la naturaleza de las interacciones de tejidos tiene un gran potencial para aumentar nuestra comprensión de la biología del desarrollo y la evolución del esqueleto facial. El uso de embriones quiméricos para investigar las interacciones de tejidos tiene una larga historia en la biología del desarrollo. Este enfoque fue iniciado por Hans Spemann y su laboratorioquien descubrió embrionarias &quot;organizadores&quot; mediante el trasplante de tejidos entre los embriones de diferentes especies de anfibios. Spemann fue un maestro de las técnicas micro-quirúrgicas cuya mano-skills se complementa con su desarrollo de herramientas especializadas, en particular la pipeta Spemann. Viktor hamburguesa era un estudiante graduado en el laboratorio de Hans Spemann en Friburgo durante la década de 1920, que es cuando se llevaron a cabo los experimentos de trasplante originales que llevaron al Premio Nobel de Spemann. Cuando la hamburguesa se ​​trasladó a la Universidad de Washington en St. Louis en 1935, detalló el proceso de hacer una micropipeta Spemann en su Manual de Embriología Experimental 19. Dibujó Noden era un estudiante graduado en el laboratorio de la hamburguesa en la Universidad de Washington hasta 1972. Después de trasladarse a la Universidad de Massachusetts, Amherst y luego a la Universidad de Cornell, Noden continuó la fabricación y el uso de micropipetas Spemann por sus trasplantes quirúrgicos que implican quimeras de codorniz-pollo. Y# 160;. Mientras que un estudiante de posgrado, uno de los autores (Rich Schneider) capacitados con dibujó Noden en Cornell 1995-1998 El siguiente protocolo para la toma de una micropipeta Spemann se basa en descripciones escritas por la hamburguesa y Noden, e incluye modificaciones posteriores efectuadas por Schneider. El uso de quimeras de codorniz-chick para el estudio del desarrollo craneofacial y, especialmente, para la comprensión de la contribución de las células de la cresta neural fue iniciado por Noden y por Le Douarin a principios de 1970, revisado en Le Douarin et al 20. Este enfoque ha sido ampliamente adoptado en muchos estudios y por numerosos otros investigadores 1, 4, 5, 21-38. Las tasas equivalentes de crecimiento y morfología de codorniz y pollo hacen trasplantes dentro de ellas ideales para el estudio del destino de la célula y el rastreo de linaje. Sin embargo, debido a las similitudes entre la codorniz y de pollo, cambios morfológicos indUCED por las células del donante son difíciles de descifrar. Por el contrario, otros sistemas quiméricos aviar han incluido pato doméstico como una forma de estudiar los mecanismos que hacen que los embriones anatómicamente distinto 39-50. Más específicamente, el sistema quimérico codorniz-duck ofrece múltiples beneficios para discernir los efectos del donante en el host, y viceversa. En primer lugar, codorniz y pato embriones son diferentes en tamaño y forma del cuerpo, lo que proporciona una forma directa para explorar por donantes o mecanismos de acogida específicos de la formación de patrones ensayando dominios diferenciales de la expresión de genes (Figuras 1 A y B). En segundo lugar, codorniz y pato embriones tienen considerablemente diferentes ritmos de maduración, con la codorniz de incubación en 17 días y el pato de la eclosión en 28 días. Cresta neural trasplantado mantiene su tasa de maduración intrínseca dentro del entorno de acogida, y por lo tanto, es posible la identificación de los cambios temporales en la expresión génica, interacciones tisulares, histogénesis, y la morfogénesis51-57. Finalmente, el anticuerpo anti-nucleares de codorniz (Q ¢ PN) permite donantes y beneficiarios contribuciones celulares estar permanentemente distinguen entre sí mediante el reconocimiento de una proteína que se expresa de forma ubicua en las células de codorniz, pero ausente en las células de pato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">1x PBS</td>
			<td style="width:180px;">TEK</td>
			<td style="width:145px;">TEKZR114</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Hank&#8217;s BSS w/o Phenol Red</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">14025-092</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Neutral Red</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">N4638-5G</td>
			<td style="width:252px;">.22&#181;m filter-sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">18G Needles</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">305195</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">5 ml syringe</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">309646</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">No. 5 Dumont forceps</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">11252-20</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Straight Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14028-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14029-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Spemann Pipet</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Hand-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Egg holder</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Glass ashtray and modeling clay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Alcohol burner</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">04-245-1</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Transparent tape</td>
			<td style="width:180px;">3M Scotch</td>
			<td style="width:145px;">600</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Glass Stirring Rod</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">11-380C</td>
			<td style="width:252px;">Tip is narrowed and rounded using a flame</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Tungston wire (.004 x 3 inches)</td>
			<td style="width:180px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:145px;">7190</td>
			<td style="width:252px;">Tip is flame-sharpened in a propane torch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bunsun burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S49117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;22-183-632</td>
			<td>9-inch (229 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:169px;">rubber tubing</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-178C</td>
			<td style="width:252px;">amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">&#160;Propane fuel cylinder</td>
			<td>BernzOmatic</td>
			<td>UL2317</td>
			<td style="width:252px;">&#160;TX-9 with torch style &#34;A&#34; with a screw-on brass &#34;pencil flame&#34; torch&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond point pencil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-268912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber bulbs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S32325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

La generación de embriones quiméricos es un enfoque amplio y de gran alcance para el estudio de células destinos, las interacciones de tejidos y especies específicas contribuciones al histológico y el desarrollo morfológico de los embriones de vertebrados. En particular, el uso de embriones quiméricos ha establecido la importancia de la cresta neural en la dirección de la morfología específica de la especie del complejo craneofacial. El método descrito en este documento utiliza dos especies de aves, pato y codorniz, con notable diferente morfología craneofacial. Este método facilita en gran medida la investigación de la regulación molecular y celular del patrón específico de la especie en el complejo craneofacial. Los experimentos en embriones de codorniz y pato quiméricos ya han puesto de manifiesto las interacciones de tejido de la cresta neural mediada y comportamientos células autónomas que regulan el patrón específico de la especie en el esqueleto craneofacial, musculatura, y tegumento. La gran diversidad de derivados de la cresta neural sugiere un potencial significativopara futuras aplicaciones de la codorniz-duck sistema quimérico para entender el desarrollo de vertebrados, la enfermedad y la evolución.

Antes de su posterior análisis, la eficacia del trasplante necesita ser ensayada. Para histológico, la expresión morfológica, o el gen de análisis de muestras de tejido, células de codorniz deben ser detectados por inmunohistoquímica usando anticuerpo Q ¢ PN como se describe 36. Para los análisis de ARN, especies específicas de las contribuciones a los tejidos de interés se pueden calcular utilizando una estrategia basada en PCR 58. Después de la eficacia del trasplante ha sido validado, otras medidas de resultado morfológicas o moleculares pueden ser evaluados en quimeras. Las interacciones entre las células de la cresta neural donantes y tejidos derivados del huésped circundantes que subyacen histogénesis y la morfogénesis del complejo craneofacial adecuado previamente se han estudiado ampliamente. En particular, mesénquima de la cresta neural dirige la morfología específica de las especies de la cara 7, 13, 51, 59, modelo de la pluma 52, patrón de músculo 56 </s<html> arriba&gt; y cartílago 53, 57 a través de la regulación de la expresión génica de acogida. Por ejemplo, el mesénquima de la cresta neural dicta cuando se forma el hueso en la mandíbula por la regulación temporal Bmp4 expresión 55. Recientemente, las investigaciones se han centrado en las interacciones de tejidos que ocurren muy temprano en el desarrollo craneofacial. A este respecto, los experimentos que utilizan quimeras de codorniz-pato han demostrado embriones de acogida influyen en la migración de la cresta neural mediante la determinación de los límites morfológicos. Es decir, en los embriones quiméricos Quck, codorniz donante las células de la cresta neural migran hacia el host mandibular pato arco en un patrón de pato (Figura 1D). A pesar de esta contribución de acogida para el tamaño de la población de la cresta neural, de la cresta neural de donantes continúa generando un esqueleto mandibular que es-codorniz como en tamaño y forma (Figura 1E). e 1 &quot;fo: content-width =&quot; 6 pulgadas &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Quail-Duck Sistema quimérico. (A) codorniz y (B) cráneos de pato muestran diferencias considerables en tamaño y forma, y por lo tanto, son ideales para el uso de un sistema quimérico para estudiar el desarrollo craneofacial (modificado a partir de Tokia et al. 56). (C) Diseño experimental para generar unilaterales embriones quiméricos Quck de codorniz HH9.5 etapa de concordancia y embriones de pato. El pliegue neural se elimina de un lado de embriones de codorniz y trasplantado en embriones de pato después de una pieza equivalente del pliegue neural se ha eliminado. (D) células donantes de codorniz (verde) puede ser seguido en quimeras utilizando un anticuerpo anti-codorniz (Q ¢ PN) como se muestra en vista ventral de HH12 embrión quimérico. (F) En mandíbulas Quck en HH38, la codorniz donante deriva-Meckel7; s cartílago es más corto y más recto que la observada para el pato cartílago contralateral derivada del huésped de Meckel, que es más grande y curvada. Reproducido Tokita et al., Dev.. . Bio 306, 377 (2007) con permiso de Elsevier.

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Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

En este artículo se describe un método para generar embriones quiméricos que están diseñados para poner a prueba las contribuciones específicas de las especies de la cresta neural y / u otros tejidos para el desarrollo craneofacial.

Evaluar Aportes específicos de la especie para el desarrollo craneofacial Utilizando quimeras Quail-pato

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K vistas.  University of California at San Francisco.  En este artículo se describe un método para generar embriones quiméricos que están diseñados para poner a prueba las contribuciones específicas de las especies de la cresta neural y / u otros tejidos para el desarrollo craneofacial. 

Video: Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Desarrollo de nuevas aplicaciones terapéuticas con microfluídica

Investigación

Biología

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

En vivo bioluminiscente de imágenes de tumores de mama mediante el espectro de IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tejido diana quimeras embrionarias: pez cebra Gástrula Trasplante de células

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation de embriones de medaka y trasplante de células para la generación de quimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Sistema de célula cerrada Cultura protocolo mediante buques HyperStack con la tecnología de materiales permeables al gas

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporación de mesénquima craneofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

Un enfoque semi-cuantitativo para evaluar la formación de biopelículas Con el desarrollo de colonias arrugada

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

La conversión de un ELISA de captura para un ensayo de Luminex xMAP utilizando un anticuerpo Multiplex Método de detección

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

La evaluación de la resistencia murino Función Arterial Utilizando miografía Presión

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...