Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial (NIDCR) concessão F32 (DE021929) para JLF e uma bolsa DE016402 NIDCR R01 para RAS

1. Prepare tungstênio Agulhas <ol><li> Corte uma haste de tungstênio ao meio usando cortadores de fio, de modo que a vara não dobrar. </li><li> Colocar a haste através da extremidade cónica de uma 5 3/4 em vidro de borosilicato pipeta Pasteur. </li><li> Deixando cerca de 3/4 em da degola rebento do vidro, aderem a vara para a ponta da pipeta com uma pequena pérola de &quot;adesivo hot melt&quot; (HMA), que é o bastão de cola usada para uma pistola de cola. O HMA deve ser rapidamente derretido em uma chama de álcool, tomando cuidado para não queimar a cola e gerar fumaça preta. </li><li> Utilizando um par de pinças, dobrar a ponta da haste de tungsténio (cerca de 1/4 a partir do topo final) até um ângulo de 45 ° é atingido. </li><li> Segurando a pipeta de Pasteur, colocar cerca de 1/8 da da ponta da haste de tungsténio na chama de uma lâmpada de propano. Segure a ponta firme e exatamente perpendicular à chama. </li><li> Retire a agulha da chama do momento que uma pequena mancha laranja de TUNGSdez moscas fora da agulha. </li></ol> 2. Prepare Spemann Pipettes <ol><li> Utilizando um bico de Bunsen, o calor da extremidade mais estreita de uma pipeta de Pasteur de vidro, até a pouco para além do afunilamento começa a derreter. Retire do fogo e puxe a ponta até a pipeta fica selado. Assegure-se que continua a haver uma porção da parte afunilada que tem um diâmetro externo de cerca de 0,7-1,0 mm. Quebre o final selada cerca de 4 cm do cone. </li><li> Anexar cerca de 2 pés (60 cm) de tubo de borracha para a largura (aberto) final da pipeta. Soprar sobre a outra extremidade do tubo de borracha para assegurar que nenhum ar pode passar através da parte cónica da pipeta Pasteur. </li><li> Usando um cilindro de gás propano com um maçarico de chama ligado lápis, aquecer uma área oval, de um lado da pipeta logo abaixo do início da conicidade. Soprar ar muito suavemente e constantemente, através do tubo de borracha, com uma pequena quantidade de pressão (aproximadamente a quantidade de pressão necessária para dizer que o início do letter &quot;P&quot; em nível de conversação). Quando o vidro se torna suave de um lado e começa a fivela para fora, remover rapidamente a pipeta da chama e golpe duro e constante através do tubo de borracha. Isso fará com que a parte aquecida do vidro para formar uma bolha em forma de salsicha que pode aparecer, que é bom. Se a bolha é muito pequeno, tente derretendo e soprando o vidro novamente. A última janela aberta no vaso deve ser de cerca de 0,25 in (6,35 mm) de largura por 0,5 cm (12,7 mm) de comprimento. </li><li> Apontando a extremidade cónica para cima, raspe a bolha em um recipiente de resíduos de vidro, enquanto soprando suavemente através do tubo para evitar que fragmentos de vidro de entrar na pipeta. </li><li> Usando a chama de propano, queimar as bordas restantes da bolha e fogo-polonês nas laterais da janela aberta. Tome cuidado para não derreter o eixo da pipeta. </li><li> Com um lápis ponto diamante, marcar a extremidade cónica da pipeta aproximadamente 1,25 em (30 mm) a partir da janela e quebrar a pontacom uma pinça, de modo que a abertura da pipeta é cortado de forma limpa (pipetas de descarte com pontas quebradas ou irregulares). </li><li> Usando fórceps e da borda de uma chama de um queimador de álcool, dobrar a porção estreita da pipeta em 0,375 (9,5 mm) a partir da ponta com um ângulo de aproximadamente 60 °, de modo que a parte dobrada está situado num plano vertical, quando da abertura da janela está na posição de 01:00 para o uso com a mão direita e as 11:00 h para o uso do canhoto. Este passo é melhor realizado em um free-projecto de gabinete. </li><li> -Polonês fogo a ponta usando a chama de álcool sob um microscópio de dissecação. Não se esqueça de fechar a ponta, mas sim manter a rodada de abertura e suave sem qualquer constrição. </li><li> Cortar um pedaço de 1 (25 mm) de um tubo de borracha, pulverizar o pedaço de tubo com 70% de etanol, e o tubo de deslize ao longo do eixo da pipeta até a abertura da janela está completamente coberto. Isso funciona como o &quot;diafragma&quot; da pipeta Spemann. </li><li> Coloque uma lâmpada ml látex de borracha 2sobre a parte inferior aberta da pipeta. A lâmpada mantém a pressão negativa na pipeta Spemann. </li><li> Para praticar o uso de uma pipeta de Spemann, transferir os grânulos de cromatografia de cerca de 100-200 um de diâmetro a partir de um ponto marcado em uma placa de Petri com um ponto marcado na outra sob um microscópio. </li><li> Para limpar a pipeta Spemann, retire o bulbo de borracha e local pipeta, ponta para baixo, em um copo alto forrado com algodão ou gaze na parte inferior e preenchido com água destilada e detergente copos. </li></ol> 3. Esterilizar e incubar ovos <ol><li> Wipe ovos com etanol a 70% e colocar os ovos em tabuleiros de plástico de ovo. </li><li> Definir os ovos numa incubadora aquecida a 37,5 ° C e 85-87%. </li><li> Incubar os ovos até que eles atinjam HH9.5, cerca de 26 horas, para a codorna e 48 horas para pato. </li></ol> 4. Janela Eggs <ol><li> Retirar uma pequena peça de concha exterior da parte superior do ovo com uma pinça, tendo o cuidado de não perfurar o invólucro interior membrane. </li><li> Usando uma seringa com uma agulha de 18 G por 1 polegada, fazer um buraco na ponta mais estreita do ovo e retirar aproximadamente 1-2 ml de albumina. </li><li> Coloque fita adesiva transparente sobre o buraco e marca punção no shell. </li><li> Cortar uma &quot;janela&quot; ao longo da superfície superior do ovo (através da fita transparente) usando uma tesoura curva. </li></ol> 5. Visualize Embriões e preparar para a cirurgia <ol><li> Usando uma vareta de vidro, escova suavemente uma pequena quantidade de vermelho neutro (0,02 g / mL em BSS de Hank) sobre o embrião. </li><li> Corte a membrana vitelina e puxe-o sobre o embrião usando uma agulha de tungstênio afiadas-chama. </li><li> Re-selar o ovo, colocando fita adesiva transparente sobre a janela. </li></ol> 6. Separe o tecido do doador a partir do embrião de Doadores <ol><li> Retire a fita da janela sobre o ovo do embrião doador. </li><li> Para cortar a dobra neural da ectoderme adjacente do embrião dador, fazer fendas em ambos sides do tubo neural, utilizando uma agulha afiada tungsténio-chamas (fabricado como descrito acima). </li><li> Em seguida, cortam o tubo neural aos níveis anteriores e posteriores desejadas do enxerto e o enxerto de separar do resto do tubo neural. </li><li> Remover a dobra neural do embrião dador utilizando uma pipeta de Spemann ou outro tipo de micropipeta. </li><li> Em seguida, retirar a fita adesiva a partir da janela sobre o ovo do hospedeiro e usar a pipeta Spemann para colocar a dobra neural doador ao lado do embrião hospedeiro adjacente à região do tubo neural, que vai receber o transplante. </li></ol> 7. Separe o tecido hospedeiro e Transplante do tecido do doador <ol><li> Separa-se a dobra neural do tubo neural do embrião hospedeiro, como feito com o doador. Tome cuidado para remover um enxerto de igual tamanho que o tecido do doador. </li><li> Suavemente empurrar este tecido hospedeiro longe do embrião. </li><li> Então, com uma agulha de tungstênio sem corte ou a ponta arredondada de um micropipette, mova suavemente o doador neural dobra no tubo neural de acolhimento, mantendo as orientações ântero-posterior e dorso-ventral adequadas. Certifique-se que o enxerto é dobrado ao longo dos lados, mas não se esqueça de picar ou danos aos tecidos subjacentes. Para ajudar a manter o controle da nota orientação original as assimetrias no tecido do doador ou coloração diferencial do vermelho neutro. Nós também foto-documento o embrião dador com o tecido que acompanha excisada, bem como a quimera imediatamente após a cirurgia. </li><li> Salina estéril deve ser adicionado ao ovo se o embrião hospedeiro mostra sinais de dessecação. </li><li> Agora, cuidadosamente re-vedação e rotular o ovo, e devolvê-lo suavemente para uma incubadora de humidade elevada (70-80%), onde o embrião quimérico pode desenvolver para a fase desejada para análise. </li></ol> 8. Recolha de Quimeras <ol><li> Certifique-se de coletar embriões quiméricos em acabado de fazer fixador frio da Serra e colocá-los imediatamente em uma rocker a 4 ° C durante uma fixação S / N. Isto irá permitir a detecção mais sensível de células de codorniz com o anticorpo anti-codorniz. </li><li> Para as análises de expressão gênica por meio de RT-qPCR, congelar embriões diretamente em nitrogênio líquido antes da extração de RNA. </li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A crista neural é uma população de células embrionárias transiente que migra muito em todo o embrião e diferencia-se em diversos tipos celulares, incluindo osteoblastos, condrócitos e que contribuem para o esqueleto craniofacial. Transplante crista neural no sistema quimérico codorna-pato tem contribuído grandemente para a nossa compreensão das interações de tecido e vias de sinalização que regulam o desenvolvimento do esqueleto craniofacial. No entanto, dado o vasto potencial da crista neural também gerar células musculares lisas, adipócitos, melanócitos, células de Schwann, neurônios, o sistema quimera codorna-pato tem um tremendo potencial para futuras aplicações, particularmente em conjunto com o rápido avanço da biologia de células-tronco e medicina regenerativa. Desde codorna e pato são as duas espécies criadas comercialmente, um pronto fornecimento de ovos fertilizados relativamente barata está disponível a partir de uma variedade de fazendas. Assim, esta técnica deve ser acessível a researcdela operando dentro de uma ampla gama de orçamentos e espaço facilidade. Embora esta técnica é muito poderosa, ainda há várias limitações. Como outras técnicas cirúrgicas, a qualidade ea viabilidade de quimeras codorna-pato confiar nas habilidades cirúrgicas do pesquisador e, portanto, não haverá mais variação inter e intra-individual entre os experimentos, em comparação com outros modelos, como aqueles que utilizam o mouse genética. Além disso, há também a variação nas taxas de desenvolvimento e as fases de embriões individuais que contribuem para a reprodutibilidade e sucesso de cada transplante. Embriões de aves também são muito suscetíveis à desidratação e, portanto, as etapas críticas durante a cirurgia incluem manter os níveis de luz baixa, o tempo sob o microscópio a um mínimo, os ovos seladas com fita adesiva, tanto quanto possível, e alta umidade na incubadora de pós-operatório de evitar a dessecação. Em termos de viabilidade das quimeras, usually entre 50-75% sobrevivem, embora estas percentagens podem diminuir o mais velho a etapa de coleta. Em uma típica sessão de 4-6 horas de cirurgia, um cirurgião experiente pode gerar 10-15 quimeras. O sucesso dos transplantes também depende muito da qualidade das ferramentas. Boas ferramentas de levar a resultados reprodutíveis, mais consistentes. Usando um maçarico para fazer agulhas de tungstênio permite agulhas extremamente afiadas para ser feita. O tipo de tocha usado faz uma grande diferença, pois controla o tamanho da chama. Nitidez eletrolítica também pode ser usado, mas esta abordagem não chega nem perto de produzir agulhas tão acentuada. Utilize hastes de tungstênio em vez de fios acondicionados em bobinas de modo que as agulhas podem ser feitas em linha reta. A micropipeta de Spemann, enquanto que consome tempo e é difícil de fazer, é um instrumento ideal para a transferência do tecido. A pipeta pode ser personalizado com diferentes tamanhos de aberturas, e pode ser utilizado repetidamente. Um fator crítico para usinga Spemann micropipeta é ter algum líquido no pipeta antes de tocar a ponta para a superfície do embrião. Algum do fluido irá fluir sempre para fora quando o contacto é feito com o menisco sobre o embrião. Pressionando sobre o diafragma permite que o tecido fluido e enxerto a ser ejetado de forma muito precisa, ao passo que um pouco desistir no diafragma suavemente suga o tecido doador do enxerto para a pipeta. A manutenção de um pouco de pressão positiva no diafragma mantém o tecido do enxerto doador na ponta da pipeta durante a transferência, e um pouco de pressão adicional sobre o diafragma permite que o tecido do enxerto doador para ser deliberadamente colocado no hospedeiro. Para a proteção da pipeta Spemann durante o armazenamento e esterilização, retire a lâmpada a partir do final de largura e insira cuidadosamente a ponta cônica para o bulbo. Coloque a pipeta Spemann em um tubo de ensaio de vidro, cubra a parte superior com uma folha de alumínio, e autoclave antes da cirurgia. Após várias pipetas são reAdy para ser esterilizado novamente para a cirurgia, inverter as pipetas, aquecê-los quase a ferver na mesma solução de água destilada e de detergente de vidro, e em seguida enxaguar repetidamente com água destilada. Pipetas Autoclave em seus tubos individuais. O tubo de borracha que se forma o diafragma eo bulbo de borracha deve ser substituído depois de várias esterilizações ou quando se tornam escurecido e duro. Muitos dos componentes do presente protocolo envolve equipamento perigoso. Por exemplo, o procedimento para a realização de um Spemann Micropipeta envolve três tipos de chamas, bem como aquecimento, puxar, sopro, dobra, corte e polimento de vidro. Portanto, uso de equipamento de proteção individual adequado (PPE), que aumenta a segurança, como óculos de proteção e um jaleco é crítica. Além disso, porque muitas pessoas sofrem, ou têm potencial para se desenvolver, alergias ao ovo, use sempre luvas ao manusear ovos. Com estas precauções em mente, o sistema quimérico codorna-pato isa método seguro, eficiente e relativamente acessível, que tem muitas aplicações futuras.

O esqueleto facial desenvolve com o crescimento e fusão de vários processos faciais que são compostos de crista neural e mesodermal mesenchyme cercado por ectodérmica e camadas epiteliais endoderme 1-11. Eventos morfogenéticos dentro de cada processo são regidos por interações de sinalização distintas entre o mesênquima e epitélio em torno de 12-16. Alterações a estas interações de sinalização e / ou seus efetores downstream contribuir para fenótipos da doença e também pode ser relevante para a evolução do esqueleto craniofacial 17, 18. Portanto, elucidando o momento ea natureza das interações de tecido tem um grande potencial para aumentar a nossa compreensão da biologia do desenvolvimento e da evolução do esqueleto facial. A utilização de embriões quiméricos para investigar as interações de tecido tem uma longa história em biologia do desenvolvimento. Esta abordagem foi iniciada por Hans Spemann e seu laboratórioque descobriu embrionárias &quot;organizadores&quot; através do transplante de tecidos entre os embriões de diferentes espécies de anfíbios. Spemann era um mestre de técnicas de micro-cirúrgicos, cuja mão-habilidades foram complementadas com o seu desenvolvimento de ferramentas especializadas, nomeadamente a pipeta Spemann. Viktor Hamburger era um estudante de pós-graduação no laboratório de Hans Spemann em Freiburg durante a década de 1920, que é quando os experimentos de transplante de originais que levaram ao Prêmio Nobel da Spemann foram realizados. Quando Hamburger mudou-se para Washington University, em St. Louis, em 1935, ele detalhou o processo de fazer uma micropipeta Spemann em seu Manual de Embriologia Experimental 19. Desenhou Noden era um estudante de pós-graduação no laboratório de Hamburger na Universidade de Washington até 1972. Depois de se mudar para a Universidade de Massachusetts, Amherst e depois para a Universidade de Cornell, Noden continuou fabricando e usando micropipetas Spemann por seus transplantes cirúrgicos envolvendo quimeras codorna-galinha. &amp;# 160;. Enquanto um estudante de pós-graduação, um dos autores (Rich Schneider) treinados, com Drew Noden em Cornell 1995-1998 O protocolo a seguir para fazer uma micropipeta Spemann é baseado em descrições escritas por Hamburger e Noden e inclui modificações subseqüentes feitas por Schneider. O uso de quimeras codorna-de bico para o estudo do desenvolvimento craniofacial e, especialmente, para a compreensão das contribuições de células da crista neural foi iniciada por Noden e por Le Douarin no início de 1970, revisto em Le Douarin et al 20. Esta abordagem tem sido amplamente adotado em muitos estudos e por inúmeros outros pesquisadores 1, 4, 5, 21-38. As taxas equivalentes de crescimento e morfologia de codorna e galinha fazer transplantes dentro deles ideal para o estudo do destino celular e rastreamento de linhagem. No entanto, por causa das semelhanças entre codorna e galinha, alterações morfológicas induced por células do doador são difíceis de decifrar. Em contraste, outros sistemas quiméricos aviária incluíram pato doméstico como uma forma de estudar os mecanismos que fazem embriões anatomicamente distinto 39-50. Mais especificamente, o sistema quimérico codorna-pato oferece vários benefícios para discernir os efeitos do doador sobre o hospedeiro, e vice-versa. Primeiro, os embriões de codorna e pato são distintas no tamanho do corpo e forma, que fornece uma maneira direta para explorar ou doador-mecanismos específicos do hospedeiro de formação de padrões através da análise para domínios diferenciais de expressão gênica (Figuras 1 A e B). Em segundo lugar, os embriões de codorna e pato têm consideravelmente diferentes taxas de maturação, com codorna incubação em 17 dias e pato eclosão em 28 dias. Crista neural transplantados mantém a sua taxa de maturação intrínseca dentro do ambiente de acolhimento e, assim, a identificação de mudanças temporais na expressão gênica, interações tecido, histogênese e morfogênese é possível51-57. Finalmente, o anticorpo anti-nuclear de codorniz (Q ¢ PN) permite que os dadores e albergar as contribuições celulares para ser permanentemente distinguidos um do outro através do reconhecimento de uma proteína que é expressa ubiquamente em células de codorniz, mas ausente de células de pato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">1x PBS</td>
			<td style="width:180px;">TEK</td>
			<td style="width:145px;">TEKZR114</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Hank&#8217;s BSS w/o Phenol Red</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">14025-092</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Neutral Red</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">N4638-5G</td>
			<td style="width:252px;">.22&#181;m filter-sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">18G Needles</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">305195</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">5 ml syringe</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">309646</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">No. 5 Dumont forceps</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">11252-20</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Straight Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14028-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14029-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Spemann Pipet</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Hand-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Egg holder</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Glass ashtray and modeling clay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Alcohol burner</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">04-245-1</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Transparent tape</td>
			<td style="width:180px;">3M Scotch</td>
			<td style="width:145px;">600</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Glass Stirring Rod</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">11-380C</td>
			<td style="width:252px;">Tip is narrowed and rounded using a flame</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Tungston wire (.004 x 3 inches)</td>
			<td style="width:180px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:145px;">7190</td>
			<td style="width:252px;">Tip is flame-sharpened in a propane torch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bunsun burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S49117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;22-183-632</td>
			<td>9-inch (229 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:169px;">rubber tubing</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-178C</td>
			<td style="width:252px;">amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">&#160;Propane fuel cylinder</td>
			<td>BernzOmatic</td>
			<td>UL2317</td>
			<td style="width:252px;">&#160;TX-9 with torch style &#34;A&#34; with a screw-on brass &#34;pencil flame&#34; torch&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond point pencil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-268912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber bulbs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S32325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

A geração de embriões quiméricos é uma abordagem ampla e poderosa para estudar os destinos celulares, interações tecido e espécie-específicos contribuições para a análise histológica e desenvolvimento morfológico dos embriões vertebrados. Em particular, a utilização de embriões quiméricos estabeleceu a importância da crista neural em dirigir a morfologia específica da espécie do complexo craniofacial. O método aqui descrito utiliza duas espécies de aves, pato e codorniz, com notavelmente diferente morfologia craniofacial. Este método facilita muito a investigação da regulação molecular e celular de padrão específico da espécie no complexo craniofacial. Experimentos em codorna e pato embriões quiméricos já revelaram interações mediadas tecido da crista neural e comportamentos de células-autônoma que regulam padrão espécie-específicos no esqueleto craniofacial, musculatura e tegumento. A grande diversidade de derivados da crista neural sugere um potencial significativopara futuras aplicações do sistema quimérico codorna-pato para a compreensão do desenvolvimento dos vertebrados, doenças e evolução.

Antes de posterior análise, a eficiência do transplante tem de ser ensaiada. Para análise histológica, análises de expressão morfológica, ou gene em amostras de tecido, células de codorniz deve ser detectado por imuno-histoquímica utilizando anticorpos Q ¢ PN tal como descrito 36. Para as análises de RNA, espécie-específicos contribuições para os tecidos de interesse pode ser calculada usando uma estratégia baseada em PCR 58. Após a eficácia do transplante foi validado, outras medidas de resultados morfológicas ou moleculares pode ser avaliada em quimeras. As interações entre as células da crista neural doadores e tecidos circundantes derivados do hospedeiro que fundamentam histogênese adequada e morfogênese do complexo craniofacial já sido extensivamente estudada. Em particular, mesênquima da crista neural dirige morfologia específica da espécie da face 7, 13, 51, 59, teste padrão da pena 52, padrão muscular 56 </s<html> up&gt; e cartilagem 53, 57 através da regulação da expressão gênica host. Por exemplo, mesênquima da crista neural dita quando formas de osso na mandíbula por temporalmente regulação da expressão Bmp4 55. Recentemente, investigações têm-se centrado nas interações tecido que ocorrem muito cedo no desenvolvimento craniofacial. Neste sentido, experiências utilizando quimeras codorna-pato mostraram embriões hospedeiros influenciar a migração da crista neural, determinando limites morfológicos. Ou seja, em embriões quck quiméricos, células da crista neural doador de codorna migrar para o anfitrião pato mandibular arco em um padrão de pato-like (Figura 1D). Apesar de esta contribuição hospedeiro ao tamanho da população da crista neural, da crista neural doador continua a gerar um esqueleto mandibular que é codorniz semelhante em tamanho e forma (Figura 1E). e 1 &quot;fo: Content-width =&quot; 6 pol &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Quail-Duck Chimeric sistema. (A) Quail e (B) crânios pato apresentam diferenças consideráveis ​​em tamanho e forma, e, portanto, são ideais para o uso de um sistema quimérico para estudar o desenvolvimento craniofacial (modificado de Tokia et al. 56). (C) O delineamento experimental para a geração de embriões quiméricos quck unilaterais de correspondência de fase HH9.5 codorna e embriões de pato. A dobra neural é removido de um lado de embriões de codorniz e transplantadas em embriões de pato após uma peça equivalente da dobra neural foi removido. (D) As células doadoras de codorniz (verde) pode ser seguido em quimeras utilizando um anticorpo anti-codorniz (Q ¢ PN) como mostrado na vista ventral de H12 embrião quimérico. (F) em mandíbulas quck em HH38, a codorna doador-derivadas Meckel7; s cartilagem é mais curto e mais reto do que a observada para a cartilagem contralateral derivados do hospedeiro pato de Meckel, que é maior e curvado. Reproduzido Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007) com permissão da Elsevier.

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Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Este artigo descreve um método para gerar embriões quiméricos que são projetados para testar as contribuições específicas de espécies de crista neural e / ou outros tecidos para o desenvolvimento craniofacial.

Avaliando Contribuições Espécies específicas Para o Desenvolvimento Craniofacial Utilizando Quimeras Codorniz-pato

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K visualizações.  University of California at San Francisco.  Este artigo descreve um método para gerar embriões quiméricos que são projetados para testar as contribuições específicas de espécies de crista neural e / ou outros tecidos para o desenvolvimento craniofacial. 

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Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Desenvolvimento de novas aplicações terapêuticas Usando microfluídica

Biologia

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Bioluminescent imagem de tumores mamários Usando Spectrum IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Eletroporação de Mesênquima Craniofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

Uma abordagem semi-quantitativa para avaliar formação de biofilmes usando o desenvolvimento da colônia enrugado

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

A conversão de um ELISA de captura para um ensaio de xMAP Luminex usando um método de rastreio de anticorpos Multiplex

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

Avaliando Murino Resistência Função Usando Miografia Pressão Arterial

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...