Diese Arbeit wurde durch ein National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung (NIDCR) F32-Stipendium (DE021929), um JLF und NIDCR R01 Zuschuss DE016402 RAS finanziert

1. Bereiten Tungsten Nadeln <ol><li> Schneiden Sie ein Wolframstab in die Hälfte mit Drahtschneider, so dass die Stange nicht verbiegt. </li><li> Fädeln Sie den Stab durch die sich verjüngende Ende einer 5 3/4 in Borosilikatglas Pasteur Pipette. </li><li> Wobei ungefähr 3/4 in der Stange ragte aus dem Glas haften die Stange in die Pipettenspitze mit einem kleinen Wulst &quot;Heißschmelzkleber&quot; (HMA), die für eine Klebepistole verwendet Klebestift ist. Die HMA sollte sich schnell in einem Alkohol-Flamme geschmolzen werden, kümmert sich nicht um den Kleber zu verbrennen und schwarzen Rauch erzeugen. </li><li> Mit einer Zange, biegen Sie die Spitze der Wolframstab (ca. 1/4 in der oberen Ende), bis ein Winkel von 45 ° erreicht wird. </li><li> Halten des Pasteur-Pipette, stellen etwa 1/8 in der Spitze des Wolframstabes in die Flamme eines Propanbrenners. Halten Sie die Spitze stabil und exakt senkrecht zur Flamme. </li><li> Ziehen Sie die Nadel aus der Flamme der Moment, eine winzige Spur von Orange tungszehn Fliegen von der Nadel. </li></ol> 2. Bereiten Spemann Pipetten <ol><li> Mit einem Bunsenbrenner erhitzen, das schmale Ende einer Pasteur-Pipette, bis das Glas kurz über die Verjüngung zu schmelzen beginnt. Vom Herd nehmen und ziehen Sie die Spitze, bis die Pipette wird abgedichtet. Achten Sie darauf, dass es bleibt ein Teil des konischen Teil, der einen Außendurchmesser von ca. 0,7 bis 1,0 mm aufweist. Brechen Sie das verschlossene Ende aus etwa 4 cm von der Verjüngung. </li><li> Befestigen etwa 2 Fuß (60 cm) Gummischlauch der breiten (offene) Ende der Pipette. Schlag auf das andere Ende des Gummischlauchs, um sicherzustellen, daß keine Luft durch den konischen Teil des Pasteur-Pipette passieren. </li><li> Verwendung eines Propanbrennstoffzylinder mit einem daran befestigten Stift Flammenbrenner, Wärme eine ovale Fläche auf einer Seite der Pipette gerade unterhalb dem Beginn der Verjüngung. Blasen Luft sehr leicht und ständig durch den Gummischlauch mit einem leichten Druck (ungefähr die Menge an Druck benötigt, um den Beginn der Lette sagenr &quot;P&quot; am Gespräch Ebene). Wenn das Glas weich wird auf der einen Seite und beginnt, nach außen wölben, die Pipette schnell zu entfernen, von der Flamme und blasen hart und stabil durch den Gummischlauch. Dadurch wird der beheizte Teil des Glases, eine wurstförmige Blase, die Pop-, das ist gut zu bilden. Wenn die Blase zu klein ist, versuchen Schmelzen und bläst das Glas wieder. Die endgültige offenen Fenster in dem Glas sollte etwa 0,25 in (6,35 mm) breit und 0,5 Zoll (12,7 mm) lang sein. </li><li> Zeige das verjüngte Ende nach oben, kratzen die Blase in eine Glasabfallbehälter während sanft weht durch den Schlauch zum Glasfragmente in die Pipette zu verhindern. </li><li> Mit der Propanflamme, verbrennen die übrigen Kanten der Blase und Feuerpolitur die Seiten der offenen Fenster. Achten Sie darauf, um die Welle der Pipette zu schmelzen. </li><li> Mit einer Diamantspitze Bleistift, punkten die verjüngte Ende der Pipette etwa 1,25 in (30 mm) aus dem Fenster und brechen Sie die Spitzemit einer Pinzette, so dass der Pipettenöffnung ist sauber geschnitten (Ablage Pipetten mit gebrochenen oder unebenen Spitzen). </li><li> Mit einer Pinzette und dem Rand einer Flamme aus einem Brenner Alkohol, beugen der schmale Abschnitt der Pipetten 0,375 in (9,5 mm) von der Spitze bis zu einem Winkel von etwa 60 °, so dass der gebogene Abschnitt in einer vertikalen Ebene, wenn die Fensteröffnung ist am 01.00 Position für Rechtshänder Nutzung und 11:00 Uhr für Linkshänder Nutzung. Dieser Schritt wird am besten in einem zugfreien Gehäuse durchgeführt. </li><li> Brandlack die Spitze mit der Alkoholflamme unter einem Binokular. Achten Sie darauf, nicht zu schließen, von der Spitze zu halten, sondern um die Öffnung und glatt, ohne Verengung. </li><li> Schneiden Sie eine 1 in (25 mm) Stück Gummischlauch, Spray der Schlauchstück mit 70% Ethanol, und schieben Sie den Schlauch über den Schaft der Pipette, bis die Fensteröffnung vollständig bedeckt ist. Dieser fungiert als &quot;Membran&quot; der Spemann-Pipette. </li><li> Legen Sie eine Latex-Gummi-Birne 2 mlüber den offenen Boden der Pipette. Die Lampe behält Unterdruck im Spemann Pipette. </li><li> Um der Praxis mit einem Spemann Pipette Chromatographie Perlen von rund 100 bis 200 um im Durchmesser von einer markierten Stelle in eine Petrischale zu einer markierten Stelle in einem anderen unter dem Mikroskop. </li><li> Zur Reinigung des Spemann-Pipette, entfernen Sie den Gummiball und Ort Pipette, Spitze nach unten, in ein hohes Becherglas mit Baumwolle oder Gaze am Boden ausgekleidet und mit destilliertem Wasser und Glasreinigungsmittel gefüllt. </li></ol> 3. Sterilisieren und Eier inkubieren <ol><li> Wischen Eier mit 70% Ethanol und die Eier auf Kunststoffeierablagen. </li><li> Stellen Sie Eier in einem Wärmeschrank bei 37,5 ° C und 85-87%. </li><li> Eier auszubrüten, bis sie HH9.5, ca. 26 h für Wachteln und 48 Stunden für die Ente zu erreichen. </li></ol> 4. Fenster Eier <ol><li> Entfernen Sie ein kleines Stück der Außenhülle von der Spitze des Eies mit einer Pinzette, kümmert sich nicht um die Innenschale m Punktionembrane. </li><li> Unter Verwendung einer Spritze mit einer 18 G um 1-Zoll-Nadel, stoßen ein Loch an der engsten Spitze des Ei-und zurücktreten etwa 1-2 ml Albumin. </li><li> Zeigen transparenten Klebeband über das Loch und Einstichstelle in der Schale. </li><li> Schneiden ein &quot;Fenster&quot; auf der oberen Oberfläche des Eies (durch das durchsichtige Band) mit einer gebogenen Schere. </li></ol> 5. Visualisieren Embryonen und Vorbereitung für Chirurgie <ol><li> Mit einem Glasstab, Pinsel vorsichtig eine kleine Menge von Neutral Rot (0,02 g / ml in Hanks BSS) über den Embryo. </li><li> Schneiden Sie die Dotterhaut und ziehen ihn über den Embryo mit einem flamm geschärft Wolfram-Nadel. </li><li> Neu abdichten das Ei, indem transparente Klebeband über dem Fenster. </li></ol> 6. Trennen Sie das Spendergewebe aus dem Spender Embryo <ol><li> Entfernen Band aus dem Fenster auf dem Ei des Spenderembryo. </li><li> Um die neuronalen Stall aus dem angrenzenden Ektoderm des Spenders Embryo abgeschnitten sind, müssen Schlitze auf beiden sidn des Neuralrohrs, mit einem Flamm geschärft Wolfram Nadel (hergestellt wie oben beschrieben). </li><li> Dann wird über das Neuralrohr Schnitt an der gewünschten vorderen und hinteren Stufen des Transplantats und trennen das Transplantat von dem Rest des Neuralrohrs. </li><li> Entfernen des neuronalen Falte vom Spender Embryo unter Verwendung entweder eines Spemann Pipette oder eine andere Art von Mikropipette. </li><li> Dann entfernen Sie das Klebeband aus dem Fenster auf dem Host-Ei und verwenden Sie den Spemann-Pipette, um die Spender neuronalen Falte neben dem Wirtsembryo angrenzend an den Bereich des Neuralrohrs, die die Transplantation erhalten, werden zu platzieren. </li></ol> 7. Trennen Sie den Host-Gewebetransplantation und das Spendergewebe <ol><li> Trenne die neuronale fache des Neuralrohrs der Wirtsembryo, wie bei dem Spender durchgeführt. Achten Sie auf ein Transplantat von gleicher Größe wie das Spendergewebe zu entfernen. </li><li> Schieben Sie dieses Wirtsgewebe weit weg von den Embryo. </li><li> Dann, mit einem stumpfen Wolfram-Nadel oder der abgerundeten Spitze eines micropipette, sanft bewegen die Geber neuronalen in die Wirts Neuralrohr falten, die Aufrechterhaltung der richtigen anterior-posterioren und dorso-ventralen Orientierungen. Stellen Sie sicher, das Transplantat in an den Seiten versteckt, aber sicher sein, nicht zu stoßen oder Schäden an den darunter liegenden Gewebe. Um den Überblick über die ursprüngliche Ausrichtung Vermerk jeder Asymmetrie in der Spendergewebe oder Differential-Färbung aus der Neutral Red. Wir photo Dokument der Spender Embryo mit den beigefügten geschnittene Gewebe sowie der Chimäre unmittelbar nach der Operation. </li><li> Sterile Kochsalzlösung ist zum Ei gegeben werden, wenn die Wirtsembryo Anzeichen von Austrocknung. </li><li> Nun wieder vorsichtig Dichtung und beschriften Sie das Ei, und sanft schicken Sie es an einer hohen Feuchtigkeit Inkubator (70-80%), wo die chimären Embryo kann auf die gewünschte Stufe für die Analyse zu entwickeln. </li></ol> 8. Sammlung von Chimären <ol><li> Achten Sie darauf, chimären Embryonen in frisch zubereitete kalte Serras Fixiermittel zu sammeln und sofort legen sie auf ein Ro-cker bei 4 ° C für eine O / N-Fixierung. Dies wird für mehr empfindlichen Nachweis von Wachtel-Zellen mit dem anti-Wachtel-Antikörper zu ermöglichen. </li><li> Für Genexpressionsanalysen mittels RT-qPCR, gefrier Embryonen in flüssigem Stickstoff direkt vor der RNA-Extraktion. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Neuralleiste ist eine vorübergehende embryonalen Zellpopulation, die ausgiebig wandert den ganzen Embryo und differenziert in verschiedene Zelltypen, einschließlich Chondrozyten und Osteoblasten, die auf der kraniofazialen Skeletts beitragen. Umpflanzen Neuralleiste in der Wachtel-Ente chimären System hat wesentlich zu unserem Verständnis der Gewebe-Wechselwirkungen und Signalwege, die Entwicklung des Schädel-Gesichtsskeletts regulieren beigetragen. , Angesichts der riesigen Potenzial der Neuralleiste zu erzeugen auch glatte Muskelzellen, Fettzellen, Melanozyten, Schwann-Zellen und Neuronen, die ein enormes Potenzial für zukünftige Anwendungen, insbesondere in Verbindung mit der schnellen Weiterentwicklung der Stammzellbiologie jedoch die Wachtel-Ente Chimärensystem und der regenerativen Medizin. Da Wachteln und Enten sind beide kommerziell gezüchtete Arten, ist ein Vorrat an relativ preiswert befruchteten Eier aus einer Vielzahl von landwirtschaftlichen Betrieben zur Verfügung. Daher sollte diese Technik zugänglich sein researcihr Betrieb in einem weiten Bereich von Budgets und Anlage Raum. Obwohl diese Technik ist sehr leistungsfähig, gibt es weiterhin einige Einschränkungen. Wie andere chirurgische Techniken, die Qualität und die Lebensfähigkeit der Wachtel-Ente Chimären setzen auf die chirurgischen Fähigkeiten des Forschers, und deshalb wird es mehr inter-und intraindividuelle Unterschiede zwischen den Experimenten im Vergleich zu anderen Modellen, wie diejenigen, die Verwendung der Maus sein Genetik. Darüber hinaus gibt es auch Variationen in den Entwicklungsgeschwindigkeiten und Phasen der einzelnen Embryonen, die sich auf die Reproduzierbarkeit und den Erfolg jedes Transplantat trägt. Vogelembryonen sind auch sehr anfällig für Austrocknung und damit wichtige Schritte während der Operation gehören die Einhaltung der Lichtspiegel niedrig, die Zeit unter dem Mikroskop auf ein Minimum, die Eier mit Klebeband so viel wie möglich versiegelt und hoher Luftfeuchtigkeit in der postoperativen Inkubator Austrocknung zu vermeiden. In Bezug auf die Lebensfähigkeit der Chimären, usually zwischen 50-75% überleben, obwohl diese Prozentsätze können je älter die Sammelphase zu verringern. In einem typischen 4-6 h Sitzung der Operation kann ein erfahrener Chirurg 10-15 Chimären zu erzeugen. Der Erfolg der Transplantation hängt auch stark von der Qualität der Werkzeuge. Gute Werkzeuge führen zu konsistenten, reproduzierbaren Ergebnissen. Mit einem Propangasbrenner Wolfram Nadeln machen können extrem scharfen Nadeln gemacht werden. Die Art der Fackel verwendet, macht einen großen Unterschied, weil es die Größe der Flamme kontrolliert. Elektrolyt Schärfen kann auch verwendet werden, aber dieser Ansatz noch nicht einmal nahe kommen Herstellung Nadeln scharf. Verwenden Wolframstäben statt gespult Draht, so daß die Nadeln gerade werden. Die Spemann Mikropipette, während zeitaufwendig und schwierig zu machen, ist ein ideales Instrument für die Gewebetransfer. Die Pipette kann mit verschieden großen Öffnungen angepasst werden, und kann wiederholt verwendet werden. Ein kritischer Faktor für usinga Spemann Mikropipette ist, etwas Flüssigkeit in die Pipette, bevor Sie mit der Spitze an der Oberfläche des Embryos haben. Ein Teil des Fluids immer fließen, wenn der Kontakt mit dem Meniskus über dem Embryo gemacht. Durch Drücken auf die Membran ermöglicht Fluid-und Transplantatgewebe sehr genau ausgestoßen werden, während leicht lassen sich auf der Membran saugt sanft das Spendertransplantat Gewebe in die Pipette. Aufrechterhalten etwas positiver Druck auf die Membran hält das Spendertransplantat Gewebe an der Pipettenspitze während der Übertragung, und ein wenig zusätzlichen Druck auf die Membran erlaubt dem Spendertransplantat Gewebe gezielt in den Host abgegeben werden. Zum Schutz der Spemann-Pipette während der Lagerung und Sterilisation, entfernen Sie die Lampe aus dem breiten Ende und sorgfältig legen Sie die konische Spitze in der Birne. Setzen Sie den Spemann-Pipette in einem Reagenzglas, decken Sie die Oberseite mit Aluminiumfolie und Autoklavieren vor der Operation. Nach mehreren Pipetten sind ready wieder für die Operation sterilisiert werden, kehren die Pipetten, erwärmen sie fast zum Kochen in der gleichen Lösung aus destilliertem Wasser und Glasreinigungsmittel, und dann wiederholt mit destilliertem Wasser spülen. Autoklav Pipetten in ihre einzelnen Rohre. Der Schlauch, der die Membran und Gummidichtung bildet sollte nach mehreren Sterilisationen ersetzt werden, oder wenn sie abgedunkelten und steif werden. Viele der Komponenten dieses Protokoll beinhalten gefährlichen Geräten. Zum Beispiel das Verfahren zur Herstellung einer Mikropipette Spemann beinhaltet drei Arten von Flammen sowie Heizung, Ziehen, Blasen, Biegen, Schneiden und Polieren von Glas. Daher tragen richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA), die die Sicherheit erhöht, wie Schutzbrille und Laborkittel ist kritisch. Darüber hinaus, da viele Menschen leiden, oder haben das Potenzial, sich zu entwickeln, Ei Allergien, immer Handschuhe beim Umgang mit Eiern. Mit diesen Vorsichtsmaßnahmen beachten, die Wachtel-Ente chimären System isa sichere, effiziente und relativ zugängliche Methode, die viele zukünftige Anwendungen hat.

Der Gesichtsschädel entwickelt sich aus dem Wachstum und der Fusion von mehreren Gesichts Prozesse, die der Neuralleiste und mesodermalen Mesenchym von ektodermalen und endodermalen Epithelschichten 1-11 umgeben zusammengesetzt sind. Morphogenetischen Ereignisse innerhalb jedes Prozesses werden durch unterschiedliche Signal Wechselwirkungen zwischen dem Mesenchym und Umgebung Epithelien 12-16 geregelt. Änderungen dieser Signal Wechselwirkungen und / oder ihre Effektoren beitragen, Krankheitsphänotypen und kann auch relevant Entwicklung des kraniofazialen Skeletts 17, 18 sein. Daher Aufklärung der Zeitpunkt und die Art von Gewebe-Wechselwirkungen hat großes Potenzial, unser Verständnis von der Entwicklungs-und Evolutionsbiologie des Gesichtsschädels zu erhöhen. Die Verwendung von chimären Embryonen, Gewebe-Wechselwirkungen hat eine lange Geschichte in der Entwicklungsbiologie. Dieser Ansatz wurde von Hans Spemann und sein Labor Pionierdie embryonalen &quot;Organisatoren&quot; entdeckt durch die Transplantation von Gewebe zwischen Embryonen verschiedener Amphibienarten. Spemann war ein Meister der mikrochirurgischen Techniken, dessen Hand-Fähigkeiten wurden durch seine Entwicklung von Spezialwerkzeugen, insbesondere des Spemann-Pipette ergänzt. Viktor Hamburger war ein Doktorand im Labor von Hans Spemann in Freiburg in den 1920er Jahren, die, wenn die ursprünglichen Transplantation Experimente, die zu Spemann Nobelpreis geführt wurden durchgeführt ist. Beim Hamburger zog nach Washington University in St. Louis im Jahr 1935 detailliert er den Prozess der Herstellung eines Mikropipette Spemann in seinem Handbuch für Experimentelle Embryologie 19. Drew Noden war ein Student der Hamburger Labor an der Washington University, bis 1972. Nachdem er an die University of Massachusetts, Amherst und dann an der Cornell University, Noden weiterhin die Herstellung und Verwendung von Spemann Mikropipetten für seine chirurgische Transplantationen mit Wachtel-Küken Chimären. &amp;# 160;. Während ein Student, einer der Autoren (Rich Schneider) mit Drew Noden 1995-1998 Ausbildung an der Cornell Das folgende Protokoll für die Herstellung einer Mikropipette Spemann auf Beschreibungen von Hamburger und Noden geschrieben wurde, und schließt spätere Änderungen vorgenommen von Schneider. Die Verwendung von Wachtel-Küken Chimären für die Untersuchung der kraniofazialen Entwicklung und vor allem für das Verständnis der Beiträge der Neuralleistenzellen wurde von Noden und Le Douarin in den frühen 1970er Jahren Pionierarbeit geleistet, in Le Douarin et al 20 prüft. Dieser Ansatz wurde im Großen und Ganzen in vielen Studien und von zahlreichen anderen Forschern 1, 4, 5, 21-38 angenommen. Die entsprechenden Wachstumsraten und Morphologie von der Wachtel und Küken machen Transplantationen innerhalb sie ideal für die Untersuchung von Zellschicksals und Abstammung Verfolgung. Wegen der Ähnlichkeiten zwischen Wachtel und Küken, ind jedoch morphologische Veränderungenvon Spenderzellen uced sind schwer zu entziffern. Im Gegensatz dazu haben andere Vogel chimären Systeme Hausente als eine Möglichkeit, Mechanismen, die Embryonen anatomisch unterschiedliche 39-50 zu studieren enthalten. Genauer gesagt, bietet die Wachtel-Ente chimären System mehrere Vorteile für gehobene Ansprüche, die Auswirkungen des Spenders auf dem Host, und umgekehrt. Erstens sind die Wachtel und Entenembryonen in unterschiedlichen Körpergröße und-form, die einen direkten Weg, um Donor-oder Host-spezifische Mechanismen der Musterbildung durch Testen auf Differenz Domänen der Genexpression (Fig. 1 A und B) zu erkunden bietet. Zweitens, Wachtel-und Entenembryonen haben deutlich unterschiedliche Raten der Reifung mit Wachtelbrut in 17 Tagen und Entenbrut in 28 Tagen. Transplantierte Neuralleiste behält seine innere Reifung Rate innerhalb der Host-Umgebung, und somit ist die Identifikation der zeitlichen Veränderungen in der Genexpression, Gewebe-Wechselwirkungen, Histogenese und Morphogenese möglich51-57. Schließlich erlaubt die anti-Wachtelkern Antikörper (Q ¢ PN) Donor und zellulären Wirts Beiträge dauerhaft unterschieden werden voneinander durch Erkennen eines Proteins, die ubiquitär in Wachtel-Zellen exprimiert wird, aber außerhalb des Entenzellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">1x PBS</td>
			<td style="width:180px;">TEK</td>
			<td style="width:145px;">TEKZR114</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Hank&#8217;s BSS w/o Phenol Red</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">14025-092</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Neutral Red</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">N4638-5G</td>
			<td style="width:252px;">.22&#181;m filter-sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">18G Needles</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">305195</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">5 ml syringe</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">309646</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">No. 5 Dumont forceps</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">11252-20</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Straight Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14028-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14029-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Spemann Pipet</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Hand-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Egg holder</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Glass ashtray and modeling clay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Alcohol burner</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">04-245-1</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Transparent tape</td>
			<td style="width:180px;">3M Scotch</td>
			<td style="width:145px;">600</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Glass Stirring Rod</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">11-380C</td>
			<td style="width:252px;">Tip is narrowed and rounded using a flame</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Tungston wire (.004 x 3 inches)</td>
			<td style="width:180px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:145px;">7190</td>
			<td style="width:252px;">Tip is flame-sharpened in a propane torch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bunsun burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S49117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;22-183-632</td>
			<td>9-inch (229 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:169px;">rubber tubing</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-178C</td>
			<td style="width:252px;">amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">&#160;Propane fuel cylinder</td>
			<td>BernzOmatic</td>
			<td>UL2317</td>
			<td style="width:252px;">&#160;TX-9 with torch style &#34;A&#34; with a screw-on brass &#34;pencil flame&#34; torch&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond point pencil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-268912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber bulbs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S32325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

Die Erzeugung von Chimären-Embryonen ist eine weit verbreitete und leistungsfähige Ansatz zur Zellschicksale, Gewebe-Wechselwirkungen und Spezies-spezifische Beiträge zur histologischen und morphologischen Entwicklung von Wirbeltierembryonen zu studieren. Insbesondere ist die Verwendung von chimären Embryonen die Bedeutung Neuralleiste in die Leitung der artspezifischen Morphologie des kraniofazialen Komplex hergestellt. Das hier beschriebene Verfahren nutzt zwei Vogelarten, Enten und Wachteln, mit bemerkenswert unterschiedlichen Gesichtsschädelmorphologie. Dieses Verfahren erleichtert die Untersuchung von molekularen und zellulären Regulation der Spezies-spezifische Muster in der kraniofazialen Komplexes. Experimente in der Wachtel-und Enten chimären Embryonen bereits Neuralleiste-vermittelte Wechselwirkungen Gewebe und Zell-autonome Verhaltensweisen, die Spezies-spezifische Muster in der kraniofazialen Skelett, Muskulatur und Hautdecke regulieren enthüllt. Die große Vielfalt der Neuralleiste Derivate schlägt erhebliches Potenzialfür zukünftige Anwendungen der Wachtel-Ente chimären System zum Verständnis der Wirbeltierentwicklung, Krankheit und Evolution.

Vor der weiteren Auswertung muss die Effizienz der Transplantation untersucht werden. Für histologische Analysen morphologische, oder Gen-Expression auf Gewebeproben sollten Wachtelzellen durch Immunhistochemie mit Q ¢ PN Antikörper wie beschrieben 36 erkannt werden. Für die RNA-Analyse kann artspezifischen Beiträge Gewebe von Interesse unter Verwendung einer PCR-basierten Strategie 58 berechnet werden. Nachdem die Wirksamkeit der Transplantation bestätigt wurde, können weitere morphologische oder molekulare Endpunkte in Chimären ausgewertet werden. Wechselwirkungen zwischen den Geber Neuralleistenzellen und Umgebung Wirt stamm Gewebe, die richtige Histogenese und Morphogenese des kraniofazialen Komplex zugrunde liegen zuvor eingehend untersucht worden. Insbesondere Neuralleiste Mesenchym leitet Spezies-spezifische Morphologie des Gesichts 7, 13, 51, 59, 52 Feder-Muster-, Muskel-Muster 56 </s<html> bis&gt; und Knorpel 53, 57 durch die Regulierung der Genexpression Host. Zum Beispiel schreibt Neuralleiste Mesenchym wenn die Knochenformen im Unterkiefer durch zeitliche Regulierung Bmp4 Ausdruck 55. Kürzlich haben Untersuchungen an Gewebe-Wechselwirkungen sehr früh in der Entwicklung auftritt craniofacial zentriert. In diesem Zusammenhang Experimente nutzen Wachtel-Ente Chimären haben gezeigt, Host-Embryonen beeinflussen Neuralleiste Migration durch die Bestimmung morphologische Grenzen. Das heißt, in chimären quck Embryonen, in die Wirtsentenunterkiefer in eine Ente artiges Muster (Abbildung 1D) migrieren Spender Wachtel Neuralleistenzellen. Trotz dieser Host-Beitrag auf die Größe der Neuralleiste Bevölkerung, setzt der Spender Neuralleiste, eine Unterkiefer Skelett, Wachtel-wie in Größe und Form (1E) ist zu generieren. e 1 &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Wachtel, Ente Chimäre-System. (A) und Wachtel (B) Ente Schädel zeigen erhebliche Unterschiede in Größe und Form, und somit ideal für die Verwendung eines chimären System kraniofazialen Entwicklung zu studieren geeignet (von Tokia et al. 56 modifiziert). (C) Experimentelles Design zur Erzeugung einseitige chimären quck Embryonen von Stufe abgestimmt HH9.5 Wachtel-und Entenembryonen. Das neuronale Falte von einer Seite der Wachtelembryos entnommen und in Entenembryonen transplantiert nach einem gleichwertigen Teil des neuronalen Falte entfernt wurde. (D) Quail Spenderzellen (grün) in Chimären unter Verwendung eines Anti-Antikörpers Wachtel (Q folgen ¢ PN), wie in der Bauchansicht HH12 chimären Embryo gezeigt. (F) In quck Mandibeln an HH38, die Wachtel Spender abgeleiteten Meckel7, s Knorpel kürzer und gerader als die kontralaterale Ente Wirt stamm Meckel-Knorpel, der größer und gekrümmte beobachtet. Nachdruck Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007) mit Genehmigung von Elsevier.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras at JoVE.com

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Chimären-Embryonen, die entworfen sind, um die Spezies-spezifische Beiträge der Neuralleiste und / oder anderen Geweben zu testen kraniofazialen Entwicklung zu generieren.

Die Beurteilung artspezifische Um Beiträge Craniofacial Entwicklung mit Wachtel-Ente Chimären

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Aufrufe.  University of California at San Francisco.  Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Chimären-Embryonen, die entworfen sind, um die Spezies-spezifische Beiträge der Neuralleiste und / oder anderen Geweben zu testen kraniofazialen Entwicklung zu generieren. 

Serie: Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Entwicklung neuer therapeutischer Anwendungen mit Hilfe von Mikrofluidik

Forschung

Biologie

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Biolumineszenz Imaging von Brusttumoren mit IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tissue Gezielte Embryonale Chimären: Zebrafisch Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation von Medaka Embryonen und Zell-Transplantation für die Erzeugung von Chimären

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Die Beurteilung Signaling Eigenschaften von ektodermale Epithel Während Craniofacial Entwicklung

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

Ein semi-quantitativer Ansatz, um die Biofilmbildung Mit Wrinkled Colony Entwicklung zu bewerten

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

Beurteilung Murine Widerstand Artery Funktion Mit Druck Myographie

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...