この作品は、RASに歯科研究所とJLFの頭蓋顔面研究所（NIDCR）F32の助成金（DE021929）とNIDCR R01グラントDE016402によって賄われていた

1。タングステン針を準備<ol><li>ロッドが曲がらないようにワイヤーカッターを使用して半分にタングステン棒をカット。 </li><li>ホウケイ酸ガラスパスツールピペットで5 3/4のテーパ端部を通って棒を通します。 </li><li>グルーガンに使用スティックのりである、「ホットメルト接着剤」（HMA）の小さなビーズをピペットチップに棒を接着し、ガラスから突き出ロッドの約3/4が残る。 HMAはすぐに接着剤を燃やすと黒煙を発生しないように注意しながら、アルコールの炎で溶融されるべきである。 </li><li>ピンセットを用いて、45°の角度に到達するまで（約1/4の上端から内）タングステン棒の先端を曲げる。 </li><li>パスツールピペットを保持して、プロパントーチの炎にタングステン棒の先端の約1/8を配置します。安定した炎に正確に垂直先端を保持します。 </li><li>炎の外に針を引く瞬間tungsの小さなオレンジ色の斑点針のオフ10ハエ。 </li></ol> 2。シュペーマンピペットを準備<ol><li>まもなくテーパーを超えて、ガラスが溶け始めるまでブンゼンバーナーを使用して、パスツールピペットの狭い方の端を加熱する。炎から取り外し、ピペットがシールになるまで先端を引っ張る。約0.7〜1.0ミリメートルのODを持つテーパ部の一部が残っていることを確認してください。密封端先細りから約4cmを破る。 </li><li>ピペットの広い（開放）最後にゴム管の周囲に2フィート（60センチメートル）を取り付けます。空気がパスツールピペットのテーパ部を通過しないことを保証するためにゴム管のもう一方の端に吹く。 </li><li>付属の鉛筆火炎トーチとプロパン燃料ボンベを使用して、単にテーパーの開始以下のピペットの片側に楕円形の領域を加熱。圧力のわずかな量（レットの始まりと言うのに必要な圧力の約量のゴム管を通じて非常に優しく、常に空気を吹き込むR会話レベルでの「P」）。ガラスが一面に柔らかくなり、外側にバックルを開始すると、すぐに炎からピペットを取り外し、ゴム管を通じてハードと着実に吹く。これは、ガラスの加熱部分がうまくなる、ポップもソーセージ形の泡を形成するようになります。気泡が小さすぎると、再びガラスを溶融し、発泡試みる。ガラスの最後の開いているウィンドウは、長い（12.7ミリメートル）での0.5により、広い周囲の0.25（6.35ミリメートル）である必要があります。 </li><li>穏やかにピペットに入るのガラス破片を防ぐためにチューブを通して吹き込みつつ上方にテーパ状端部を指し、ガラス廃棄物容器内に泡を掻き取る。 </li><li>プロパン炎を使用して、バブルと火 - ポーランド開いているウィンドウの辺の残りのエッジを燃焼。ピペットのシャフトを溶融しないように注意してください。 </li><li>ダイヤモンドポイントの鉛筆を使用して、ウィンドウから約1.25（30ミリメートル）でのピペットのテーパー端をスコアチップを解消鉗子でピペット開口部はきれいにカットされているように（破線や凹凸ヒントを廃棄ピペット）。 </li><li>ときに窓開口屈曲部が垂直面内にあるように、鉗子およびアルコールバーナーからの火炎の縁部を用いて、約60°の角度に先端から（9.5 mm）の中にピペット0.375の狭い部分を曲げる左利きの使用のために右利きの使用状況と午前11時のため一時位置にある。このステップは、最高のドラフトのない筐体で行われる。 </li><li>解剖顕微鏡下でのアルコールの炎を使って火ポリッシュ先端。先端を閉鎖するのではなく円形の開口を維持し、任意のくびれのない滑らかなしないようにしてください。 </li><li> 、ゴム管の中の1（25ミリメートル）の部分をカットし、70％エタノールでチューブの一部をスプレーして、窓の開口部が完全に覆われるまで、ピペットのシャフトの上にチューブをスライドさせます。これはシュペーマンピペットの「ダイアフラム」として機能する。 </li><li>ラテックスゴム2ミリリットルの電球を配置ピペットの開放底部の上。電球はシュペーマンピペット内の負圧を維持している。 </li><li> 、シュペーマンピペットを使用して練習し、顕微鏡下で、別の著しい場所に1シャーレの著しい箇所から、直径で約100〜200ミクロンのクロマトグラフィービーズを転送します。 </li><li>シュペーマンピペットを洗浄するために、底に綿やガーゼを敷いた、蒸留水やガラス製品の洗浄剤で満たされた背の高いビーカーに、先端を下に、ゴム球と場所ピペットを削除します。 </li></ol> 3。卵を殺菌しインキュベート<ol><li> 70％エタノールで卵を拭くとプラスチックの卵トレイに卵を置きます。 </li><li> 37.5℃、85から87までパーセントで加熱されたインキュベーター内で卵を設定します。 </li><li>彼らはHH9.5、ウズラやアヒルのために48時間、約26時間後に到達するまで卵をインキュベートする。 </li></ol> 4。ウィンドウ卵<ol><li>内殻Mを穿刺しないように注意しながら、ピンセットで卵の上から外殻の小片を取り除くembrane。 </li><li> 1インチの針で18 gの注射器を用いて、卵の狭い先端の穴を突くと卵白の約1〜2ミリリットル撤回。 </li><li>殻に穴穿刺マークの上に透明のテープを配置。 </li><li>湾曲したハサミを使って（透明テープを介して）卵の上面に沿って「窓」を切った。 </li></ol> 5。胚を視覚化し、手術のための準備<ol><li>ガラス棒を用いて、胚の上に静かにニュートラルレッドを少量（ハンクスBSS 0.02グラム/ ml）を磨く。 </li><li>卵黄膜を切断して、火炎シャープタングステン針を使用して、胚の上に引き出します。 </li><li>ウィンドウの上に透明テープを配置することにより、卵を再密封する。 </li></ol> 6。ドナー胚からドナー組織を分離<ol><li>ドナー胚の卵の窓からテープを外します。 </li><li>ドナー胚の隣接する外胚葉から神経倍をカットするには、両方のSIDにスリットを作る（上記のように製造された）難鋭利なタングステン針を使用して、神経管のエス。 </li><li>その後、移植片の所望の前方および後方のレベルで神経管を横断し、神経管の他の部分から移植片を分離する。 </li><li>シュペーマンピペットまたはマイクロピペットの他のタイプのいずれかを使用して、ドナー胚から神経倍に削除します。 </li><li>そして、ホスト卵に窓に貼ったテープをはがし、移植を受ける神経管の領域に隣接する宿主胚と一緒にドナー神経フォールドを配置するシュペーマンピペットを使用しています。 </li></ol> 7。ホスト組織を分離し、ドナー組織を移植<ol><li>ドナーで行ったように、宿主胚の神経管から神経倍に分離する。ドナー組織として同じサイズの移植片を除去するように注意してください。 </li><li>そっと遠く胚からこの宿主組織を押してください。 </li><li>その後、鈍いタングステン針またはMIの丸いチップでcropipetteは、静かに、適切な前後方向と背腹方向を維持し、ホストの神経管に折りたたまドナー神経を移動します。移植片が側面に沿って中に隠れていることを確認してくださいますが、突くまたは下層組織に損傷しないようにしてください。元の位置のノートの中性赤からドナー組織または差動染色における任意の非対称性を追跡するのに役立ちます。我々はまた、フォトドキュメント伴う切除した組織とドナー胚と同様に、キメラはすぐに手術後。 </li><li>宿主胚は、乾燥の兆候を示している場合に滅菌生理食塩水、卵を追加する必要があります。 </li><li>今、慎重に再シールと卵にラベルを付け、ゆっくりキメラ胚を分析のために必要な段階に開発することができ、高湿インキュベーター（百分の70から80）に戻します。 </li></ol>キメラの8。コレクション<ol><li>作りたての寒セラの固定液にキメラ胚を収集し、すぐにROにそれらを配置することを確認してくださいO / N固定のため4℃でcker。これは、抗ウズラ抗体とウズラ細胞のより高感度な検出を可能にする。 </li><li>遺伝子発現は、RT-qPCRを介して分析のために、RNA抽出前に液体窒素で直接胚を凍結する。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

神経堤は、胚全体で広範囲に移動し、頭蓋顔面の骨格に貢献軟骨細胞および骨芽細胞を含む多様な細胞型、に分化する過渡胚細胞集団である。ウズラ、アヒルキメラ系における神経堤を移植すると、頭蓋顔面骨格の発達を制御する組織相互作用およびシグナル伝達経路の理解に大きく貢献しています。しかしながら、平滑筋細胞、脂肪細胞、メラニン細胞、シュワン細胞、および神経細胞を生成するための神経堤の大きな可能性を考えると、ウズラ、アヒルキメラ系は、特に、幹細胞生物学の急速な発展に関連して、将来の用途のための多大な可能性を有する再生医療。ウズラやアヒルが両方の商業的に飼育種であるため、比較的安価な受精卵の準備供給は農場の様々な利用可能です。このように、この技術はresearcにアクセス可能でなければなりません彼女は、予算や設備スペースの広い範囲で動作する。 この技術は非常に強力ですが、いくつかの制限が残っている。その他の外科技術と同様に、ウズラ、アヒルキメラの質と生存率は、研究者の外科的なスキルに依存しているため、このようなマウスを利用したものなど、他のモデルと比較して実験間のより多くの間および個人内変動があるだろう遺伝学。また、各移植の再現性と成功に貢献し、開発し、個々の胚の段階の速度のばらつきもあります。鳥類の胚はまた、脱水症状に大変影響を受けやすいと手術中、したがって重要なステップは最小限に、顕微鏡下で、低い時間を光のレベルを維持含まれ、可能な限りテープで密封卵、術後のインキュベーター内で高湿度に乾燥を避ける。 キメラの生存能力の点で、uはこれらの割合は、古いコレクションのステージを減少させることができますがsually百分の50から75までの間、存続する。手術の典型的な4-6時間のセッションでは、経験豊富な外科医は、10月15日キメラを生成することができます。移植の成功はまた、ツールの品質に大きく依存する。良いツールは、より一貫性のある、再現性のある結果をもたらす。タングステン針を作るためにプロパントーチを使用すると、非常に鋭い針が行われることを可能にする。それは炎の大きさを制御しますので、使用のトーチのタイプは大きな違いになります。電解鮮鋭化を使用することもできるが、この方法も、シャープな針の製造に接近しない。針がまっすぐに作ることができるように、代わりにスプールされたワイヤーのタングステン棒を使用してください。 シュペーマンマイクロピペット、時間がかかり、製造が困難で、組織の転送のための理想的な手段である間。ピペットは、異なる寸法の開口を使用してカスタマイズすることができ、繰り返し使用することができる。資料を使のための重要な要因GAシュペーマンのマイクロピペットは、胚の表面に先端に触れる前に、ピペットでいくつかの流体を持つことである。連絡先が胚の上、メニスカスで行われたとき、流体の中には、常に流出する。少しゆっくりと、振動板上にさせるがピペットにドナー移植組織を吸うのに対し、ダイヤフラム上に押すと、流体および移植組織が非常に正確に吐出することができるようになります。ダイヤフラムに正の圧力のビットを維持することは、転送中にピペットの先端にドナー移植組織を維持し、ダイアフラムにはほとんど追加の圧力は、ドナー移植片組織が意図的にホストに配置することを可能にする。 ストレージおよび滅菌中シュペーマンピペットの保護のため、ワイド端から電球を外し、慎重に球に先細りの先端を挿入します。アルミホイルで上部をカバーし、手術前にオートクレーブ、ガラス試験管にシュペーマンピペットを置きます。複数のピペットが再された後その後ADY手術のために再度滅菌する、ピペットを反転、蒸留水やガラス製品、洗剤の同じ溶液中でほぼ沸騰にそれらを加熱し、蒸留水で繰り返し洗浄してください。彼らの個々のチューブ内のオートクレーブピペット。彼らは暗く堅いなったときに、振動板とゴム球を形成しているゴム管は、いくつかの不妊手術後に交換またはする必要があります。 このプロトコルのコンポーネントの多くは、危険な装置を含む。たとえば、シュペーマンマイクロピペットを作るための手順は、3炎の種類だけでなく、暖房、引っ張って、切断、ガラスの研磨、曲げ、発泡を伴う。したがって、このようなゴーグルと白衣などの安全性を高める適切な個人用保護具（P​​PE）を着用してすることは非常に重要です。さらに、多くの人が卵を取り扱う際は、必ず手袋を使用し、苦しんで、または、卵アレルギーを開発する可能性を持っているので。これらの注意事項を念頭に置いて、ウズラ、アヒルキメラシステムISA、多くの将来のアプリケーションを持って、安全で効率的、かつ比較的アクセス可能なメソッド。

顔の骨格は、神経堤と外胚葉と内胚葉上皮層1月11日に囲まれた中胚葉間葉で構成された複数の顔のプロセスの成長と融合から開発しています。各プロセス内の形態形成のイベントは、間葉と周囲の上皮12月16日の間に明確なシグナル伝達相互作用によって支配される。これらのシグナル伝達の相互作用および/ ​​またはその下流のエフェクターへの変化は、疾患の表現型に寄与し、また、頭蓋顔面の骨格17、18の進化に関連する可能性がある。そのため、組織の相互作用のタイミングと性質を解明することは、顔の骨格の発達および進化生物学の我々の理解を高めるために大きな可能性を秘めている。 組織の相互作用を調査するキメラ胚の使用は発生生物学において長い歴史を持っています。このアプローチは、ハンス·シュペーマンと彼の研究室で開拓された誰が別の両生類の種の胚の間に組織を移植することによって、胚「主催者」を発見しました。シュペーマンは、手のスキル、特殊なツール、特にシュペーマンピペットの彼の開発によって補完されたマイクロ外科的技術のマスターだった。ヴィクトルハンバーガーはシュペーマンのノーベル賞につながったオリジナルの移植実験を行ったときである、1920年代フライブルクハンス·シュペーマンの実験室の大学院生だった。ハンバーガーは、1935年にセントルイスのワシントン大学に移動したとき、彼は実験発生学 19 の彼マニュアルシュペーマンのマイクロピペットを作製するプロセスを詳しく説明。ドリューNodenはマサチューセッツ州アマースト大学にして、コーネル大学に移動した後、Nodenが製造し、ウズラ、ニワトリキメラを含む彼の外科移植のためシュペーマンマイクロピペットを使用し続けた。1972年までワシントン大学ハンバーガーの研究室の大学院生だった。＆＃160;大学院生、著者の一人（リッチシュナイダー）は1995年から1998年コーネル大学ドリューNodenで訓練しながらシュペーマンマイクロピペットを作るための、以下のプロトコルはハンバーガーやNodenによって書かれた記述に基づいて作られ、その後の修正を含む。シュナイダーによる。 頭蓋顔面の開発の研究のため、特に神経堤細胞の貢献を理解するためのウズラ-ニワトリキメラの使用は、ル·Douarin ら 20に見直し、1970年代初頭にNodenにより、ルDouarinによって開拓された。このアプローチは、広く多くの研究で、多数の他の研究者1、4、5、21-38に採用されている。ウズラやヒヨコの成長と形態の同等のレートは、細胞の運命と系統追跡の研究のために、その中の移植に最適です。しかし、ウズラとニワトリの間の類似性、形態学的変化は、indはドナー細胞によってuced解読することは困難である。対照的に、他の鳥類キメラのシステムは、39から50胚は解剖学的に明確な確認メカニズムを研究するための方法として、国内アヒルが含まれている。具体的には、ウズラ、アヒルキメラシステムは、ホスト、およびその逆に、ドナーの影響を見分けるための複数の利点を提供します。まず、ウズラやアヒル胚の遺伝子発現（ 図1 AとB）の差動ドメインについてアッセイすることにより、パターン形成のドナーまたはホスト固有のメカニズムを探求するための直接的な方法を提供し、ボディサイズと形状で区別される。第二に、ウズラやアヒル胚はウズラが17日で孵化し、アヒルが28日で孵化して、成熟の大きく異なる速度を有する。移植された神経堤は、宿主環境内でその固有の成熟速度を維持し、従って、一時的な遺伝子発現の変化、組織の相互作用、組織形成および形態形成の同定が可能である51-57。最後に、抗核抗体ウズラ（PN¢Q）は、ドナーを可能にし、遍在ウズラ細胞において発現されるがアヒル細胞には存在しているタンパク質を認識することによって、互いに恒久的に区別する細胞の寄与をホストする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">1x PBS</td>
			<td style="width:180px;">TEK</td>
			<td style="width:145px;">TEKZR114</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Hank&#8217;s BSS w/o Phenol Red</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">14025-092</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Neutral Red</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">N4638-5G</td>
			<td style="width:252px;">.22&#181;m filter-sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">18G Needles</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">305195</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">5 ml syringe</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">309646</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">No. 5 Dumont forceps</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">11252-20</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Straight Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14028-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14029-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Spemann Pipet</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Hand-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Egg holder</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Glass ashtray and modeling clay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Alcohol burner</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">04-245-1</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Transparent tape</td>
			<td style="width:180px;">3M Scotch</td>
			<td style="width:145px;">600</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Glass Stirring Rod</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">11-380C</td>
			<td style="width:252px;">Tip is narrowed and rounded using a flame</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Tungston wire (.004 x 3 inches)</td>
			<td style="width:180px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:145px;">7190</td>
			<td style="width:252px;">Tip is flame-sharpened in a propane torch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bunsun burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S49117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;22-183-632</td>
			<td>9-inch (229 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:169px;">rubber tubing</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-178C</td>
			<td style="width:252px;">amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">&#160;Propane fuel cylinder</td>
			<td>BernzOmatic</td>
			<td>UL2317</td>
			<td style="width:252px;">&#160;TX-9 with torch style &#34;A&#34; with a screw-on brass &#34;pencil flame&#34; torch&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond point pencil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-268912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber bulbs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S32325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

キメラ胚の生成は細胞の運命、組織の相互作用、および組織学的および脊椎動物の胚の形態的発展に種特異的な貢献を研究する広範かつ強力なアプローチである。特に、キメラ胚を使用することは頭蓋顔面複合体の種特異的な形態を向けるのを神経堤の重要性を確立しています。ここに記載される方法は大きく異なる顎顔面形態と、2鳥類、アヒルやウズラを利用しています。この方法は、大幅に頭蓋顔面複合体における種特異的なパターンの分子と細胞制御の調査を容易にします。ウズラやアヒルキメラ胚での実験は、すでに神経堤媒介組織相互作用および頭蓋顔面の骨格、筋肉、そして外皮における種特異的なパターンを制御する細胞自律的な行動を明らかにした。神経堤誘導体の偉大な多様性は、大きな可能性を示唆している脊椎動物の発生、病気、そして進化を理解するためのウズラ、アヒルキメラシステムの将来のアプリケーションに最適です。

更なる分析の前に、移植の効率をアッセイする必要がある。組織については、形態学的、又は遺伝子発現は組織試料で解析し、ウズラ細胞が36記載のようにQ¢PN抗体を用いた免疫組織化学によって検出されるべきである。 RNA分析のため、関心のある組織に種特異的な寄与は、PCRベースの戦略58を用いて計算することができる。移植の有効性が検証された後、さらなる形態学的または分子アウトカム指標は、キメラで評価することができる。ドナー神経堤細胞および頭蓋顔面複合体の適切な組織発生と形態形成の基礎となる周囲の宿主由来の組織との間の相互作用は、以前に広く研究されている。具体的には、神経堤間充織は、顔の種特異的な形態7、13、51、59、フェザーパターン52、筋肉のパターン56に指示</s<html> &gt;アップ、および軟骨53、宿主遺伝子発現の調節を介して57。例えば、神経堤間充織は、時間的にBMP4の発現が55を調節することにより、下顎にあるとき、骨の形が決まる。 最近では、調査は非常に初期の頭蓋顔面の開発で発生する組織の相互作用を中心としています。この点に関して、ウズラ、アヒルキメラを利用する実験は、宿主胚は形態学的境界を決定することによって、神経堤遊走に影響を図示している。つまり、キメラquck胚では、ドナーウズラ神経堤細胞は、アヒルのようなパターン（ 図1D）のホストアヒル下顎アーチの中に移動、である。神経堤の人口の大きさに、このホストの貢献にもかかわらず、ドナー神経堤は、ウズラのような大きさと形状（ 図1E）にある下顎スケルトンを生成し続けています。 E 1 &quot;FO：コンテンツの幅=&quot; &quot;FO：SRC =&quot; 6インチ/ files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。ウズラ-ダックキメラシステム。生成するための（A）、ウズラおよび（B）のアヒル頭蓋骨の大きさや形状にかなりの違いが表示され、したがって、理想的には（TOKIA ら 56から変更）、頭蓋顔面の開発を研究するキメラシステムを使用するのに適している。（C）実験計画舞台をマッチさせたHH9.5ウズラとアヒル胚からの一方的なキメラ胚quck。神経フォールドはウズラ胚の片側から取り出し、神経倍の等価部分が除去された後のアヒル胚に移植される。（D）ウズラドナー細胞（緑色）、抗ウズラ抗体（Qを用いてキメラで追跡することができるHH12キメラ胚の腹側図に示されている。（F）HH38、ウズラのドナー由来メッケルでquck下顎のように）、PN¢7、S軟骨が大きく、湾曲している対側アヒル宿主由来メッケル軟骨のために観察されたものよりも短く、まっすぐです。復刻時田ら、開発。エルゼビアからの許可を得て、バイオ。306、377（2007）。

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Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

この記事では、頭蓋顔面の開発に神経堤および/または他の組織の種特異的な貢献をテストするために設計されたキメラ胚を生成する方法を説明します。

ウズラ·アヒルキメラを使用して顔面発展に種特異的な貢献を評価する

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K ビュー.  University of California at San Francisco. この記事では、頭蓋顔面の開発に神経堤および/または他の組織の種特異的な貢献をテストするために設計されたキメラ胚を生成する方法を説明します。 

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Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

マイクロ流体を使用した新規治療用途の開発

生物学

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

IVISスペクトラムを用いた乳腺腫瘍の in vivo生物発光イメージングに

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

組織標的胚キメラ：ゼブラフィッシュの原腸胚細胞移植

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

キメラの生成のためのメダカ胚および細胞移植のDechorionation

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

頭蓋顔面の開発時には外胚葉上皮のシグナリング特性を評価する

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

顔面間葉のエレクトロポレーション

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

しわコロニーの開発を使用したバイオフィルム形成を評価するための半定量的アプローチ

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

圧力筋運動記録法を用いたマウス抵抗動脈機能を評価

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

SOX10中の顔面の開発の可視化：楓トランスジェニックゼブラフィッシュラインタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...