Los autores desean agradecer a la señora Meike Schaffrinski por su siempre excelente asistencia técnica durante los últimos años. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación Alemana (DFG) dentro del grupo de investigación conjunta 942 (FOR942) y por el Programa de Investigación de la Facultad de Medicina de la Georg-August-Universität Göttingen.

1 Preparación de suero AB humano estéril <ol><li> Recoger 4-5 bolsas de plasma fresco congelado (FFP). Hasta que se hayan recogido las bolsas de las tiendas a -20 ° C suficientes bolsas. </li><li> Descongele las bolsas y se incuba durante 30 min a 56 ° C en un baño de agua para inactivar el complemento y eliminar la fibrina. </li><li> Desinfectar bien el exterior de las bolsas y transferir el plasma a tubos de 50 ml. </li><li> Se centrifuga a 3.000 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente para deshacerse de precipitados y plaquetas residuales. </li><li> Piscina todo sobrenadantes y deseche los pellets. </li><li> Muestras de suero alícuota en tubos de 15 ml y almacenar a -20 ° C. NOTA: Alternativamente, disponible comercialmente normal de suero AB humano inactivado por calor puede ser utilizado. </li></ol> 2. Aislamiento de monocitos Para facilitar el equilibrio de la centrífuga, se recomienda procesar dos capas leucocitarias en paralelo. Sin embargo, tomar cavolver a utilizar materiales separados para cada donante y no mezclar las células. En el caso de capas leucocitarias no se pueden obtener fácilmente, 400 ml de sangre periférica heparinizada se pueden utilizar en su lugar. <ol><li> Desinfectar con cuidado las bolsas de plástico que contienen las capas leucocitarias y transferir el contenido de cada capa leucocitaria de dos tubos de 50 ml. </li><li> Para cada capa leucocitaria llenar tres tubos de 50 ml con 15 ml de solución de Ficoll (1,077 g / ml). El Ficoll debe estar a temperatura ambiente para la preparación. </li><li> Capa de 30-35 ml de la capa leucocitaria de sangre en la parte superior de la solución de Ficoll para la primera gradiente de densidad. Tenga cuidado al hacer esto lentamente y con cuidado a fin de evitar que se mezclen ambas capas. </li><li> Centrifugar a 400 xg sin freno durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Para cada gradiente de recoger el anillo blanco de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) que está situado entre las dos fases con una pipeta Pasteur de plástico y la transferencia a un tubo de 50 ml. </li><li> Llenar cada tubo con PBS-EDTA (1 mM) hasta 40 ml en total. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 10 min sin freno a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante y lavar pellet de nuevo con 40 ml de PBS-EDTA (1 mM). </li><li> Para cada grupo de donantes los gránulos en 20 ml de RPMI-1640 sin rojo de fenol + 10% de FCS. </li><li> Preparar la solución de Percoll iso-osmótica para el segundo gradiente de densidad: Para dos donantes mezclan 23,13 ml de solución de Percoll (densidad: 1,131 g / ml) en un tubo de 50 ml con 1,87 ml de PBS 10 veces. A continuación, transferir 23 ml de esta solución a un nuevo tubo de 50 ml y añadir 27 ml de RPMI-1640 con rojo fenol + FCS al 10% para obtener una solución 46% de Percoll iso-osmótica. El Percoll debe estar a temperatura ambiente para la preparación. </li><li> Para cada donante de transferencia de 25 ml de la solución de Percoll preparada a un tubo de 50 ml y la capa de la solución de PBMC preparado en 2.9) en la parte superior de la solución de Percoll. Tenga cuidado al hacer esto muy lentamente unad cuidadosamente, ambas capas tienden a mezclarse fácilmente. Si se hace correctamente las dos fases se pueden distinguir debido a su diferencia en el color. </li><li> Centrifugar a 550 xg sin freno durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Para cada gradiente de recoger el anillo blanco de los monocitos que se encuentra entre las dos fases con una pipeta Pasteur de plástico y la transferencia a un tubo de 50 ml. </li><li> Llenar cada tubo con PBS-EDTA (1 mM) hasta 50 ml en total. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min sin freno a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos en 20 ml de RPMI-1640 con rojo fenol + 10% de FCS. </li></ol> 3. diferenciación de los monocitos a macrófagos <ol><li> Determinar el número de monocitos aislados en una dilución 1:10 en azul de tripano. Sólo contar las células grandes, a menudo de forma irregular-, que son los monocitos. No contar las células pequeñas, con forma redonda que son linfocitos. NOTA: Los números de monocitos no se han determinado con precisión demasiado porque sólo dan una pista acerca de cuántos y cuáles recubierto de teflón FEP bolsas (pequeños o grandes) tienen que ser utilizados para la diferenciación de las células. </li><li> Para 1,0-1,5 x 10 8 monocitos a partir de un donante, sembrar las células en una gran bolsa de cultivo celular recubierto de teflón FEP. Para cada bolsa de preparar el medio de cultivo que consiste en 174 ml de RPMI-1640, 2% de suero AB humano (como se ha preparado en la Sección 1), 1% de penicilina / estreptomicina, y 2,5 ng / ml de M-CSF (volumen total: 180 ml). <ol><li> Para 3,0-5,0 x 10 7 monocitos a partir de un donante, sembrar las células en una pequeña bolsa de cultivo celular recubierto de teflón. Para cada bolsa de preparar el medio de cultivo que consiste en 28,5 ml de RPMI-1640, 2% de suero AB humano (como se ha preparado en la Sección 1), 1% de penicilina / estreptomicina, y 2,5 ng / ml de M-CSF (volumen total: 30 ml). NOTA: Si por ejemplo, se obtienen 8,0 x 10 7 monocitos, se recomienda sembrar en two bolsas de menor volumen con 4,0 x 10 7 células cada uno. En lugar de M-CSF, monocitos, alternativamente, se pueden diferenciar con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) a la misma concentración (2,5 ng / ml). </li></ol></li><li> Añadir la suspensión celular (20 ml) al medio preparado y mezclar cuidadosamente. Si dos bolsas se preparan a partir de un donante, añadir 20 ml de RPMI-1640 a la suspensión celular y a continuación, añadir la mitad de la suspensión a cada preparación de medio. </li><li> Opcional: Para determinar si la preparación de los monocitos se ha mantenido estéril, al desgarro de una gota de la suspensión de células en una placa de agar sangre e incubar durante la noche a 37 ° C. </li><li> Apriete la vaina de un 50 ml PERFUSOR jeringa en el tapón de la bolsa de cultivo celular recubierto de teflón FEP y llenarlo con la suspensión celular preparada. </li><li> Desconecte la jeringa y empuje el aire que queda fuera de la bolsa. Cierre la bolsa con un cono de cierre. </li><li> Incubar las bolsas durante 6-7 días a 3776; C con 5% de CO 2. </li></ol> 4. macrófagos Harvest <ol><li> Coloque las bolsas recubiertas de Teflon FEP cultivo celular con los macrófagos diferenciados en hielo durante al menos 1 hora para facilitar el desprendimiento de las células (una incubación de hasta 3 horas es posible). Asegúrese de que toda la superficie de la bolsa está cubierto de hielo. </li><li> Tire de la bolsa con una presión mínima de 10x sobre el borde de una mesa / tabla. </li><li> Desinfectar cuidadosamente el exterior de la bolsa y retire el cono de cierre. </li><li> Apretar una jeringa de 50 ml en el enchufe de la bolsa, retire la suspensión de células, y la transfiere a tubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min a temperatura ambiente para de girar las células. </li><li> Aspirar el sobrenadante y poner en común las pastillas de una bolsa de 10 ml de RPMI-1640 + 10% FCS en total. </li><li> Determinar el número de células en un hemocitómetro (1: 4-1: 10 de dilución en azul de tripano). Sólo contar las grandes células redondas. NOTA: Después de la diferenciación de los macrófagos en las bolsas recubiertas con Teflon FEP, no puede haber células residuales, por ejemplo, linfocitos, dependiendo del donante y de la calidad del aislamiento de monocitos. </li><li> Para reutilizar las bolsas recubiertos con teflón FEP, lavar dos veces con etanol al 70% para eliminar las células residuales. Llene con 50 ml de etanol al 70% y se incuba durante la noche. Lavar las bolsas 3 veces con PBS estéril, se envuelven en papel de esterilización, y esterilizar en un autoclave utilizando procedimientos estándar. NOTA: Las bolsas de cultivo celular se pueden reutilizar varias veces sin ninguna pérdida en los rendimientos de los macrófagos. Sin embargo, decidimos desechar las bolsas después de 10 usos antes de que empiecen a gotear. </li><li> Para posteriores experimentos de cultivo de macrófagos en RPMI-1640 + 10% de FCS. Si se requieren menores concentraciones de suero, el cultivo en medio RPMI-1640 con 1% de FCS también es posible. Semillas y células Incubar durante 3-4 horas. Después de este período, tenga en cuenta que los macrófagos se adhieren a la superficie del cultivo celular plato mientrasningún células contaminantes (es decir eritrocitos, linfocitos y células dendríticas) permanecen en suspensión. Lavar las células al menos dos veces con PBS para eliminar las células no adherentes. </li><li> Para separar macrófagos cultivados a partir de la placa de cultivo de células para experimentos adicionales, raspar cuidadosamente de la superficie. Alternativamente, se incuban los platos durante 20 min en hielo, aspirar el medio de cultivo, y añadir tampón de disociación celular libre de enzimas 1 ml. Después de 5 min de incubación a 37 ° C, añadir 4 ml de PBS, y separar las células por pipeteo hacia arriba y hacia abajo durante al menos 3 min. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar que no existe conflicto de intereses.

Los macrófagos son importantes las células efectoras del sistema inmune innato y muestran funciones importantes en la inmunomodulación, la presentación de antígenos y la homeostasis del tejido. Debido a su notable plasticidad, que son capaces de responder a diferentes estímulos con los cambios de su fenotipo. Sin embargo, se obtienen hasta ahora una gran cantidad de datos con respecto a la polarización de los macrófagos en el sistema murino, aunque hay informes que muestran que sólo alrededor del 50% de los marcadores de polarización de macrófagos puede ser traducido directamente del ratón a humano 16. Por lo tanto, se presenta aquí un método para obtener los macrófagos humanos primarios en número y en pureza suficiente sin la necesidad de materiales costosos, por ejemplo, perlas magnéticas MACS o un dispositivo de elutriación centrífuga a contracorriente. Nuestro método se basa en el aislamiento de monocitos a partir de PBMCs y su posterior diferenciación a los macrófagos en FEP recubierto de teflón bolsas de cultivo celular en presencia de bajo concentrations de M-CSF 11-13. Mientras que los monocitos representan menos del 5 al 10% de los leucocitos de sangre periférica en los seres humanos, tras la estimulación que son reclutados a los sitios periféricos donde se diferencian a macrófagos tisulares residentes o células dendríticas 17. La citoquina M-CSF es importante para la supervivencia de monocitos y acciona su diferenciación a los macrófagos 18,19. Hasta el momento, las concentraciones de M-CSF que fueron elegidos para la diferenciación de los monocitos variaban hasta 100 ng / ml, sin embargo, en nuestro protocolo somos capaces de obtener un número suficiente de macrófagos maduros con una concentración de M-CSF de sólo 2,5 ng / ml 12 , 20. Además, las células se cultivan en bolsas recubiertas de Teflon FEP de cultivo celular que facilitan el desprendimiento de los macrófagos y su posterior siembra en el número de células definidas. Dado que las bolsas se pueden reutilizar varias veces, esto disminuye aún más los costes para el proceso de aislamiento. Los macrófagos obtenidos por este procedimientoson altamente positivos para CD45, CD14, CD11b, CD11c y mostrar expresión del CD206 receptor de manosa que argumenta a favor de una población de, macrófagos maduros puros 21,22. Especialmente alta expresión de CD14 es típico para los macrófagos diferenciados en presencia de M-CSF 23. Después de la siembra de las células, muestran una adhesión rápida a las superficies de plástico con algunas células que muestran una morfología típica de tipo huso, mientras que otros exhiben un fenotipo huevo frito. Esto está de acuerdo con las observaciones de otros autores 18,22,24. Se informó de que la diferenciación de monocitos en presencia de M-CSF conduce a macrófagos polarizadas-M2 16,25. Sin embargo, los macrófagos aislados por nuestro protocolo todavía son capaces de responder a una amplia gama de estímulos incluyendo la exposición a microvesículas derivados de células tumorales y co-cultivo con células tumorales 26,27 o la exposición a LPS a los que reaccionan con la inducción de pro genes inflamatorios tales como IL-1 y# 946 ;, TNFa, Wnt5a o varias metaloproteinasas de la matriz que se consideran típicos de macrófagos polarizadas-M1 3,5,28. En conclusión, el aislamiento de monocitos por doble centrifugación en gradiente de densidad y la posterior diferenciación hacia macrófagos en recubiertos con teflón FEP bolsas de cultivo celular resulta en un elevado número de macrófagos y sin la necesidad de procedimientos técnicamente difíciles o caros. Los macrófagos obtenidos pueden ser utilizados para el análisis posterior que van desde clásica a través de la activación de LPS a la co-cultivo con células tumorales.

Las células de la estirpe monocítica y sus derivados terminales diferenciadas - macrófagos - muestran una plasticidad notable en lo que respecta a su función biológica, con miras a su participación en procesos tan diversos como el desarrollo, la reparación de tejidos, y la inmunidad 1. Esto último se debe a su capacidad fagocítica y presentadora de antígeno que sitúa los macrófagos en la encrucijada entre la respuesta inmune innata y adaptativa 2. Sin embargo, su capacidad para secretar citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y otras moléculas de señalización 1 no sólo aumenta su función inmuno-moduladora sino que también sirve como base para sus funciones adicionales. Los intentos de reflejar estas diversas etapas de activación en el contexto de la no-microbianas condiciones mediadas han dado lugar a las categorías M1 y M2 3. Aunque esta clasificación no es completa, permite un conocimiento básico de la biología de los macrófagos. Debido a estas capacidades multifacéticas que no es ninguna sorpresa que los macrófagos están asociados con muchas condiciones que de alguna manera implican la remodelación tisular o inflamación. Junto a su papel fundamental en el reconocimiento y liquidación de los patógenos invasores 4-6, macrófagos han llegado cada vez más en el foco en la aterosclerosis, fibrosis, la obesidad y el cáncer de 7-10. Un método reproducible para la generación de macrófagos humanos es por lo tanto crucial para la comprensión de estas patologías. Aquí presentamos un método basado en el aislamiento de monocitos humanos de la sangre periférica de donantes sanos mediante una técnica de doble centrifugación en gradiente de densidad como se ha descrito anteriormente 11. Con el fin de facilitar la diferenciación hacia los macrófagos, las células monocíticas aislados se incuban en presencia de bajas concentraciones de M-CSF y suero humano normal 12. Para facilitar aún más el manejo y la cosecha celular, la diferenciación se lleva a cabo en el gas permeable FEPBolsas de cultivo celular recubiertos de teflón con una superficie hidrófoba 12-15. Los macrófagos en reposo resultantes pueden ser sometidos a una amplia gama de ensayos, ya que todavía son capaces de responder, ya sea en un modo M1 o M2-similares. Los métodos alternativos de aislamiento de monocitos y la posterior diferenciación tales como la clasificación de células activadas magnético (MACS) o elutriación centrífuga (CCE) tienen algunas limitaciones en cuanto al rendimiento, el coste y tiempo requerido. El protocolo descrito en el presente documento ofrece la ventaja de que puede llevarse a cabo con equipo de laboratorio estándar sin la necesidad de reactivos especiales (por ejemplo, perlas magnéticas MACS) o dispositivos (por ejemplo, aparatos CCE) y permite el procesamiento de grandes cantidades de células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

Los macrófagos humanos están implicados en una plétora de procesos patológicos que van desde enfermedades infecciosas al cáncer. Así que representan una herramienta valiosa para comprender los mecanismos subyacentes de estas enfermedades. Por lo tanto, se presenta un protocolo sencillo para el aislamiento de monocitos humanos a partir de capas leucocitarias, seguido de un procedimiento de diferenciación que resulta en altos rendimientos de los macrófagos. La técnica se basa principalmente en equipos de laboratorio comúnmente disponibles y por lo tanto proporciona una manera costo y tiempo efectivo para obtener grandes cantidades de macrófagos humanos. Brevemente, capas leucocitarias de donantes de sangre sanos se someten a una centrifugación en gradiente de densidad doble para cosechar los monocitos de la sangre periférica. Estos monocitos se cultivan a continuación en etileno propileno (FEP) recubiertos de teflón bolsas fluorados de cultivo de células en presencia de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). Los macrófagos diferenciados pueden ser cosechados y utilizados para estudios posteriores y funcional con la misma facilidaddice. Métodos importantes para el control de calidad y validación de las medidas de aislamiento y diferenciación se resaltarán en el protocolo. En resumen, el protocolo descrito aquí permite a los científicos para aislar de forma rutinaria y reproducible macrófagos humanos sin la necesidad de herramientas de coste intensivo. Por otra parte, los modelos de enfermedades se pueden estudiar en un sistema humano singénica eludir el uso de macrófagos murinos.

La primera centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll produce una interfase blanca que contiene las PBMC (Figura 1A) es decir, linfocitos y monocitos. Esto puede ser confirmado a través de una tinción de May-Gruenwald (Figuras 1B y C) de las células recogidas que muestra tanto una alta relación núcleo / citoplasma (típico de los linfocitos) y Bean o núcleos en forma de anillo (típico de los monocitos). Cuando estas células se cargaron en un gradiente de densidad utilizando Percoll segundos, los monocitos se pueden separar más lejos de los linfocitos y de nuevo aparecerá como una interfase blanca (Figuras 1D-F). Para cada capa leucocitaria de la centrifugación en gradiente de densidad doble descrito produce rutinariamente 150 ± 40 x 10 6 monocitos que pueden diferenciarse a 70 ± 30 x 10 6 macrófagos (Figura 2) por capa leucocitaria. El rendimiento medio de los macrófagos20 preparaciones independientes fue 47 ± 14% del total de monocitos aislados. Después de la centrifugación en gradiente de Percoll que aún puede haber algunas células no monocíticas residuales presentes en la preparación, que es dependiente de la donación de sangre, así como en la precisión del proceso de aislamiento. Sin embargo, después de la fase de diferenciación de 6-7 días, la preparación consiste principalmente en macrófagos maduros (Figura 3), que se puede enriquecer aún más debido a su adherencia a las superficies de plástico, una característica que no es compartida por las células contaminantes al azar (Figuras 4A y B). Una vez chapado, la mayoría de los macrófagos muestran una morfología clásica &quot;huevo frito&quot;, mientras que también hay células con un fenotipo extendido huso-como (Figuras 4C y D). Esto se refleja en su distribución F-actina dentro de los grupos de citoplasma y de adhesión. Las células diferenciadasse caracterizan por la expresión de CD45, CD14, CD16, CD206 (receptor de manosa), CD11b y CD11c que son marcadores típicos de macrófagos maduros (Figura 5). La presencia de CD11b argumenta en contra de una diferenciación predominantemente dendríticas que es apoyado por el hecho de que las células son negativas para el marcador de células dendríticas CD209 (DC-SIGN). Después del proceso de diferenciación de las células permanecen funcionalmente y metabólicamente activo durante aproximadamente 5-7 días (Figura 6), ya que puede ser visualizado por tinción con calceína AM y su capacidad para tomar hasta vesículas extracelulares se desprenden de las células tumorales. Además, las células todavía pueden ser activadas como se muestra por ejemplo, para la estimulación con lipopolisacárido (LPS), que resulta en la expresión de varios genes pro-inflamatorios (Figura 7). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ files / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1. Apariencia y composición de la PBMC- y monocitos-capa después de gradiente de densidad doble centrifugación. Fotografía que ilustra (A) la banda de PBMC después de la gradiente de Ficoll y (D) la fase de monocitos después de la centrifugación Percoll iso-osmótica. Tinciones May-Gruenwald de cytospin preparativos de la (B, C) ​​fracción PBMC y el restante (E, F) monocitos. Barra de escala = 200 micras en B y E, = 50 micras en C y F. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2. Rendimiento de los monocitos y los macrófagos. Conteos celulares representativos de monocitos y macrófagos aislados de 20 leucocitaria capa preparations. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. micrografías y mediciones de tamaño de celda de monocitos y macrófagos. Microscopía de contraste de fase de suspensión celular monocítica antes (A) y después (B) diferenciación de los macrófagos. Correspondiente histogramas de tamaño de celda de monocitos (C) y macrófagos (D). Barra de escala = 100 m. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4. Morfología y la organización del citoesqueleto de los macrófagos adherentes. Microscopía de contraste de fase de los macrófagos adherentes antes (A) y después (B) la eliminación de la falta de adherenT células. Tinción (C, D) faloidina-TRITC de actina filamentosa en macrófagos adherentes, no estimuladas. Barra de escala = 100 micras en AC, 20 micras de D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. inmunofenotipo de macrófagos diferenciados. Citometría de flujo de los macrófagos después de 6 días de diferenciación en bolsas de cultivo celular recubiertas con Teflon FEP (indicado en rojo). Los controles de isotipo correspondientes se muestran en gris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 6. Captación de microvesículas celulares tumorales por macrófagos. Micrografías de macrófagos adherentes después de la exposición a la etiqueta-PKH26 microvesículas derivadas de células tumorales (rojo fluorescente). Las imágenes se superpusieron a la correspondiente (A) campo claro o (B) tinción citosólica con la viabilidad de colorante calceína AM. Las barras de escala = 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Upregulation de IL-1 β, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7, y MT1-MMP después de Stimumento de macrófagos con LPS (100 ng / ml) durante 24 h. La expresión génica se midió mediante RT-PCR cuantitativa a partir de muestras de ARN total (A) y normalizado en HPRT1 y GNB2L1 expresión. Los valores que se muestran son los cambios veces en comparación con el control sin tratar (media ± desviación estándar, n = 5, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). TNFa e IL-6 en la inducción de la estimulación LPS se confirmó por ELISA (B) (media ± SD, * p &lt;0,05).

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Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

isolation-human-monocytes-double-gradient-centrifugation-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

69.3K vistas.  University Medical Center Göttingen.  Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores. 

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Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

La transfección altamente eficiente de humanos THP-1 macrófagos por Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Investigación

Inmunología e Infección

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro El desmontaje de virus de influenza A cápsides por centrifugación en gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila exterior vesículas de membrana: Aislamiento y análisis de su potencial pro-inflamatoria en los macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Imágenes en vivo de la actividad antifúngica por los neutrófilos humanos primarios y los monocitos en respuesta a las<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where immune cells reside and therefore contribute to mucosal immunity in the intestine. A complete understanding of how M cells differentiate in the intestine as well as the molecular mechanisms of antigen uptake by M cells is lacking. This is because M cells are a rare population of cells in the intestine and because in vitro models for M cells are not robust. The discovery of a self-renewing stem cell culture system of the intestine, termed enteroids, has provided new possibilities for culturing M cells. Enteroids are advantageous over standard cultured cell lines because they can be differentiated into several major cell types found in the intestine, including goblet cells, Paneth cells, enteroendocrine cells and enterocytes. The cytokine RANKL is essential in M cell development, and addition of RANKL and TNF-&#945; to culture media promotes a subset of cells from ileal enteroids to differentiate into M cells. The following protocol describes a method for the differentiation of M cells in a transwell epithelial polarized monolayer system of the intestine using human ileal enteroids. This method can be applied to the study of M cell development and function.

This protocol describes how to induce the differentiation of M cells in human stem cell-derived ileal monolayers and methods to assess their development.

Diferenciación inducida de células similares a células M en monocapas de enteroide ileal derivadas de células madre humanas

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

Aislamiento, transfección y cultivo de monocitos humanos primarios

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...